CN113773964B

CN113773964B - 枳壳内生真菌及其在拮抗真菌及降解真菌毒素中的应用

Info

Publication number: CN113773964B
Application number: CN202011480223.4A
Authority: CN
Inventors: 武爱波; 孙微; 刘娜; 余佃贞; 孙姝婷; 于松
Original assignee: Shanghai Institute of Nutrition and Health of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Nutrition and Health of CAS
Priority date: 2020-12-15
Filing date: 2020-12-15
Publication date: 2022-04-05
Anticipated expiration: 2040-12-15
Also published as: CN113773964A

Abstract

本发明提供了一种枳壳内生真菌及其在拮抗真菌及降解真菌毒素中的应用。本发明的菌株分离自枳壳的叶子，为植物内生真菌，其对一些植物病原真菌如镰孢菌具有优异的抑制作用，有着广泛的应用潜力。

Description

枳壳内生真菌及其在拮抗真菌及降解真菌毒素中的应用

技术领域

本发明属于生物技术和微生物领域，更具体地，本发明涉及一种枳壳内生真菌及其在拮抗真菌及降解真菌毒素中的应用。本发明同时涉及该枳壳内生真菌的分离、存化及鉴定。

背景技术

枳壳是江西道地药材，来源于芸香科(Rutaceae)、柑橘属(Citrus)、酸橙Citrusaurantium L.栽培变种的干燥未成熟的果实，外果皮棕褐色至褐色。气清香，味苦、微酸。具有理气宽中，行滞消胀的功效，用于胸胁气滞、胀满疼痛、食积不化、痰饮内停、脏器下垂等症状(中国药典2020年版，一部，2020:257)。在有些情况中，植物内生菌能够产生和植物宿主细胞相同或者类似的生物活性物质。

真菌是一类有细胞壁、不含叶绿素、以腐生或寄生方式生存、能进行有性或无性繁殖的微生物。自然界中的真菌分布十分广泛，并可作为食品中正常菌相的一部分用来加工食品，但在特定情况下又可造成食品腐败变质。有些真菌本身就是病原体，能够引发人类或动物体的疾病，一些真菌的代谢产物(真菌毒素)也对人及动物造成危害。真菌毒素也是农产品的主要污染物之一，食用到含有此类污染物的人畜可发生急、慢性真菌毒素中毒症。被真菌毒素污染最为严重的农产品是玉米、花生、小麦。因此，真菌及真菌毒素与人类健康的关系正在引起越来越多的关注。

作为真菌毒素的一类，镰刀菌毒素是由镰刀菌产生的次级代谢产物，主要分布于气候温暖、湿润的温带地区。在中国，赤霉病发生最严重的区域是长江中下游麦区，华南麦区、东北三江平原春麦区等，受镰刀菌毒素污染的饲料和食物进入人体会导致人类的免疫力下降、甲状腺功能减退、恶心和腹痛，并导致动物拒食、呕吐、繁殖障碍等。

因此，有效、安全去除谷物中的真菌毒素污染，对粮食安全和食品安全有双重重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供枳壳内生真菌拮抗多种镰孢菌和降解真菌毒素及应用。

在本发明的第一方面，提供一种经分离的真菌，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.21441。

在本发明的另一方面，提供所述的真菌的细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物，其具有选自下组的特性：抑制镰孢菌(Fusarium)；和/或，降解真菌毒素。

在一个优选例中，该菌株为枳壳内生真菌。

在另一优选例中，该菌株的ITS4、ITS5序列拼接得到包括SEQ ID NO:1的序列。

在另一优选例中，该菌株的LROR、LR5序列拼接得到包括SEQ ID NO:2的序列。

在本发明的另一方面，提供所述的真菌、其细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物的应用，用于：抑制镰孢菌(Fusarium)，或制备抑制镰孢菌的组合物。

在本发明的另一方面，提供所述的真菌、其细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物的应用，用于：降解真菌毒素，或制备降解真菌毒素的组合物。

在一个优选例中，所述的镰孢菌包括选自下组：禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)，串珠镰孢菌(Fusarium verticillioides)，拟枝孢镰孢菌(Fusariumsporotrichioides)。

在另一优选例中，所述的真菌毒素包括选自下组：脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)，玉米赤霉烯酮(ZEN)，T-2毒素，伏马毒素；较佳地，所述伏马毒素包括选自：伏马毒素B1(FB1)、伏马毒素B2(FB2)、伏马毒素B3(FB3)。

在本发明的另一方面，提供一种用于抑制镰孢菌和/或降解真菌毒素的组合物，其包含选自下组的成分：所述的真菌；或，所述真菌的细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物。

在一个优选例中，所述的组合物包括但不限于：食品组合物、农药学组合物、饲料组合物、医药组合物、保健品组合物等。

在本发明的另一方面，提供一种抑制镰孢菌和/或降解真菌毒素的方法，包括：应用所述的真菌，或其细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物对需要抑制或降解的对象(包括抑制镰孢菌和/或降解真菌毒素)进行处理。

