CN111961598A - 一种爪哇棒束孢菌株及其在防治黄曲条跳甲方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种爪哇棒束孢(Isaria javanica)IjH6102菌株，还涉及所述爪哇棒束孢菌株在防治黄曲条跳甲方面的应用，属于生物农药技术领域。所述爪哇棒束孢菌株(Isaria javanica)IjH6102，分类地位属于真菌界、子囊菌门(Ascomycota)、粪壳菌纲(Sordariomycetes)、肉座菌目(Hypocreales)、虫草菌科(Cordycipitaceae)、棒束孢属(Isaria)，所述菌株于广东微生物菌种保藏中心保藏，保藏日期是2019年12月18日，保藏号GDMCC No:60936。本发明所述的菌株是一种昆虫病原真菌，是一种生物活体农药，其对防治黄曲条跳甲高效，对环境和人体安全，具有作为环境友好的真菌杀虫剂的潜力。

Description

一种爪哇棒束孢菌株及其在防治黄曲条跳甲方面的应用

技术领域

本发明涉及一种爪哇棒束孢菌株，还涉及所述爪哇棒束孢菌株在防治黄曲条跳甲方面的应用，属于生物农药技术领域。

背景技术

黄曲条跳甲Phyllotreta striolata(Fabricius)属于鞘翅目(Coleoptera)叶甲科 (Chrysomelidae)害虫，近年来，十字花科蔬菜种植规模逐年扩大，黄曲条跳甲也上升为主要害虫，严重影响菜心、萝卜等十字花科蔬菜生产。黄曲条跳甲的生活习性复杂，成虫和幼虫都可为害作物，成虫具有较强的迁移能力，可食光整株幼苗，也可造成叶片孔洞而影响卖相；幼虫生活在土壤中，取食植株根部，危害严重的时候可造成整棵植株死亡；同时成虫和幼虫在取食的过程中还会留下伤口造成软腐病的发生。

目前，黄曲条跳甲的防控采取以化学防治为主，以物理、农业与生物等方法为辅的综合防治策略，但该虫的抗逆性强、耐药力高、缺乏高效药剂和单一有效防治手段，田间防治效果不尽如人意，为了控制其暴发危害，常常过量使用化学农药，造成抗药性增加、天敌减少、环境污染及农产品农药残留量超标等问题。因此，发展和提高生物防治技术水平是控制黄曲条跳甲危害的迫切需要。近年来国内外对黄曲条跳甲的生物防治取得了一些研究成果，包括天敌昆虫、病原细菌、虫生真菌，以及植物源农药的开发利用等。据研究报道，玫烟色棒束孢Isaria fumosorosea、金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae、苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis和粘质沙雷氏菌Serratia marcescens等微生物可侵染黄曲条跳甲，并已有一些相关发明专利公开：

专利申请号CN201310494943.X公开了一种粘质沙雷氏菌(保藏编号为 CGMCCNO.7948)及其应用；专利(申请)号CN201611253650.2公开了一种苏云金芽胞杆菌(IPPBiotCo1085)及其应用，专利申请号CN201611000946.3公开了一株苏云金芽孢杆菌(保藏编号为CCTCC NO：M2015608)及制剂与应用；申请(专利)号CN201610276234.8公开了一种含枯草芽孢杆菌的微生物源农药及其制备方法。这些细菌对黄曲条跳甲都有一定防治效果，反应了细菌杀虫剂方面的研究成果。

专利申请号CN201510084020.6公开了一种金龟子绿僵菌CQMa421制剂在防治黄曲条跳甲或小菜蛾的药剂中的应用；何越超等筛选了对黄曲条跳甲有效的绿僵菌Ma6菌株(福建农业学报，2017,(2):189-194)。

