CN112812976B

CN112812976B - 一种莱氏绿僵菌cdtlj1及其应用

Info

Publication number: CN112812976B
Application number: CN202110145669.XA
Authority: CN
Inventors: 龙秀珍; 于永浩; 高旭渊; 曾宪儒; 韦德卫; 何瞻; 江小冬; 曾涛
Original assignee: Institute Of Plant Protection Guangxi Academy Of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute Of Plant Protection Guangxi Academy Of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-02-02
Filing date: 2021-02-02
Publication date: 2023-03-31
Anticipated expiration: 2041-02-02
Also published as: CN112812976A

Abstract

本发明公开了一种莱氏绿僵菌CDTLJ1及其应用。涉及生物技术防治技术领域。莱氏绿僵菌(Metarhizium rileyi)CDTLJ1，于2020年3月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19608。本发明从自然感染的草地贪夜蛾幼虫僵虫上直接分离筛选的莱氏绿僵菌菌株，培养简单，产孢量大，孢子萌发率高；其分生孢子对草地贪夜蛾幼虫致病力强，并对草地贪夜蛾预蛹和蛹也有一定的致病力，环保无污染、不易产生抗药性，可以广泛地用于草地贪夜蛾的防治。

Description

一种莱氏绿僵菌CDTLJ1及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术防治技术领域，更具体的说是涉及一种莱氏绿僵菌 CDTLJ1及其应用。

背景技术

草地贪夜蛾Spodoptera frugipera，属于鳞翅目Lepidoptera，夜蛾科Noctuidae，是一种原产于美洲热带和亚热带地区的杂食性害虫，具有为害作物多、适生范围广、迁飞能力强、繁殖潜力大、危害损失重、药剂抗性高、防治难度大等特点，是联合国粮农组织全球预警的重大农业害虫。自2019年1 月在我国云南省普洱市江城县首次发现草地贪夜蛾入侵以来，该虫已蔓延至我国的21个省份，严重为害我国的玉米等作物，预计我国每年因草地贪夜蛾造成的经济损失可能达100亿元人民币，严重威胁我国农业及粮食生产。

目前，对于草地贪夜蛾的防治主要依赖化学农药防治，然而该虫对化学农药较容易产生抗性，目前已发现该虫对部分药剂产生了的抗药性，加之化学农药的大量使用还降低传粉昆虫和天敌等有益昆虫的数量，带来一系列的环境生态问题，使化学农药防治受到一定制约。根据全球范围内草地贪夜蛾的治理经验，生物防治是草地夜蛾最有效的控制手段之一，也将成为我国草地夜蛾综合治理战略的必要支柱。昆虫病原真菌是一类能感染昆虫并在其体表或体内增殖，使昆虫发病甚至死亡的真菌。因其对环境友好，对害虫具有持续的控制能力，不易产生抗药性，被认为是最有可能替代化学农药的下一代新型生物农药。

但是，草地贪夜蛾入侵我国的时间较短，对其生物防治研究有限，故，调查采集各地草地贪夜蛾昆虫病原真菌种类，筛选对草地贪夜蛾具有高特异性和高效率的生防病原菌株，对我国草地贪夜蛾的可持续防控具有重要意义。

因此，如何提供一种对草地贪夜蛾具有高特异性和高效率的生防病原菌株是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种莱氏绿僵菌CDTLJ1及其应用。其分生孢子对草地贪夜蛾幼虫致病力强，环保无污染、不易产生抗药性，可以广泛地用于草地贪夜蛾的防治。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种莱氏绿僵菌CDTLJ1，保藏编号为CGMCC No.19608。

保藏信息：莱氏绿僵菌(Metarhizium rileyi)CDTLJ1，于2020年3月30 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.19608。