在本发明的另一方面，提供一种用于抑制镰孢菌和/或降解真菌毒素的试剂盒(包括药盒)，其包含：本发明所述的真菌；本发明所述的真菌的细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物；和/或本发明所述的用于抑制镰孢菌和/或降解真菌毒素的组合物。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、枳壳内生真菌Biscogniauxia aurantium在培养基上的菌落形态；a.枳壳内生真菌Biscogniauxia aurantium在PDA培养基上，25℃培养20天菌落形态；b.菌株溢出物。

图2、a-b为枳壳内生真菌Biscogniauxia aurantium在PDA培养基上溢出物微观形态。

图3、枳壳内生真菌Biscogniauxia aurantium构建的系统发育树图。基于ITS和LSU构建的系统发育树，Graphostroma platystomaCBS 270.87作为外群；RaxML的最大似然(Maximum Likehood，ML)分析的自展支持率>75％标注在分支上(RaxML)，贝叶斯验概率(Bayesian posterior probabilities，BI)(>95％)用加粗的分枝来表示，新种用粗体标注。

图4、枳壳内生真菌Biscogniauxia aurantium在25℃条件下与串珠镰孢菌(Fusarium verticillioides)对峙培养7天菌落形态；a.串珠镰孢菌单独培养的菌落形态，b.串珠镰孢菌与Biscogniauxia aurantium对峙培养形态(左侧为串珠镰孢菌、右侧为Biscogniauxia aurantium)。

图5、枳壳内生真菌Biscogniauxia aurantium在25℃条件下与拟枝孢镰孢菌(Fusarium sporotrichioides)对峙培养7天菌落形态；a.单独培养的拟枝孢镰孢菌菌落形态，b.拟枝孢镰孢菌与对峙培养形态(左侧为拟枝孢镰孢菌、右侧为Biscogniauxiaaurantium)。

图6、枳壳内生真菌Biscogniauxia aurantium在25℃条件下禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)对峙培养7天菌落形态；a.单独培养的禾谷镰孢菌菌落形态，b.禾谷镰孢菌与Biscogniauxia aurantium对峙培养形态(左侧为禾谷镰孢菌、右侧为Biscogniauxia aurantium)。

图7、禾谷镰孢菌(F.graminearum)与对峙培养的两个菌株DON浓度的变化。

图8、禾谷镰孢菌(F.graminearum)与对峙培养的两个菌株Zen浓度的变化。

图9、拟枝孢镰孢菌(Fusarium sporotrichioides)与对峙培养的两个菌株T2(T-2)浓度的变化。

图10、串珠镰孢菌(Fusarium verticillioides)与对峙培养的两个菌株FB1浓度的变化。

图11、串珠镰孢菌(Fusarium verticillioides)与对峙培养的两个菌株FB2浓度的变化。

图12、串珠镰孢菌(Fusarium verticillioides)与对峙培养的两个菌株FB3浓度的变化。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究筛选，获得了一株新型的菌株，称为枳壳内生真菌(Biscogniauxia aurantium)，保藏号为CGMCC No.21441。本发明的菌株分离自枳壳的叶子，为植物内生真菌，其对一些植物病原真菌如镰孢菌具有优异的抑制作用。

术语

如本文所用，术语“本发明的真菌”、“枳壳内生真菌Biscogniauxia sp.”、“枳壳内生真菌(Biscogniauxia aurantium)”，“Biscogniauxia aurantium”、“Biscogniauxiasp.”可互换使用，都指保藏号为CGMCC No.21441的真菌菌株。

如本文所用，术语“病原微生物”是指所述的有害微生物，所述有害微生物包括各种菌如细菌、真菌或放线菌等；本发明的优选方式中，所述的病原微生物为真菌，更优选地为镰孢菌(Fusarium)。

本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。

如本文所用，“工业学上可接受的载体”或“微生物学上可接受的载体”是用于将本发明的枳壳内生真菌Biscogniauxia aurantium或细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物传送给需要处理的对象的，在毒性、副作用方面可控的、环境友好或对人畜无害的溶剂、悬浮剂或赋形剂。所述载体可以是液体或固体，较佳的是能够较高程度保持枳壳内生真菌Biscogniauxia aurantium或细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物的活性的载体。

枳壳内生真菌及其应用

本发明的真菌菌株从芸香科柑橘属酸橙Citrus aurantium L.叶子中采用植物内生真菌分离纯化技术分离获得，是本发明人经过广泛筛选后获得的，经形态和系统发育学分析鉴定为一个新的物种，分类命名为：Biscogniauxia aurantium，保藏号为CGMCCNo.21441。

本发明的真菌菌株的分类学地位为：真菌界(Fungi)，子囊菌门(Ascomycota)，盘菌亚门(Pezizomycotina)，粪壳菌纲(Sordariomycetes)，炭角菌亚纲(Xylariomycetidae)，炭角菌目(Xylariales)，Graphostromataceae，Biscogniauxia。

系统发育学分析表明，来自枳壳叶子的1个Biscogniauxia属菌株，聚集在1个分枝上且具有良好的自展支持率和后验概率支持，代表了Biscogniauxia属的1个新种。

