CN111004724B - 一种对朱红毛斑蛾幼虫有高致病力的白僵菌菌株及其应用 - Google Patents

一种对朱红毛斑蛾幼虫有高致病力的白僵菌菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一株对朱红毛斑蛾PhaudaflammansWalker幼虫具有高致病力的球孢白僵菌菌株的分离及其应用，该球孢白僵菌Beauveriabassiana菌株命名为PfBb。保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.18839。本发明首次从朱红毛斑蛾僵虫中分离得到球孢白僵菌，毒力测试结果表明该菌株对朱红毛斑蛾幼虫致病力强，具有开发成为微生物杀虫剂的潜力，为朱红毛斑蛾的绿色防控提供技术支撑。

Description

一种对朱红毛斑蛾幼虫有高致病力的白僵菌菌株及其应用
技术领域
本发明属于害虫生物防治技术领域，具体涉及一种球孢白僵菌菌株PfBb及其在朱红毛斑 蛾防治上的应用。
背景技术
朱红毛斑蛾Phaudaflammans Walker，属鳞翅目Lepidoptera毛斑蛾科Phaudidae毛斑蛾属 Phauda。主要危害榕属Ficus植物，其中以垂叶榕Ficusbenjamina和小叶榕Ficusmicrocarpa 受害最为严重。在中国南方及东亚部分国家，榕属植物分布广泛，且是城市绿化的必备树种， 因此该虫在中国的广西、广东、福建、海南和台湾等地区及印度、越南、泰国、马拉西亚和 印度尼西亚等国家常暴发危害。近几年，其在中国南方地区暴发危害的新闻报道屡见不鲜。 朱红毛斑蛾雌成虫喜在当年生嫩叶上产卵，幼虫孵化后自树冠向下取食，因此受害植株常表 现出“秃顶”现象。朱红毛斑蛾幼虫共六龄，低龄幼虫取食叶片仅留下膜状表皮；随着幼虫 龄期的增长，被啃食的叶片呈孔洞状甚至叶片被全部取食，仅剩枝条；叶片被食光时，幼虫 还会取食嫩梢韧皮部，不仅严重影响榕树的生长发育，还影响城市景观、形象和生态效益。 朱红毛斑蛾在中国南方地区每年发生2～3代，世代重叠严重，每年3～10月均可见其发生和为 害。鉴于该虫发生和危害期长，具暴发性，化学防治被广泛推广应用，但防效甚微，同时化 学防治也威胁居民的生命安全和生态环境，因此急需寻求一种绿色防控技术手段。
白僵菌是一种虫生真菌，通过菌丝穿透寄主昆虫的体壁，吸收寄主营养，最终导致寄主 死亡；常被用于害虫的绿色防控，具有对环境无污染，对人畜及作物安全性高，不易诱导害 虫产生抗性，持效期长等优势。目前还未见对朱红毛斑蛾幼虫具有高致病力白僵菌株的相关 报道。因此，寻找到对朱红毛斑蛾幼虫有高致病力的菌株具有非常重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种对朱红毛斑蛾幼虫具有高致病力的菌株。
为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
一种球孢白僵菌菌株，自广西壮族自治区河池市都安县采集的朱红毛斑蛾幼虫僵虫虫体 上分离纯化后得到，编号记为PfBb。将该菌株接种在PDA平板培养基上(马铃薯200g，蔗 糖20g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，自然pH)。其生物学特征为：25℃下培养7天菌落直径 23.85mm，菌落颜色正面为白色，背面浅黄色，圆形扁平状，初期为疏绒状，后期为白色粉状孢子层。分生孢子为单孢，透明球状，分生孢子梗丛状，顶生多个圆柱状产孢细胞。
对所述白僵菌菌株PfBb进行ITS序列分析，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，碱基数 为549bp。将该菌株的ITS序列与NCBI中已知序列进行BLAST对比，与该菌株最为接近的为球孢白僵菌，ITS序列同源性达100％，结合形态学鉴定，鉴定该菌株为球孢白僵菌。
室内毒力测定采用浸虫法测定菌株PfBb对朱红毛斑蛾不同龄期幼虫的的毒力。表1-2结 果显示：(1)同一孢子浓度下，虫龄越低，球孢白僵菌株PfBb的致病力越强，校正死亡率 越高；(2)随着接种时间的延长，校正死亡率越高；(3)菌株PfBb对朱红毛斑蛾幼虫致病力高，在1.0×107孢子/ml浓度下接种8天后，大部分的幼虫死亡，尤其是对1～4龄幼虫的校正死亡率达90％以上；1.0×108孢子/ml浓度下处理8天后，1～5龄幼虫校正死亡率均达100％； (4)球孢白僵菌株PfBb处理后幼虫的僵虫率较高，在1.0×107孢子/ml浓度下的1～5龄幼虫 的僵虫率达85％以上，表明该菌株产生二次感染的机率较高，持效期长，是一株在朱红毛斑 蛾的防治上具有潜在意义的生物防治菌株。
附图说明
图1为球孢白僵菌株PfBb感染朱红毛斑蛾幼虫状。
图2为球孢白僵菌株PfBb的系统发育图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不 受具体实施方式的限制。
实施例1
白僵菌菌株PfBb的分离纯化
该菌株自广西壮族自治区河池市都安县采集的朱红毛斑蛾幼虫僵虫虫体上分离纯化后得 到。在超净台中进行操作，将僵虫浸入75％酒精中30s，取出后放入0.1％升汞溶液中浸泡3min， 再用无菌水清洗5次，置于已灭菌吸水纸上将虫体解剖成小块，取一块虫体组织置于培养皿 中培养5天，5天后菌丝以虫体组织为中心生长，挑取粗壮的菌丝接入斜面试管中作为菌种， 培养15天，试管中长满白色孢子层且无杂菌则分离纯化成功。保藏于中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年 11日15日，分类命名为球孢白僵菌Beauveria bassiana，保藏号为CGMCC No.18839，检测 结果为存活。