关于爪哇棒束孢的应用研究，有文献报道它对蚧壳虫(申请(专利)号CN201811348365.8)、普通大蓟马(申请(专利)号CN201810777169.6)、稻飞虱和叶蝉(申请(专利)号CN201711431519.5，CN201911122325.6)、美国白蛾(申请(专利)号CN201710002021.0；Wang et al.BioControl,2020,65:101-111)、假眼小绿叶蝉(展茂魁等,中国生物防治学报,2014,(1):41-46；陈名等,中国生物防治学报,2014,(1):51-57)、蚜虫(Kang et al.Mycobiology,2018:440-44)、柑橘木虱(

etal.Biocontrol Science and Technology,2015,1192-1207)及烟粉虱(Xie etal.Mycoscience,2016,64-70)等害虫有效。

目前，尚无文献公开爪哇棒束孢用于防治黄曲条跳甲的研究成果。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种爪哇棒束孢(Isariajavanica)IjH6102菌株，作为一种防治黄曲条跳甲的生物农药原料。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

首先，本申请的发明人通过大规模生物测定，从300多株虫生真菌中筛选出一株对黄曲条跳甲活性最高的爪哇棒束孢(Isaria javanica)IjH6102菌株，所述菌株系从湖南省洪江市的土壤中分离纯化所得，不同菌株对黄曲条跳甲成虫的生测结果如表1所示。其中，300多株虫生真菌中对跳甲致死率低于10％的菌株未在表1中列出。

然后，本申请的发明人测定了所述菌株对黄曲条跳甲的成虫和幼虫的毒力，结果如表2所示，黄曲条跳甲的死亡率与所述爪哇棒束孢IjH6102菌株分生孢子的处理剂量具有依赖效应。对表2中数据进行毒力回归分析，得到半致死浓度，如表3所示，在处理后14天，所述爪哇棒束孢IjH6102菌株对黄曲条跳甲成虫的半致死浓度(LC₅₀)为8.2×10⁶分生孢子/mL，对幼虫的半致死浓度(LC₅₀) 为6.8×10⁶分生孢子/mL。

本发明还观察了所述爪哇棒束孢IjH6102菌株对黄曲条跳甲的侵染过程，结果如图3所示，可见，虽然所述菌株的杀虫作用比较缓慢，但其在处理后1-2 天，跳甲即开始发病，行动变得迟缓，并且停止取食为害。

继而，对所述IjH6102菌株进行了分类学鉴定，结合形态学与分子生物学特征，明确了所述菌株分类地位属于子囊菌门(Ascomycota)、粪壳菌纲 (Sordariomycetes)、肉座菌目(Hypocreales)、虫草菌科(Cordycipitaceae)、棒束孢属(Isaria)的爪哇棒束孢菌Isaria javanica。所述菌株已于广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏单位地址：中国，保藏日期是2019年12月18日，保藏号GDMCC No:60936。

发明人对所述爪哇棒束孢IjH6102菌株进行了分子生物学鉴定，发现其具有如SEQID NO:1所示的ITS1-5.8S-ITS4序列。

本发明的另一目的是提供所述爪哇棒束孢IjH6102菌株在防治黄曲条跳甲方面的应用。

本发明以爪哇棒束孢IjH6102菌株为有效成分制备成生物杀虫剂在田间用于防治黄曲条跳甲，所述生物杀虫剂包括但不限于以爪哇棒束孢IjH6102菌株的分生孢子为有效成份加工而成的可湿性粉剂、可分散油悬浮剂、颗粒剂、种子包衣、丸粒剂和未加工的IjH6102菌株固体发酵物。

本发明的再一目的是提供一种农药制剂，所述农药制剂的有效成分包括本发明所述的爪哇棒束孢(Isaria javanica)菌株IjH6102。

优选地，所述农药制剂为可湿性粉剂、可分散油悬浮剂、颗粒剂、种子包衣剂或丸粒剂。

更优选地，以质量分数计，所述可湿性粉剂包括如下组分：20％爪哇棒束孢菌株IjH6102、润湿剂3％、分散剂7％、稳定剂2％、紫外保护剂1％和载体67％。其中，所述可湿性粉剂中所述爪哇棒束孢菌株IjH6102的分生孢子含量为 5.50×10⁹个分生孢子/g。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明所述的菌株是一种昆虫病原真菌，是一种生物活体农药，具有对环境无污染，对人畜无毒性的特征，适用于有机农产品生产需求；