本发明对所述的真菌菌株进行鉴定：该菌株的ITS4、ITS5序列拼接得到包括SEQID NO:1的序列；和/或，该菌株的LROR、LR5序列拼接得到包括SEQ ID NO:2的序列。基于这种特定的序列，可以筛选鉴定出本发明菌株。同时，这种不同也可证明该菌株具有其自己的特异特征。

本发明人的研究结果显示，本发明的枳壳内生真菌Biscogniauxia aurantium，其对多种镰孢菌，如小麦麦腐病病原菌禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum，来自小麦穗腐病的籽粒)、玉米等经济作物致病菌串珠镰孢菌(Fusarium verticillioides，来自玉米穗腐病的穗头)和辣椒等经济作物致病菌拟枝孢镰孢菌(Fusarium sporotrichioides，来自辣椒软腐病的果肉)具有拮抗作用，从而抑制镰孢菌毒素的产生。

本发明的菌株是活体细胞，一旦获得了本发明的菌株，就可以用接种传代、再生等手段来大批量地获得本发明的菌株。这通常是将其接种到固体平板培养基或液体培养基中进行菌株的扩大培养而获得本发明的活体细胞。而获得的活体细胞可进一步进行实验室驯化、遗传育种和分子遗传操作等来获得突变体和转化子。此外，也可利用本发明的菌株作为异源表达的生物工程宿主细胞。

本发明中，除了包括本发明人分离获得的天然的枳壳内生真菌Biscogniauxiaaurantium菌株，还包括其变体、驯化菌株或基因工程改造菌株。所述的变体是同功能/功能提升的变体；较佳地，所述同功能/功能提升的变体包括具有抑制镰孢菌或降解其毒素的作用。

所述变体可以是对所述菌株进行诱变形成的变体。菌株的诱变育种是指用物理、化学因素诱导动植物的遗传特性发生变异，再从变异群体中选择符合人们某种要求的单株/个体，进而培育成新的品种或种质的育种方法。在关注本发明的菌株的主要活性的基础上，可以通过诱变来筛选获得抑制镰孢菌或降解其毒素更强的枳壳内生真菌Biscogniauxia aurantium变种；或者，也可通过诱变来筛选抑制镰孢菌或降解其毒素能力保持不变，但是生长性能更为优异、环境兼容性更为理想(如在发生一些毒副作用时，通过诱变来进行改造)、抗逆境能力更为显著的菌株。

可运用本领域技术人员已知的一些诱变方法来进行诱变，例如包括：出发菌株培养，诱变处理，针对大量菌落的观测、感兴趣性能的比较，最后筛选出感兴趣的性能得以提升和改造的菌株。这种诱变通常可以以高通量的方式进行，较佳地还可以重复进行多次或多代。

菌株的驯化不同于菌株的变异，其一般是指通过人工措施使微生物逐步适应某一条件而定向选育微生物的方法。其一般包括步骤：出发菌株培养并伴随着多种条件/实验参数的改变，针对大量菌落的观测、感兴趣性能的比较，最后分选出感兴趣的性能得以提升和改造的菌株/菌群。通过驯化可以取得具有较高耐受力及活动能力的菌株。菌株的驯化一般需要二次或多次传代，以使得菌株适应某种条件或发生感兴趣性能的改善。

在本发明的天然菌株基础上进行生物工程/基因工程改造的菌株也被包含在本发明中。例如，可以在本发明的菌株中，进行外源基因的引入以及内院基因的缺失/敲除，其改造的基本条件是使得本发明菌株保留其抑制镰孢菌或降解其毒素能力。其改造的目的可以包括：使得本发明菌株的在需要抑制的对象表面的定植能力提升，或使得本发明菌株在保留其抑制镰孢菌或降解其毒素能力的基础上，还进一步产生其他的至少一种优异性能：例如生长性能更为优异，环境兼容性更为理想(如在发生一些毒副作用时，通过基因改造来消除)，抗逆境能力更为显著。一些常见的菌株改造工作中，可以通过分析菌株内的代谢流/信号通路，来对某一或某几种代谢流/信号通路进行增强/减弱，从而使得菌株性能得以进一步优化。

外源基因的引入以及内源基因的缺失/敲除的方法是本领域已知的，例如利用一些病毒构建体/载体或非病毒构建体/载体，使之携带需引入的外源基因(包括用于过表达的外源基因，用于基因敲除的外源基因，用于基因编辑的外源基因)的表达盒，将该构建体/载体引入到菌株内，对菌株进行靶向性改造。所述的外源基因可以包括但不限于：功能基因，酶基因，结构基因，miRNA，siRNA，shRNA，等等。

此外，也可通过在菌株中直接引入外源的蛋白来进行菌株的改造，例如利用本领域已知的一些穿膜肽，可以实现将外源的蛋白直接引入到菌株内。

在本发明中已清楚地解释了本发明所述的真菌、其生物学特征、其功能及其培养方法的基础上，大量培养本发明所述的真菌，获取其培养物、代谢产物的方法是本技术领域技术人员所熟悉的。也即，由这些方式获得的枳壳内生真菌的其培养物或代谢产物，以及含有它们的组合物或它们的应用也被包含在本发明中。