ITS序列如SEQ ID NO：1所示。

进一步的：莱氏绿僵菌CDTLJ1的菌落为淡绿色，分生孢子梗产生于营养菌丝，分枝。分生孢子链生，长椭圆形，表面光滑，聚集呈淡绿色，3～4.5 μm×2～3μm。

本发明还提供了莱氏绿僵菌CDTLJ1的发酵产物。

进一步的：发酵工艺采用常规发酵工艺即可。

本发明还提供了莱氏绿僵菌CDTLJ1或其发酵产物的药剂。

优选的：药剂为杀虫剂，靶标害虫为草地贪夜蛾。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种莱氏绿僵菌CDTLJ1及其应用，取得的技术效果为本发明从自然感染的草地贪夜蛾幼虫僵虫直接分离筛选的莱氏绿僵菌菌株，培养简单，产孢量大，孢子萌发率高；其分生孢子对草地贪夜蛾幼虫致病力强，环保无污染、不易产生抗药性，可广泛地用于草地贪夜蛾的防治。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明提供的莱氏绿僵菌CDTLJ1菌株在SMAY培养基上 26±1℃下培养的菌落形态图。

图2附图为本发明提供的莱氏绿僵菌CDTLJ1菌株的产孢结构和分生孢子图。

图3附图为本发明提供的草地贪夜蛾幼虫被莱氏绿僵菌CDTLJ1感染症状图。

图4附图为本发明提供的莱氏绿僵菌CDTLJ1菌株对草地贪夜蛾幼虫的致病力随孢子浓度和处理时间变化示意图。

图5附图为本发明提供的草地贪夜蛾蛹被莱氏绿僵菌CDTLJ1感染症状图。

图6附图为本发明提供的莱氏绿僵菌CDTLJ1菌株对草地贪夜蛾幼虫、预蛹、蛹的致病力示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例公开了一种莱氏绿僵菌CDTLJ1及其应用。

实施例1

病原菌的分离、鉴定。

从广西壮族自治区南宁市武鸣区广西农业科学院里建科研基地采集到自然感染的草地贪夜蛾幼虫僵虫，在无菌条件下用接种针挑起少量孢子，采用划线法接种于萨氏麦芽糖琼脂酵母培养基(SMAY)(麦芽糖40g、蛋白胨 10g、酵母浸膏10g、琼脂18g、蒸馏水1000mL)，于温度(26±1)℃，光周期L：D＝12h：12h，相对湿度(80±5)％的恒温培养箱中培养。培养7d 后，挑取少量孢子至新的培养基纯化培养15d，将分离纯化的菌株分生孢子置于20％的甘油中，于-80℃冰箱中保存备用。

形态学鉴定：

将分离纯化的菌株在直径为90mm的平板SMAY培养基上于26±1℃条件下培养，4～5天后挑取菌丝制片在光学显微镜下观察菌株的菌丝和分生孢子梗形态；10～12天后挑取成熟分生孢子制片观察分生孢子的形态与大小，每天观察记录菌落形态特征。培养初期菌落较小，有凸起、粘液状，无分泌物，菌落呈乳白色，5～6d开始产孢，产孢后菌落为淡绿色。菌丝光滑有分隔，分生孢子呈穗状，分生孢子梗产生于营养菌丝，每个分枝上有数个分生孢子梗，分生孢子梗短圆柱形，近基部略膨大，顶部略短尖。分生孢子着生于顶部，链生，长椭圆形，表面光滑，聚集呈淡绿色，3～4.5μm×2～3μm。菌落生长较缓慢，在SMAY培养基上培养10d的菌落直径为15mm。(参见图1、2)

菌株的ITS序列测定及分子鉴定：

利用菌株的菌丝体提取总DNA，以提取的DNA为模板，采用真菌通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')/ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')进行菌株ITS-rDNA序列PCR扩增。

PCR反应体系50μL：2×Es Taq MasterMix(Dye)25μL，DNA模板1μL，上、下游引物各2μL(10μmol/L)，ddH₂O 20μL。

扩增程序：94℃预变性5min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，进行 35个循环；72℃延伸5min。PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测后送广州擎科生物技术有限公司测序。