(2)本发明所述的爪哇棒束孢IjH6102菌株对防治黄曲条跳甲高效，对环境和人体安全，具有作为环境友好的真菌杀虫剂的潜力。

附图说明

图1为本发明所述爪哇棒束孢IjH6102菌株的形态学特征图；其中，图1A 为PDA平板上IjH6102菌落正面，图1B为IjH6102菌落背面，图1C为IjH6102 菌株产孢结构和分生孢子；

图2为本发明所述爪哇棒束孢IjH6102菌株ITS1-5.8S-ITS4 rDNA的系统发育分析图；

图3为本发明所述爪哇棒束孢IjH6102菌株对黄曲条跳甲的侵染结果图；其中，图3A为所述爪哇棒束孢IjH6102菌株处理黄曲条跳甲成虫后11天的结果图，图3B为所述爪哇棒束孢IjH6102菌株处理黄曲条跳甲幼虫后7天的结果图；

图4为本发明所述爪哇棒束孢IjH6102菌株的固体发酵物用于防治黄曲条跳甲的田间试验效果图；其中，图4A为菜心苗期喷洒IjH6102的菌液50mL/m² (22.5×10⁶孢子/m²)；图4B为IjH6102固体发酵混合物10g/m²(45×10⁶孢子 /m²)与菜心种子拌种；图4C为IjH6102固体发酵混合物5g/m²(22.5×10⁶孢子/m²)与菜心种子拌种；图4D为IjH6102固体发酵混合物5g/m²(22.5×10⁶孢子/m²)与菜心种子拌种且在菜心苗期喷洒IjH6102的菌液100mL/m²(45×10⁶孢子/m²)；图4E为IjH6102固体发酵混合物10g/m²(45×10⁶孢子/m²)与菜心种子拌种且在菜心苗期喷洒IjH6102的菌液100mL/m²(45×10⁶孢子/m²)；图4-CK 为空白对照。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

本实施例为不同虫生真菌菌株对黄曲条跳甲成虫的致病力测定，筛选出活性最高的爪哇棒束孢IjH6102菌株。

通过生物活性测定(方法：浸渍法；处理虫数：30头成虫)发现，在代试的300多株虫生真菌中菌株中，所述爪哇棒束孢菌株IjH6102对黄曲条跳甲的活性最高，当处理浓度为1.0×10⁸个孢子/mL时，其对黄曲条跳甲成虫的致死率达 60.89％，不同菌株对黄曲条跳甲成虫的致病力如表1所示(校正死亡率小于10％的菌株未列出)。

表1不同菌株对黄曲条跳甲成虫的致病力

实施例2

本实施例为所述爪哇棒束孢IjH6102菌株的形态学特征

所述菌株的形态学特征如图1所示，在PDA平板上，菌落初期为白色，表面绒毛状，培养到7天，菌株表面杏色粉质状孢子层，无孢梗束，菌落背面淡杏色。在光学显微镜下，菌丝无色透明，宽度2.68±0.21μm；分生孢子梗与菌丝相似，不成孢梗束；瓶梗(产孢细胞)葫芦状，最宽处直径2.85±0.29μm，长 7.98±0.81μm，轮状直接着生于菌丝上或分生孢子梗上；瓶梗；分生孢子无色，长椭圆形，两端较尖，长5.38±0.63μm，宽2.12±0.25μm。

实施例3

本实施例为所述爪哇棒束孢IjH6102菌株的分子生物学鉴定

本发明对该菌株进行了分子生物学鉴定，其ITS1-5.8S-ITS4 rDNA基因特异性扩增物536bp如SEQ ID NO:1所示，利用MEGA软件构建的系统树显示其与爪哇棒束孢菌Isariajavanica处于同一物种(如图2所示)。结合形态学与分子生物学特征，明确所述菌株分类地位属于子囊菌门(Ascomycota)、粪壳菌纲 (Sordariomycetes)、肉座菌目(Hypocreales)、虫草菌科(Cordycipitaceae)、棒束孢属(Isaria)的爪哇棒束孢菌Isaria javanica。