适用于培养本发明所述的枳壳内生真菌的培养基可以是多种多样的，应理解，只要能够为所述枳壳内生真菌提供生长和繁殖所必须的营养成分(如包括碳源、氮源等)的培养基都是可被涵盖在本发明中的。所述的培养基可以是固体的或液体的；所述的培养基可以是商品化的或实验室配制的，比如可以采用PDA培养基。现有技术中用于培养其它各种真菌的培养基可能会适用于本发明所述的枳壳内生真菌的培养。

细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物及其应用

在获得了所述的枳壳内生真菌的基础上，本发明还提供了所述的枳壳内生真菌的细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物，其具有选自下组的特性：抑制镰孢菌；和/或，降解真菌毒素。

在获得了本发明的菌株后，本领域技术人员可以方便地获得其培养培养物，例如可参考本发明具体实施例中提供的一些培养基或培养工艺、或利用与本发明的实施例中存在适当改变但也能获得培养物的培养基或培养工艺，从而获得细胞培养物。所述的细胞培养物中含有活性菌株或由其分泌的物质，从而具有抑制镰孢菌或降解其毒素的活能力。

所述的细胞代谢产物，是本发明的菌株在培养过程中产生或分泌的一类物质，其可以是由细胞直接分泌到培养基中，或者经过一定处理后被与细胞分离。所述的细胞产物可被分离、纯化或浓缩。

所述的细胞培养上清，是在培养本发明的菌株的过程或培养结束后，去除细胞以及固体杂质后，剩余的培养液，其可以是未经浓缩或浓缩的。通常，细胞以及固体杂质可以通过诸如离心、过滤等方式被排除。

所述的细胞裂解产物，是在培养本发明的菌株的过程或培养结束后，利用裂解细胞的试剂来裂解细胞，从而构成的混合物。所述的细胞裂解产物可以是在裂解后去除了固体杂质后的产物。根据需要，其可以是经纯化的或经浓缩的产物。

应用及生产工艺

本发明还提供了本发明所述的枳壳内生真菌的应用，用于抑制镰孢菌或降解其毒素，或用于制备所述的细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物，后者可用于抑制病原微生物镰孢菌或降解毒素，或用于制备具有抑制病原微生物镰孢菌或降解毒素。

为了更好地应用本发明所述的枳壳内生真菌进行抑制或降解，还可优化其培养或生产工艺，考虑的范围可以包括各种培养条件优化、培养基的各种组分优化等。可通过确定一些对于该菌株的培养以及抑制或降解作用具有较大影响的因素。应理解，这些改进方式也应被涵盖在本发明中。

本发明的菌株可以实现长期生长和稳定传代。应用于培养本发明的菌株的培养基和培养方法并不限于本发明披露的那些，其它常规应用于培养真菌的培养基和培养方法也可以应用于本发明中。可以理解的是，在本发明提供的实施例的基础尚，各种培养基组分可能可被功能类似的其它组分替换，在不同的情形下也可根据特定菌株的特性适当添加其它组分或去除其中的部分组分或改变其中部分组分的含量。

本发明所述的培养体系或发酵体系可以进行体系放大以进行工业生产，根据体系的大小不同，本领域技术人员根据所掌握的一般知识可以进行适当的调整以有利于菌株的生长或生产。

本发明也提供了一种抑制病原微生物镰孢菌或降解毒素的方法，包括以本发明的枳壳内生真菌或其细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物对需要抑制的对象进行处理。

本发明的真菌菌株，抑制病原微生物镰孢菌或降解毒素的作用非常显著，抑制率高于90％，有着广泛的工业应用潜力。

天然形式的本发明的真菌菌株为一种植物内生真菌，为天然生物材料，本发明为拮抗植物病原真菌及真菌毒素的防控提供了新的材料。

组合物

本发明还提供了一种组合物，其包含本发明所述的枳壳内生真菌。或者，所述组合物包括所述的细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物。所述的组合物包括但不限于：医药组合物、保健品组合物、食品组合物、农药学组合物、饲料组合物等。

除了本发明的枳壳内生真菌或所述的细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物，所述的组合物中还可包括：工业学上可接受的载体，或微生物学上可接受的载体。

通常，本发明的枳壳内生真菌或所述的细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物的有效剂量可随施用的模式或待处理对象的情况而变化。在本发明中，“有效量”是指可对需要处理的对象产生功能或活性的且可被需要处理的对象所接受的量，一般为在毒性、副作用方面可控的、环境友好或对人畜无害的量。

所述组合物的剂型可以是多种多样的，包括但不限于：冻干剂，可湿粉剂，可乳化浓缩物，水溶液，乳液，可喷洒溶液，油性或水性分散系，悬浮剂，粉剂，颗粒剂，或微胶囊。应理解，只要能够将本发明所述的组合物在保持全部或部分活性的前提递下送到所需处理的对象的剂型都是可取的。优选那些易于递送的剂型，如溶液、液体喷洒剂、或喷雾剂。