对CDTLJ1菌株ITS-rDNA序列测序分析，将序列结果通过BLAST程序进行比对，结果显示菌株为莱氏绿僵菌(Metarhizium rileyi)种，结合形态特征鉴定，确定该菌为莱氏绿僵菌，命名为莱氏绿僵菌CDTLJ1，菌株的ITS序列如下：

TGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCCATGTGA ACTTATACCCTTTTCCTGTTGCCTCGGCGGGTCATTTGCCCCGGACCGG GCTCGTCCAGAGCCCGCCCGGAAACAGGCGCCCGCCGCGGGACCGAAACTCTGTATCTCTTAGCCTTTGGCACGTCTGAGTGGAATCATACAAAAAT GAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGA ACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATC ATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATG CCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCCCCCGCGGTTTGGTGTTGG GGGCCGGCGATTGTCAGCTGGGCCGCTCAGGCGGTTCCCTGCGGCGCC GCCCCCGAAATGAATTGGCGGCCCCGTCGCGGCCTCCTCTGCGTAGTAG CACAACCTCGCAACAGGAGCGCGGCGCGGCCACTGCCGTAAAACGCAC AAACTTCTCCAAGAGTTGACCTCGAATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATC，如SEQ ID NO：1。

实施例2

莱氏绿僵菌(Metarhizium rileyi)CDTLJ1的生物学特性。

菌落生长速率和产孢量的测定：用点滴法将莱氏绿僵菌(Metarhizium rileyi)CDTLJ1接种于PDA、SDAY、PPDA、SMAY、Czapek平板培养基中央，置于温度(26±1)℃，光周期L：D＝12h：12h，相对湿度(80±5％) 的恒温培养箱中培养，用十字交叉法每天测量菌落直径，每处理设3个重复，共观察15d。同时记录开始产孢时间，自产孢开始，每天取出整个菌落菌碟置于含20mL灭菌0.05％吐温-80溶液的锥形瓶内，振荡使孢子充分分散，血球计数板测定孢子浓度并换算成单位面积的产孢量。

孢子萌发率的测定：将菌株培养15天，用含灭菌的2％葡萄糖+0.5％蛋白胨溶液收集分生孢子，摇匀制成浓度为10⁶孢子/mL的悬浮液。将孢子悬浮液滴在无菌的凹玻片中，置于铺有滤纸的培养皿内，皿内滴加3～4滴无菌水以保持100％RH。置于26±1℃培养箱中培养，培养24h、48h后镜检萌发率，每个处理重复3次。

菌株在不同培养基上的生长速率，莱氏绿僵菌CDTLJ1在SMAY培养基上的产孢量测定结果，分生孢子萌发的结果分别如表1、表2和表3所示。

表1莱氏绿僵菌CDTLJ1在不同培养基上的生长情况

注：表中数据为平均值±标准差；-表示菌株不生长；同列数据后不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)。

表2莱氏绿僵菌CDTLJ1在SMAY培养基上的产孢量测定结果

注：表中数据为平均值±标准差；表中不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)。

表3莱氏绿僵菌CDTLJ1分生孢子的萌发率

注：表中数据为平均值±标准差。

由表1可知，不同培养基对莱氏绿僵菌CDTLJ1菌株的菌丝生长存在显著影响，菌株生长初期(前7d)，在SMAY培养基上最早生长，且生长速率最快，为0.67mm/d，显著高于其他4种培养基(P＜0.05，下同)上的生长速率。培养8～14d，菌株在各培养基上的生长速度稍有加快，其中PPDA培养基上的生长速率最快，为1.25mm/d，显著高于其他4种培养基上的生长速率；而在SMAY培养基上的生长速率显著低于PDA、SDAY、PPDA培养基上的生长速率，但菌株在PDA、SDAY、PPDA培养基上的产孢量较少，并很快被菌丝覆盖，不易察觉。菌株在Czapek培养基上培养14d均未见菌丝生长，延长观察至20d也未见生长，由此判断Czapek培养基不适合莱氏绿僵菌CDTLJ1 生长。