实施例4

本实施例为所述爪哇棒束孢IjH6102菌株对黄曲条跳甲成虫和幼虫的毒力测定

实验处理：在实验室条件下，用所述菌株的分生孢子悬浮液通过浸渍法处理黄曲条跳甲的成虫和幼虫，供试成虫或幼虫数各30头，重复3次。

实验结果：如表2所示，黄曲条跳甲的死亡率与所述爪哇棒束孢菌株IjH6102 有剂量依赖效应。进而毒力回归分析计算了所述菌株对黄曲条跳甲的毒力，如表3所示，在处理后14天，所述爪哇棒束孢菌株IjH6102对黄曲条跳甲成虫的半致死浓度(LC₅₀)为8.2×10⁶分生孢子/mL，对幼虫的半致死浓度(LC₅₀)为 6.8×10⁶分生孢子/mL。

表2爪哇棒束孢IjH6102菌株的分生孢子对黄曲条跳甲成虫的致死力

注*：校正死亡率(％)＝(处理死亡率-对照死亡率)/(1-对照死亡率)×100％

表3菌株IjH6102对黄曲条跳甲的毒力

本发明还观察了所述爪哇棒束孢IjH6102菌株对黄曲条跳甲的侵染过程，在分生孢子悬浮液浸渍处理成虫后1-2天，分生孢子在体壁萌发，开始侵入虫体；处理后3-5天，黄曲条跳甲成虫出现行动缓慢现象；处理后6-7天，黄曲条跳甲成虫陆续开始死亡，可观察到菌丝首先从触角、足关节、胸部、胸足等刚毛浓密部位伸出，进而产生大量分生孢子(如图3A所示)。分生孢子悬浮液处理黄曲条跳甲幼虫后第3-5天，幼虫出现行动缓慢的现象，继而死亡，虫体僵直，随后慢慢干瘪，可观察到菌丝从虫体表面伸出并产生大量分生孢子(如图3B所示)。

实施例5

本实施例为所述爪哇棒束孢IjH6102菌株的分生孢子的制备方法

包括如下步骤：

(1)平板培养：取取保存的所述爪哇棒束孢菌株IjH6102斜面菌种，刮取少量分生孢子接种至PDA(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)平板上，于25-28℃培养箱中培养1-2周，待产孢后，刮取分生孢子备用；

(2)分子孢子悬浮液的配制：将步骤(1)刮取的分生孢子置于离心管中，加入质量百分含量为0.02％的吐温-80溶液，振荡摇匀，用血球计数板测量孢子浓度，配制成所需浓度的分生孢子悬浮液，备用；

(3)种子液培养：将步骤(2)所述的分子孢子悬浮液接种于马铃薯葡萄糖培养液中，使所述分子孢子的浓度为(1～10)×10⁶分生孢子/mL，25-28℃温度和150rpm转速下振荡培养1-2天，获得种子培养液；

(4)将400g大米装入聚乙烯袋中，加入大米质量的10-20％的水，封口，高压灭菌，冷却后每袋接入步骤(3)所述的种子液50mL，于25-28℃的培养箱中培养14天，发酵风干后，获得固体发酵混合物，直接用于田间进行试验或者分离收集分生孢子纯粉，再加工成分生孢子制剂。

实施例6：

本实施例为20％爪哇棒束孢IjH6102菌株分生孢子可湿性粉剂的配制

(1)20％爪哇棒束孢IjH6102菌株分生孢子可湿性粉剂的制备

将实施例5制备的分生孢子纯粉与分散剂MorwetD-425、润湿剂Morwet EFW、稳定剂黄原胶、紫外保护剂UV-328、载体白炭黑混合均匀而得；各组分的质量分数为：玫烟色棒束孢菌纯孢粉20％，Morwet EFW3％，MorwetD-425 为7％，黄原胶2％，UV-328为1％，白炭黑67％。