在本发明中，所述的农业学上可接受的载体还可包括辅剂。所述的辅剂是一种辅助成分，在组合物中起辅助调节功能，比如其可以是一种表面活性剂、附着助剂或其它类型助剂。

浓缩型的组合物中活性成分的含量较高，如20-90wt％，而稀释型组合物和实际使用的组合物中活性成分含量较低，通常为0.00005-0.5wt％。此外，还可以包含其他合适的化学剂、增效剂、微量元素、稳定剂、粘合剂、润湿剂、分散剂、乳化剂、渗透剂、溶剂、充填剂等常用组分。本发明组合物中还可以含有其它活性成分，如杀虫剂、杀细菌剂。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、枳壳内生真菌的分离、纯化、鉴定和保藏

1、枳壳内生真菌的分离、纯化

枳壳内生真菌的分离方法：对枳壳的叶片用无菌水冲洗，用无菌滤纸吸干水分，切成0.5cm×0.5cm的组织块，将组织块按以下程序进行表面消毒：在超净台内准备75％酒精30秒；5％次氯酸钠溶液消毒1分钟；无菌水冲洗30秒，无菌滤纸吸干水分，将消毒好的组织块置于含有双抗(100mg/L氨苄青霉素，100mg/L链霉素)的PDA培养基(马铃薯葡萄糖培养基，土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂18g/L)上，25℃培养。每天观察样品真菌生长的情况。5到7天后有菌丝长出，挑取菌丝转移到PDA培养基上纯化培养，得到纯的真菌菌株。

2、枳壳内生真菌的鉴定

(1)枳壳内生真菌形态学鉴定

菌落在7天直径达到75～80mm直径，成羊毛状菌丝，气生菌丝丰富；菌落棉花状到羊毛状，后期菌丝白色到浅黄棕色。黄色分泌物出现在3周内，后期由深黄色到红棕色(图1、图2)。

(2)分子生物学鉴定及系统发育学分析

真菌基因组的提取：采样的CTAB法提取的真菌基因组。

ITS、LSU基因片段的扩增及测序：PCR扩增引物和测序引物间表1(ITS基因的测序引物与扩增引物相同)，PCR反应体系和反应条件分别见表2。反应结束后取5μl扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，紫外凝胶成像系统拍照、分析，测序仪对扩增产物进行测序。

表1、PCR扩增引物和测序

引物	序列(5’-3’)	扩增区域
			ITS5	GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG(SEQ ID NO:3)	ITS
ITS4	TCCTCCGCTTATTGATATGC(SEQ ID NO:4)
			LR5	TCCTGAGGGAAACTTCG(SEQ ID NO:5)	LSU
LROR	GTACCCGCTGAACTTAAGC(SEQ ID NO:6)

表2、PCR反应体系及条件

3)序列比对和系统发育分析

利用ClustalX程序和Bioedit等软件对序列进行编辑分析。

用引物ITS4、ITS5序列拼接后得到的序列如SEQ ID NO:1所示。

用引物LR5、LROR序列拼接后得到的序列如SEQ ID NO:2所示。

对扩增出来的序列以及对比序列进行比对，分子系统发育树构建采用最大似然法(Maximum likelihood，ML)法和贝叶斯(Bayesian analysis，BI)法。利用RAxML v.7.0.3进行ML分析，运算模型为GTRGAMMA，分支的支持率>70％时为显著支持。贝叶斯分析中，首先进行进化模型的筛选。进化模型由MrModestestv.2.3执行，根据计算得出的进化模型执行程序MrBayes v.3.1.2，马尔科夫链取样代数为100计算1000000代，弃掉前1000代，由剩余的9000课树生成一致树，并计算每个分支为单系的后验概率(Posterior probabilities)，分支支持率>95％为显著支持。

本发明采用多位点序列对比分析来构建系统发育树，采用外群Graphostromaplatystoma CBS 270.87。Biscogniauxia属对比结果共由1559个位点组成(ITS包括662个位点，LSU包括896个位点)，得到1367有效信息位点。通过最大似然法和贝叶斯法构建Biscogniauxia属的系统发育树。最大简约法采用的最合适的模型是GTRGAMMA。贝叶斯方法中，MrModeltest选取最合适的模型，LSU最合适的模型是GTR+I和ITS最合适的模型是HKY+G。最大简约法分析与贝叶斯分析所得到的系统发育树的拓扑结构相似，本发明使用最大简约法得到的系统发育树，将最大简约法得到的各分支的可靠性值(ML)和贝叶斯法计算得到的分支的后验概率值(BP)标注在每一个分枝上。

系统发育学分析表明，来自枳壳叶子的1个Biscogniauxia属菌株，聚集在1个分枝上且具有良好的自展支持率和后验概率支持，代表了Biscogniauxia属的1个新种，包括Biscogniauxia aurantium(ML/BP＝71％/0.99)(图3)。根据DNA序列构建的系统发育树，新种在一个新的分支上，本发明人将之鉴定为一个新种。