由表2可看出，菌落在SMAY培养基上培养，第5d开始产孢，产孢量为0.30×10⁸孢子/cm²，培养至第11d时产孢量达7.12×10⁸孢子/cm²，产孢量较高。

由表3可看出，48h孢子的萌发率可达97.57％，表明该菌株的生物学特性好，生长情况好。

实施例3

采用浸虫法测定莱氏绿僵菌(Metarhizium rileyi)CDTLJ1不同孢子浓度对草地贪夜蛾3龄幼虫的致病力。

从SMAY平板上刮取一定量的莱氏绿僵菌(Metarhizium rileyi)CDTLJ1 孢子置于灭菌的0.05％吐温-80溶液中，配制成5个浓度梯度的孢子悬浮液 (1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸孢子/mL)；选取大小一致、健康活泼的草地贪夜蛾3龄幼虫，放入配制好的孢子悬浮液中，浸渍5s后取出，置于无菌滤纸上吸干虫体表面多余水分，将其置于皿底垫有湿润滤纸的灭菌培养皿(d＝7.5cm)中，皿内放入新鲜玉米叶供其取食。每处理20头幼虫，单头饲养，重复3次，以浸渍0.05％土温-80无菌水溶液处理作为对照。处理后置于26±1℃、RH80％±5％、12L：12D人工气候箱饲养，每天更换新鲜的玉米叶供活幼虫取食，观察记录死亡虫数，并将死亡的幼虫继续保留在培养皿中保湿观察，确认是否为供试菌株感染死亡，统计死亡率及僵虫率，草地贪夜蛾幼虫被莱氏绿僵菌CDTLJ1感染症状图如图3所示。

数据经Excel整理后，用SPSS 17.0软件进处理分析。由图4可知，莱氏绿僵菌CDTLJ1菌株对草地贪夜蛾幼虫具有较高的毒力，随着孢子浓度的增加和处理时间的推移，草地贪夜蛾3龄幼虫的累计校正死亡率逐渐升高。孢子浓度1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸孢子/mL处理的幼虫在第4d开始出现死亡，1×10⁴孢子/mL处理的幼虫在第5d开始出现死亡，随后死亡率迅速升高， 1×10⁷、1×10⁸孢子/mL处理的幼虫累计校正死亡率在第6d达到100％，1×10⁵、 1×10⁶孢子/mL处理的幼虫累计校正死亡率在第7d达到100％，1×10⁴孢子/mL 处理的幼虫累计校正死亡率在第8d最高，为96.67％。应用Probit模型，得到莱氏绿僵菌菌株CDT-LJ1对草地贪夜蛾3龄幼虫第6d的致病力回归方程y ＝-3.725+0.920x(χ²＝0.056，P＝0.91)，LC₅₀为1.12×10⁴孢子/mL，95％置信区间为4.48×10³～2.06×10⁴孢子/mL。

莱氏绿僵菌CDTLJ1菌株对草地贪夜蛾3龄幼虫的致病力实验结果见表 4。

表4不同孢子浓度下莱氏绿僵菌菌株CDT-LJ1对草地贪夜蛾3龄幼虫的致死时间效应

注：回归方程中y为几率值，x为时间的自然对数。

由表4可知，随着莱氏绿僵菌CDTLJ1孢子浓度的增加，草地贪夜蛾3 龄幼虫的致死中时(LT₅₀)逐渐缩短，孢子浓度在1×10⁴～1×10⁸孢子/mL范围内，LT₅₀从5.928d降至4.10d。

