CN113373065A - 一种爪哇棒束孢菌株dmc01及其在防治松毛虫上的应用 - Google Patents

一种爪哇棒束孢菌株dmc01及其在防治松毛虫上的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物学技术领域，具体涉及的是一种爪哇棒束孢菌株DMC01及其在防治松毛虫上的应用。一种爪哇棒束孢菌株DMC01，其分类学名为Isariajavanica，于2021年4月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No.61632，其基因序列如SEQ ID No.3所示。本发明的爪哇棒束孢DMC01对松毛虫具有较高致病力，可有效杀死松毛虫，且具有高僵虫率。本发明的爪哇棒束孢DMC01是一株在松毛虫的防治上具有潜在意义的生物防治菌株。

Description

一种爪哇棒束孢菌株DMC01及其在防治松毛虫上的应用
技术领域
本发明属于微生物学技术领域，具体涉及的是一种爪哇棒束孢菌株DMC01及其在防治松毛虫上的应用。
背景技术
松毛虫是鳞翅目枯叶蛾科松毛虫属的昆虫，是森林害虫中发生量大，危害面广的主要森林害虫，在我国各省常年发生。据不完全统计，每年因松毛虫灾害使木材生长量减少约500万立方米。另外，松毛虫毒毛碰到人的皮肤时，会引起红肿，甚至造成关节肿痛，影响人的身体健康。
化学农药是目前防止松毛虫最主要的方法，然而大量使用化学农药容易引起环境污染以及松毛虫的抗药性。生物防治是松毛虫防治较为理想和环保的方法，虫生真菌作为害虫的一类重要致病菌，在害虫的生物防治占有重要地位。现有技术已有报道利用卵孢白僵菌(Beauveria tenella)、蝗虫绿僵菌(Metarhizium acridum)和球孢白僵菌(Beauveriabassiana)等可以防止松毛虫。目前，还尚未见有利用爪哇棒束孢(Isaria javanica)防治松毛虫的相关报道。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种爪哇棒束孢菌株DMC01及其在防治松毛虫上的应用。
一种爪哇棒束孢菌株DMC01，其分类学名为Isaria javanica，其基因序列如SEQID No.3所示。
本发明提供的种爪哇棒束孢菌株DMC01是通过采集天然感病的昆虫，分离纯化得来，经形态学和分子生物学鉴定为爪哇棒束孢Isaria javanica，于2021年4月28日保藏于保藏于广东省微生物菌种保藏中心，(简称GDMCC，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编：510070)，保藏号为GDMCC No.61632。
本发明还提供了所述爪哇棒束孢菌株DMC01在防治松毛虫上的应用，所属技术领域的技术人员，可以将爪哇棒束孢菌株DMC01制成微生物杀虫剂，用于防治松毛虫。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明对菌株进行分离纯化，通过形态学观察和分子鉴定，确定获得的菌株DCM01为爪哇棒束孢Isaria javanica；其次申请人还测定了其对松毛虫的毒力，经测定发现本发明的爪哇棒束孢DMC01对具有较高致病力，可有效杀死松毛虫，且具有较高僵虫率。
(2)本发明的爪哇棒束孢DMC01是一株在松毛虫的防治上具有潜在意义的生物防治菌株，可开发成微生物杀虫剂，为松毛虫的绿色防控提供技术支撑。
保藏信息说明
Isaria javanica DMC01，保藏编号为GDMCC No.61632，保藏日期为2021年4月28日，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
附图说明
图1为DMC01菌株菌落形态正面图；
图2为DMC01菌株菌落形态背面图；
图3为DMC01菌株的系统发育图；
图4为DMC01菌株在松毛虫上的侵染状。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
下述实施例中所用的材料和试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
实施例
一、爪哇棒束孢菌株DMC01的分离纯化
采集广西壮族自治区钦州市钦廉林场的桉大毛虫僵虫虫体，在超净台上，将僵虫浸入75％的酒精中表面消毒30s后用0.1％升汞浸泡消毒3min，然后依次转移到3瓶无菌水中冲洗，取出置于灭过菌的滤纸上把虫体解剖成小块；
将组织块放置在加入50ug/ml的链霉素的PDA培养基上，每皿放5块，然后置于25℃下培养，待其长出菌丝后挑取转出菌株放到PDA平板上进行纯化培养，纯化培养重复3次。将筛选得到的一株真菌编号为DMC01，并挑取纯化得到的菌丝接入PDA斜面试管中，待菌株长满斜面试管后置于4℃的环境下作为菌种保存。
二、爪哇棒束孢菌株DMC01鉴定
25℃下培养的菌株，在培养过程中对菌落进行观察，菌落的形态如图1和图2所示。
从图1和图2可以看出，在PDA平板上，菌落为圆形，菌丝白色，质地为厚绒毛状，菌落背面淡黄色，孢子层颜色为浅紫灰色。
在显微镜下，菌丝无色透明，分子孢子梗上着生2-4个瓶梗形成的轮生体，瓶梗基部椭圆形膨大，向上逐渐变细；分生孢子在瓶梗上生长形成孢子链；分生孢子呈透明光滑的长椭圆形。
根据上述菌落形态和孢子形态等特征，初步鉴定菌株为爪哇棒束孢Isariajavanica。
三、分子鉴定
1.按照康为世纪NuClean Plant Genomic DNA Kit试剂盒的说明书提取DNA，得到爪哇棒束孢菌株DMC01的基因组DNA。