序列信息：

ITS4、ITS5序列拼接后得到的序列如SEQ ID NO:1：AACTCCAAACCCATGTGAACTTACCTATTGTTGCCTCGGCAGGCTGTGTGTGCTATATGATATGGGAAGCTACCCTGCAGCTACCTACCCTAAATAGGAGTTACCCTGGAGTGGAGTCTGATGACTTGCACGCTGGAGAGAAGCCACCTTAGGGCCTGGAAAGCCGTTTACAGATGAGCACCGATCTAATAGCATGCTAAAAAGCCTGCCGAAGGACCACTAAACTCTGTTTTATACTGTATCTCTGAGTAAATTATACAAATAAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCTAATAGTATTCTGTTAGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCCCAAGCCCTATTTGCTTGACGTTGGGAGCTTACAGCTGCTGTAACTCCTTAAATTTAGTGGCGGAGCCAGGTCATGCTCTGAGCGTAGTAATTCTTTTTTTCTCGCTCCTGATGCTGGCTTGTATCCTGCCGTAAAACCCCCTAAATTTTATTCTGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAA

LROR、LR5序列拼接后得到的序列如SEQ ID NO:2：ATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCCTAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAACAGCTCAAATTTGAAATCTGGCTTCCGGGTCCGAATTGTAATTTGCAGAGGATGCTTTTGGCGAGGTGCCTTCCGAGTTCCCTGGAACGGGACGCCTTAGAGGGTGAGAGCCCCGTACGGTTGGACACTAAGCCTCTGTAAAGCTCCTTCGACGAGTCGAGTAGTTTGGGAATGCTGCTCTAAATGGGAGGTAAATTTCTTCTAAAGCTAAATACCGGCCAGAGACCGATAGCGCACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGGGTTAAATAGCACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGCGTTTACGGCCAGACCTTTTCCTAGCGGATCATCTGGTGTTCTCACCGGTGCACTTCGCTAGGTTTAGGCCAGCATCGGCTTCTGTAGAGGGATAAAAGCAGTGGGAAAGTAGCTCTCTCGGGAGTGTTATAGCCCTAAGCATAATACCTTTACGGGGGCCGAGGACCGCGCTTTTGCAAGGATGCTGGCGTAATGGTCGTCAACGACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGTCGAACATTTGTGCGAGTGTTTGGGTGTTAAACCCTCACGCGTAATGAAAGTGAACGGAGGTGAGAGCCCTTTACGGGGTGCATCATCGACCGATCCTGATGTCTTCGGATGGATTTGAGTAGGAGCATTAATGTTCGGACCCGAAAGATGGTGAACTATGCGTGGATAGGGTGAAGCCAGAGGAAACTCTGGTGGAGGCTCGCAGCGGTTCTGACGTGCAAATCGATCGTCAAATCTGCGC

实施例2、对峙培养法鉴定本发明菌株的抑菌活性

在PDA培养基上活化培养本发明分离获得的枳壳内生真菌Biscogniauxiaaurantium与3种镰孢菌：

小麦麦腐病病原菌禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)：来自小麦穗腐病的籽粒；

串珠镰孢菌(Fusarium verticillioides)，为玉米等经济作物致病菌，来自玉米穗腐病的穗头；

拟枝孢镰孢菌(Fusariumsporotrichioides)，为辣椒等经济作物致病菌，来自辣椒软腐病的果肉。

实验中，本发明人分别在菌落边缘取直径5mm的菌块，在直经线上距两侧60mm的对称位置分别接种Biscogniauxia aurantium和镰孢菌，同时只接种镰孢菌作为空白对照，每个处理设置3次重复，25℃恒温培养。测量目标菌的对照生长量(菌落半径)和处理生长量(接种Biscogniauxia aurantium后的抑制生长半径)，计算抑菌率：

抑菌率(％)＝(对照生长量处理生长量)/对照生长量×100％。

进行连续7天的培养观察可发现，枳壳内生真菌Biscogniauxia aurantium具有很强的生境竞争能力，能迅速抢占有限的空间和营养，覆盖植物病菌生长并在植物病的菌丝，导致其死亡(图4、图5、图6)。

Biscogniauxia aurantium对3种链孢菌的离体抑菌率如表3。

表3

实施例3、本发明菌株的DON毒素降解能力

禾谷镰孢菌与对峙培养的菌株降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)毒素的测定。把获得枳壳内生真菌Biscogniauxia aurantium与禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)接种在PDA培养基上，25℃共培养10天；禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)接种到PDA培养基上培养10天；每个样品三个重复。烘干10天的菌落，用组织研磨机磨碎，分装在离心管中称重，取0.5g干重的菌丝加10ml乙腈/水(84/16，v/v)并剧烈震荡40分钟，超声40分钟，离心10分钟(4000rbp/min)；取2mL上清、氮气吹30到45分钟，加热45℃；氮气吹干加入1ml乙腈：水(16：84，v/v)复溶，0.22μm有机相滤器过滤，基于液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)定量分析DON毒素的含量。