实施例2
白僵菌菌株PfBb的鉴定
白僵菌菌株PfBb的形态学鉴定：25℃下培养7天菌落直径23.85mm，菌落颜色正面为白 色，背面浅黄色，为圆形扁平状菌落，初期为绒状，后期为白色粉状孢子层。分生孢子为单 孢，透明球状，分生孢子梗丛状，顶生多个圆柱状产孢细胞。
白僵菌菌株PfBb的分子鉴定：特异性核糖体DNA-ITS序列的氨基酸序列如SEQ IDNO.1， 碱基数为549bp。
将该菌株的ITS序列与NCBI中已知序列进行BLAST对比，与该菌株最为接近的为球孢 白僵菌，ITS序列同源性达100％，结合形态学鉴定，鉴定该菌株为球孢白僵菌。
实施例3
球孢白僵菌菌株PfBb对朱红毛斑蛾幼虫的毒力测定
1.实验方法
在无菌操作台里，用接种环将分生孢子刮到50mL的小三角瓶里，加入20mL含0.05％ 吐温－80的蒸馏水，摇匀后用血球计数板在显微镜下计数，得到初始浓度，再稀释成所需要 浓度。将孢子液配制成1.0×109、1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105孢子/mL共5个浓 度。每个浓度为一个处理，以0.05％吐温－80溶液为对照，每组重复4次，每个重复20头。 采用浸液法接种，将幼虫浸入孢子液3s后取出，室温晾干后放入养虫皿。将虫体放入用75％ 酒精消毒过的养虫皿饲养。每天定时调查3次(08：00、16：00和23：00)朱红毛斑蛾幼虫 死亡情况，连续观察8d，发现死虫则将其移出培养皿，并置于另一已消毒的培养皿内保湿培 养，观察死虫是否长出菌丝。供试幼虫为朱红毛斑蛾1～6龄幼虫，置于75％酒精消毒后的圆 形塑料盒内(高＝14.5cm，直径＝11.5cm)中饲养，每盒10头，每天更换一次新鲜小叶榕叶 片作为食料。饲养条件：温度25±1℃，相对湿度75±5％，光照L16:D8。
2.实验结果
表1不同浓度球孢白僵菌PfBb对朱红毛斑蛾1～6龄幼虫的校正死亡率
Figure BDA0002312679370000031
Figure BDA0002312679370000041
表2不同浓度球孢白僵菌PfBb处理后的朱红毛斑蛾1～6龄幼虫僵虫率
Figure BDA0002312679370000042
根据实施例3的实验结果可知：(1)同一孢子浓度下，虫龄越低，球孢白僵菌菌株PfBb 的致病力越强，校正死亡率越高，其中对1～2龄幼虫的效果最佳，在最低浓度1.0×105孢子/ml 下接种8d后，校正死亡率也达到了90％以上；(2)随着接种时间的延长，校正死亡率越高， 接种8d的校正死亡率要高于接种4d的校正死亡率；(3)对朱红毛斑蛾幼虫致病力高，在 1.0×107孢子/mL浓度下接种8d后，大部分的幼虫死亡，尤其是1～4龄幼虫的校正死亡率达 90％以上；1.0×108孢子/mL浓度下处理8d后，1～5龄幼虫校正死亡率均达100％；(4)球 孢白僵菌菌株PfBb处理后幼虫的僵虫率较高，在1.0×107孢子/mL浓度下的1～5龄幼虫的僵 虫率达85％以上，表明该菌株产生二次感染的机率较高，药效的持效期长。基于上述实验结 果，球孢白僵菌菌株PfBb对朱红毛斑蛾幼虫具有高致病力，1.0×107孢子/mL浓度可有效杀 死幼虫，并具有高僵虫率，是一株在朱红毛斑蛾的防治上具有潜在意义的生物防治菌株。
序列表
<110> 广西大学
<120> 一种对朱红毛斑蛾幼虫有高致病力的白僵菌菌株及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 549
<212> DNA
<213> 球孢白僵菌（Beauveria bassiana）
<400> 1
aacctgcgga gggatcatta ccgagttttc aactccctaa cccttctgtg 50
aacctaccta tcgttgcttc ggcggactcg ccccagcccg gacgcggact 100
ggaccagcgg cccgccgggg acctcaaact cttgtattcc agcatcttct 150
gaatacgccg caaggcaaaa caaatgaatc aaaactttca acaacggatc 200
tcttggctct ggcatcgatg aagaacgcag cgaaacgcga taagtaatgt 250
gaattgcaga atccagtgaa tcatcgaatc tttgaacgca cattgcgccc 300
gccagcattc tggcgggcat gcctgttcga gcgtcatttc aaccctcgac 350
ctccccttgg ggaggtcggc gttggggacc ggcagcacac cgccggccct 400
gaaatggagt ggcggcccgt ccgcggcgac ctctgcgcag taatacagct 450
cgcaccggga ccccgacgcg gccacgccgt aaaacaccca acttctgaac 500
gttgacctcg aatcaggtag gactacccgc tgaacttaag catatcaat 549

Claims (4)

1.一种球孢白僵菌（Beauveria bassiana）PfBb，其特征在于，保藏编号为：CGMCCNo.18839。
2.权利要求1所述的球孢白僵菌PfBb在防治朱红毛斑蛾幼虫中的应用。
3.权利要求1所述的球孢白僵菌PfBb制成的微生物杀虫制剂。
4.权利要求3所述的微生物杀虫制剂在防治朱红毛斑蛾幼虫中的应用。
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