实施例4

采用浸虫法测定莱氏绿僵菌(Metarhizium rileyi)CDTLJ1对草地贪夜蛾不同龄期幼虫、预蛹和蛹的致病力。

从SMAY平板上刮取一定量的莱氏绿僵菌(Metarhizium rileyi)CDTLJ1 孢子置于灭菌的0.05％吐温-80溶液中，配制成1.20×10⁷孢子/mL孢子悬浮液；选取大小一致、健康活泼的草地贪夜蛾2～6龄幼虫、预蛹、化蛹6h内的新鲜蛹，放入配制好的孢子悬浮液中，浸渍5s后取出，置于无菌滤纸上吸干虫体表面多余水分，将其置于皿底垫有湿润滤纸的灭菌培养皿(d＝7.5cm)中，放置有幼虫的皿内放入新鲜玉米叶供其取食，并每天更换新鲜的玉米叶供活幼虫取食。每处理20头试虫，单头饲养，重复3次，以浸渍0.05％土温-80无菌水溶液处理作为对照。处理后置于26±1℃、RH80％±5％、12L：12D人工气候箱饲养，每天观察记录死亡虫数，并将死亡的试虫继续保留在培养皿中保湿观察，确认是否为供试菌株感染死亡，统计死亡率及僵虫率。草地贪夜蛾蛹被莱氏绿僵菌CDTLJ1感染症状图如附图5所示。数据经Excel整理后，用SPSS 17.0软件进处理分析。

莱氏绿僵菌CDTLJ1菌株对草地贪夜蛾幼虫、预蛹、蛹的致病力实验结果见图6。

由图6可知，莱氏绿僵菌CDTLJ1菌株对草地贪夜蛾幼虫、预蛹、蛹均有致病力，均从第4d开始出现死亡，并随着处理时间的推移，草地贪夜蛾 2～6龄幼虫、预蛹、蛹的累计校正死亡率逐渐升高。处理4d后2～6龄幼虫、预蛹、蛹的累计校正死亡率分别为63.33％、60.00％、60.00％、55.00％、43.33％、 13.33％、8.33％。处理6d后，2～5龄幼虫的累计校正死亡率均达100％，6龄幼虫的累计校正死亡率为98.33％，预蛹和蛹的累计校正死亡率分别为 28.33％、20.00％。实验过程中，部分6龄幼虫和预蛹在被莱氏绿僵菌CDTLJ1 侵染后仍能化蛹，但2d～3d后逐渐变僵硬，保湿培养后菌丝从气门、节间等部位长出、并产生分生孢子。

实施例2、3、4的结果表明，莱氏绿僵菌CDTLJ1菌株，对草地贪夜蛾幼虫具有较强致病力的菌株，并对草地贪夜蛾预蛹和蛹也有一定的致病力，该菌株在温度为26±1℃条件下，SMAY培养基最适宜该菌生长，产孢量大，孢子萌发率高，杀虫效果好，是一株在草地贪夜蛾的防治中具有潜在意义的生防菌株。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 广西壮族自治区农业科学院植物保护研究所

<120> 一种莱氏绿僵菌CDTLJ1及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 592

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgcggaggga tcattaccga gtttacaact cccaaacccc atgtgaactt ataccctttt 60

cctgttgcct cggcgggtca tttgccccgg accgggctcg tccagagccc gcccggaaac 120

aggcgcccgc cgcgggaccg aaactctgta tctcttagcc tttggcacgt ctgagtggaa 180

tcatacaaaa atgaatcaaa actttcaaca acggatctct tggttctggc atcgatgaag 240

aacgcagcga aatgcgataa gtaatgtgaa ttgcagaatt cagtgaatca tcgaatcttt 300

gaacgcacat tgcgcccgcc agtattctgg cgggcatgcc tgttcgagcg tcatttcaac 360

cctcaagccc ccgcggtttg gtgttggggg ccggcgattg tcagctgggc cgctcaggcg 420

gttccctgcg gcgccgcccc cgaaatgaat tggcggcccc gtcgcggcct cctctgcgta 480

gtagcacaac ctcgcaacag gagcgcggcg cggccactgc cgtaaaacgc acaaacttct 540

ccaagagttg acctcgaatc aggtaggaat acccgctgaa cttaagcata tc 592

Claims

1.一种莱氏绿僵菌(Metarhiziumrileyi)CDTLJ1，其特征在于：保藏编号为CGMCCNo.19608。

2.含有权利要求1所述莱氏绿僵菌CDTLJ1的药剂。