结果显示，枳壳内生真菌Biscogniauxia aurantium具有强拮抗禾谷镰孢菌及降解DON毒素的能力，禾谷镰孢菌对峙Biscogniauxia aurantium培养10天产生的DON毒素4.98μg/ml降低为0.31μg/ml，降解率达到93.9％(图7)。

实施例4、本发明菌株的ZEN毒素降解能力

禾谷镰孢菌与对峙培养的菌株降解玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)毒素的测定。把获得枳壳内生真菌Biscogniauxia aurantium与禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)接种在PDA培养基上25℃共培养10天；禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)接种到PDA培养基上培养10天；每个样品三个重复。烘干10天的菌落，用组织研磨机磨碎，分装在离心管中称重，取0.5g干重的菌丝加10ml乙腈/水/甲酸(84/15.9/0.1，v/v/v)溶液。混合震荡10分钟，超声45分钟，离心30分钟(4000rbp/min)；取2mL上清、氮气吹30到45分钟，加热45℃；氮气吹干加入1ml甲醇：水(1：1，v/v)复溶，0.22μm有机相滤器过滤，基于液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)定量分析ZEN毒素的含量。

结果显示，枳壳内生真菌Biscogniauxia aurantium具有强拮抗禾谷镰孢菌及降解ZEN毒素的能力，禾谷镰孢菌对峙Biscogniauxia aurantium培养10天产生的ZEN毒素4.99μg/ml降低为0.402μg/ml，降解率达到91.9％(图8)。

实施例5、本发明菌株的T-2毒素降解能力

拟枝孢镰刀菌(Fusarium sporotrichioides)与对峙培养的菌株降解T-2毒素(T-2Mycotoxin)的测定。把获得枳壳内生真菌Biscogniauxia aurantium与拟枝孢镰刀菌(Fusarium sporotrichioides)接种在PDA培养基上25℃共培养10天；拟枝孢镰刀菌(Fusarium sporotrichioides)接种到PDA培养基上培养10天；每个样品三个重复。烘干10天的菌落，用组织研磨机磨碎，分装在离心管中称重，取0.5g干重的菌丝加10ml乙腈/水(84/16，v/v)并剧烈震荡15分钟，超声40分钟，离心20分钟(4000rbp/min)；取2mL上清、氮气吹60分钟，加热45℃；氮气吹干加入1ml乙腈：水(16：84，v/v)复溶，0.22μm有机相滤器过滤，基于液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)定量分析T-2毒素的含量。

结果显示，枳壳内生真菌Biscogniauxia aurantium具有强拮抗拟枝孢镰孢菌及降解T-2毒素的能力，拟枝孢镰孢菌对峙Biscogniauxia aurantium培养10天产生的T-2毒素4.23μg/ml降低为0.73μg/ml，降解率达到82.7％(图9)。

实施例6、本发明菌株的伏马毒素降解能力

串珠镰孢菌(Fusarium verticillioides)与对峙培养的菌株降解伏马毒素B1(FB1)、伏马毒素B2(FB2)、伏马毒素B3(FB3)毒素的测定：把获得枳壳内生真菌Biscogniauxia aurantium与串珠镰孢菌接种在PDA培养基上25℃共培养10天；串珠镰孢菌(Fusarium verticillioides)接种到PDA培养基上培养10天；每个样品三个重复。烘干10天的菌落，用组织研磨机磨碎，分装在离心管中称重，取0.5g干重的菌丝加10ml乙腈/水(4/1，v/v，1％甲酸)并剧烈震荡15分钟，超声30分钟，离心20分钟(4000rbp/min)；取2mL上清、氮气吹30到45分钟，加热45℃；氮气吹干加入1ml乙腈：水(1：1，v/v)复溶，0.22μm有机相滤器过滤，基于液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)定量分析FB1、FB2、FB3毒素的含量。

结果显示，枳壳内生真菌Biscogniauxia aurantium具有强拮抗串珠镰孢菌及降解伏马毒素B1(FB1)、伏马毒素B2(FB2)、伏马毒素B3(FB3)的能力，串珠镰孢菌对峙Biscogniauxia aurantium培养10天产生的FB1毒素由5.02μg/ml降低为0.22μg/ml，降解率达到95.6％(图10)；FB2毒素由4.86μg/ml降低为0.14μg/ml，降解率达到97.1％(图11)；FB3毒素由3.89μg/ml降低为0.53μg/ml降解率达到86％(图12)。

生物材料保藏

本发明中分离获得的枳壳内生真菌Biscogniauxia sp.(Biscogniauxiaaurantium)，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行微生物保藏，其保藏号为CGMCC No.21441，保藏日为2020年12月14日。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海营养与健康研究所

<120> 枳壳内生真菌及其在拮抗真菌及降解真菌毒素中的应用

<130> 20A151

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 628

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(628)