2.采用真菌TUB引物Bt2a和Bt2b对目的基因β-微管蛋白(β-tubulin，TUB2)进行扩增，得到PCR扩增产物；其中，引物Bt2a和Bt2b的序列见下表1，PCR反应体系见下表2。
表1引物Bt2a和Bt2b的序列
Figure BDA0003167108690000041
表2 PCR反应体系
Figure BDA0003167108690000051
PCR反应程序：95℃变性3min；95℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min。
3.将扩增产物回收纯化、连接转化并进行DNA测序，得到其核苷酸序列见SEQ IDNo.3。
4.将核苷酸序列与NCBI中已知序列进行BLAST对比，构建DMC01菌株系统发育树图，结果见图3。
从图3可以看出，DMC01菌株与AY624224(Isaria javanica)聚为一类，并且其形态特征符合爪哇棒束孢Isaria javanica的特征，确定菌株DMC01为爪哇棒束孢Isariajavanica。因此，将其命名为Isaria javanica DMC01。
四、爪哇棒束孢菌株DMC01对松毛虫的毒力测定
1.用接种环将分离纯化得到的爪哇棒束孢菌株分生孢子刮入50mL的三角瓶里，加入20mL含有0.05％的吐温-80水溶液，充分摇匀后用血球计数板在显微镜下计数，得到初始浓度孢子母液，将孢子液配制成1×106、1×107、1×108个/mL共3个浓度梯度，每个浓度为一个处理，以0.05％的吐温-80水溶液为对照，每个处理设3组重复，每个重复15头四龄松毛虫。
2.用镊子将松毛虫小心取出，在准备好的各组浓度孢子液以及对照处理溶液中浸渍5s，接种后的松毛虫放入养虫皿中，置于25℃培养箱内光暗各12h进行培养，每天用新鲜的松针喂养，并每天定时观察、记录各处理的具体死亡情况，连续观察15d，发现死虫则将其移除培养皿，放入放有滤纸并灭过菌的玻璃培养皿中保湿培养，观察其是否长出菌丝，结果见图4。
从图3可以看出，DMC01菌株侵染松毛虫后，松毛虫虫体上会长出菌丝。
记录僵虫的头数，并计算不同浓度爪哇棒束孢DMC01对松毛虫的校正死亡率以及不同浓度爪哇棒束孢DMC01处理后的松毛虫僵虫率见表3和表4。
表3不同浓度爪哇棒束孢DMC01对松毛虫的校正死亡率
Figure BDA0003167108690000061
从表3可以看出，孢子浓度越高，对松毛虫的校正死亡率越高；在最低浓度1×106个/mL下接种15d后，其校正死亡率也达到了27.91％，而在1×108个/mL浓度下接种15d后，对松毛虫的校正死亡率达到了100.00％；随着接种时间的延长，松毛虫的校正死亡率升高，同一孢子浓度处理下，接种15d的校正死亡率要高于接种5d的校正死亡率。
表4不同浓度爪哇棒束孢DMC01处理后松毛虫僵虫率
Figure BDA0003167108690000062
从表4可以看出，爪哇棒束孢DMC01处理后松毛虫的僵虫率高，最低浓度1×106个/mL处理下的僵虫率为31.11％，1×107个/mL浓度处理下的僵虫率为64.44％，1×108个/mL浓度处理下的僵虫率为100.00％。
结合表3和表4可以看出，本发明的爪哇棒束孢DMC01对松毛虫有高致病力，1×107个/mL以上浓度的孢子液可有效杀灭松毛虫，且具有较高僵虫率。
综上所述，本发明的爪哇棒束孢DMC01对松毛虫具有较高致病力，可有效杀死松毛虫，且具有高僵虫率，是一株在松毛虫的防治上具有潜在意义的生物防治菌株。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
序列表
<110> 广西大学
<120> 一种爪哇棒束孢菌株DMC01及其在防治松毛虫上的应用
<130> 2021
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggtaaccaaa tcggtgctgc tttc 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
accctcagtg tagtgaccct tggc 24
<210> 3
<211> 352
<212> DNA
<213> 爪哇棒束孢(Isaria javanica)
<400> 3
gtaaccaaat cggtgctgct ttctggcaga ccatctctgg cgagcacggc ctcgactcca 60
gcggtgtcta caatggcact tccgagcttc agctcgagcg catgaatgtc tacttcaacg 120
aggtttgcta taccggcaca acgcgtagct tggcttcatt gtggatacta accgcgaatt 180
tcttcaggcc tctggtaaca agtatgttcc tcgcgccgtc ctcgtcgatc ttgagcccgg 240
taccatggac gctgtccgtg ccggtccctt cggtcagctc ttccgccccg acaacttcgt 300
tttcggtcag tccggtgctg gcaacaactg ggccaagggt cactacactg ag 352

Claims (2)

1.一种爪哇棒束孢菌株DMC01，其特征在于，其分类学名为Isaria javanica，于2021年4月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No.61632，其基因序列如SEQID No.3所示。
2.根据权利要求1所述的爪哇棒束孢菌株DMC01在防治松毛虫上的应用。
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