<223> ITS4、ITS5序列拼接后得到的序列

<400> 1

aactccaaac ccatgtgaac ttacctattg ttgcctcggc aggctgtgtg tgctatatga 60

tatgggaagc taccctgcag ctacctaccc taaataggag ttaccctgga gtggagtctg 120

atgacttgca cgctggagag aagccacctt agggcctgga aagccgttta cagatgagca 180

ccgatctaat agcatgctaa aaagcctgcc gaaggaccac taaactctgt tttatactgt 240

atctctgagt aaattataca aataagttaa aactttcaac aacggatctc ttggttctgg 300

catcgatgaa gaacgcagcg aaatgcgata agtaatgtga attgcagaat tcagtgaatc 360

atcgaatctt tgaacgcaca ttgcgcctaa tagtattctg ttaggcatgc ctgttcgagc 420

gtcatttcaa cccccaagcc ctatttgctt gacgttggga gcttacagct gctgtaactc 480

cttaaattta gtggcggagc caggtcatgc tctgagcgta gtaattcttt ttttctcgct 540

cctgatgctg gcttgtatcc tgccgtaaaa ccccctaaat tttattctgg ttgacctcgg 600

atcaggtagg aatacccgct gaacttaa 628

<210> 2

<211> 849

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(849)

<223> LROR、LR5序列拼接后得到的序列

<400> 2

atcaataagc ggaggaaaag aaaccaacag ggattgccct agtaacggcg agtgaagcgg 60

caacagctca aatttgaaat ctggcttccg ggtccgaatt gtaatttgca gaggatgctt 120

ttggcgaggt gccttccgag ttccctggaa cgggacgcct tagagggtga gagccccgta 180

cggttggaca ctaagcctct gtaaagctcc ttcgacgagt cgagtagttt gggaatgctg 240

ctctaaatgg gaggtaaatt tcttctaaag ctaaataccg gccagagacc gatagcgcac 300

aagtagagtg atcgaaagat gaaaagcact ttgaaaagag ggttaaatag cacgtgaaat 360

tgttgaaagg gaagcgttta cggccagacc ttttcctagc ggatcatctg gtgttctcac 420

cggtgcactt cgctaggttt aggccagcat cggcttctgt agagggataa aagcagtggg 480

aaagtagctc tctcgggagt gttatagccc taagcataat acctttacgg gggccgagga 540

ccgcgctttt gcaaggatgc tggcgtaatg gtcgtcaacg acccgtcttg aaacacggac 600

caaggagtcg aacatttgtg cgagtgtttg ggtgttaaac cctcacgcgt aatgaaagtg 660

aacggaggtg agagcccttt acggggtgca tcatcgaccg atcctgatgt cttcggatgg 720

atttgagtag gagcattaat gttcggaccc gaaagatggt gaactatgcg tggatagggt 780

gaagccagag gaaactctgg tggaggctcg cagcggttct gacgtgcaaa tcgatcgtca 840

aatctgcgc 849

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 3

ggaagtaaaa gtcgtaacaa gg 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 4

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 5

tcctgaggga aacttcg 17

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 6

gtacccgctg aacttaagc 19

Claims

1.一种经分离的真菌，该菌为炭皮菌(Biscogniauxia sp.)，该菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.21441；该菌为枳壳内生真菌。

2.包括权利要求1所述的真菌的细胞培养物，其具有抑制镰孢菌(Fusarium)的特性。

3.权利要求1所述的真菌的应用，用于：非治疗目的地抑制镰孢菌(Fusarium)，或制备抑制镰孢菌的组合物；所述的镰孢菌为：禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)，串珠镰孢菌(Fusarium verticillioides)或拟枝孢镰孢菌(Fusarium sporotrichioides)。

4.权利要求2所述细胞培养物的应用，用于：非治疗目的地抑制镰孢菌(Fusarium)，或制备抑制镰孢菌的组合物；所述的镰孢菌为：禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)，串珠镰孢菌(Fusarium verticillioides)或拟枝孢镰孢菌(Fusarium sporotrichioides)。

5.一种用于抑制镰孢菌的组合物，其包含以下成分：权利要求1所述的真菌。

6.一种用于抑制镰孢菌的组合物，其包含以下成分：权利要求2所述的细胞培养物。

7.一种非治疗目的地抑制镰孢菌的方法，包括：应用权利要求1所述的真菌对需要抑制的对象进行处理；所述的镰孢菌为：禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)，串珠镰孢菌(Fusarium verticillioides)或拟枝孢镰孢菌(Fusarium sporotrichioides)。

8.一种非治疗目的地抑制镰孢菌的方法，包括：应用权利要求2所述的细胞培养物对需要抑制的对象进行处理；所述的镰孢菌为：禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)，串珠镰孢菌(Fusarium verticillioides)或拟枝孢镰孢菌(Fusarium sporotrichioides)。

9.一种用于抑制镰孢菌的试剂盒，其包含：权利要求1所述的真菌。

10.一种用于抑制镰孢菌的试剂盒，其包含：权利要求2所述的细胞培养物。

11.一种用于抑制镰孢菌的试剂盒，其包含：权利要求5所述的用于抑制镰孢菌的组合物。