(2)20％爪哇棒束孢IjH6102菌株分生孢子可湿性粉剂的性能指标

本实施例所述的可湿性粉剂性能指标的检测方法如下A-G所示：

A.分生孢子含量：将制剂充分混和均匀，称取1.00g样品，置于150mL三角瓶中，加入无菌水约100mL，振荡使其均匀分散。然后血球计数板上计数孢子数，重复3次。

B.分生孢子萌发率：取适量制剂，用1mL无菌的0.02％Tween-80溶液悬浮，接种PDA平板上，培养48小时，显微镜下记录萌发和未萌发的孢子数，重复3 次，计算孢子萌发率。

C.含水量：将洗净的称量瓶在120℃干燥箱中干燥10min，冷却后称重，得称量瓶重m1，取5g左右制剂于称量瓶中，称总重m2，然后于120℃烘干2小时，盖上瓶盖，称重，得m3。重复3次。根据下式计算含水量：

含水率(％)＝(m2-m3)/(m2-m1)×100。

D.润湿时间：根据国标GB-T5451农药可湿性粉剂润湿时间测定。

E.悬浮率：按照国标GB/T 14825-93进行测定。

F.pH：按GB/T 1601-1993农药pH值的测定方法进行。称取1g样品于250mL烧杯中，加入100mL煮沸冷却至室温的蒸馏水，剧烈搅拌1min，静置 1min，用pH计测定样品pH值，3次重复，测定结果差的绝对值应小于0.1，计算平均值。

G.细度：按GB/T 16150-1995方法测定制剂细度。

检测结果：分生孢子萌发率≥91.51％，润湿性≤3min，可湿性粉剂悬浮率81.25％，水分含量为3.04％，制剂含孢量为5.50×10⁹个孢子/g，细度(过325目标准筛)≥98％，pH＝7.01，表明本实施例配制的可湿性粉剂的性能指标符合农药制剂产品要求。

实施例7：

本实施例为爪哇棒束孢IjH6102菌株固体发酵混合物对黄曲条跳甲的田间防治试验

实验方法：应用上述实施例5中所生产的固体发酵物进行防治黄曲条跳甲的田间药效试验，试验地点在广州市增城区宁西镇华南农业大学教学科研基地，试验时间为2019年10-12月，供试作物为菜心，采用随机区组试验设计，小区面积30m²。

固体发酵物拌种处理：实施例5所述固体发酵物收获后，自然干燥，研碎，过筛，然后与过筛的粘土混合，再与菜心种子均匀混合，用于播种。

苗期喷洒菌液处理：将5g固体发酵物悬浮于50mL 0.02％Tween-80溶液中，过滤，离心，取上清液，在菜心5叶期喷雾。

试验重复3次，对照不做处理，每隔一定时间后调查菜心被害株率。实验结果表4和图4所示。

实验结果：表4和图4的结果显示，固体发酵物45×10⁶孢子/m²拌种，以及固体发酵物45×10⁶孢子/m²拌种加苗期喷洒45×10⁶孢子/m²具有显著的防治效果，其被害株率显著低于对照。

表4 20％爪哇棒束孢IjH6102菌株固体发酵混合物对黄曲条跳甲的防效

综上所述，本发明所述的爪哇棒束孢IjH6102菌株对防治黄曲条跳甲高效，对环境无污染，对人畜无毒，具有作为环境友好的真菌杀虫剂的潜力。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一种爪哇棒束孢菌株及其在防治黄曲条跳甲方面的应用

<130> 2020

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 561

<212> DNA

<213> 爪哇棒束孢(Isaria javanica）菌株IjH6102

<400> 1

cgctcgagct tttactccct aaccctttgt gacataccta tcgttgcttc ggcggactcg 60

ccccggcgtc cggacggccc tgcgccgccc gcgacccgga cccaggcggc cgccggagac 120

ccacaaattc tgtttctatc agtctttctg aatccgccgc aaggcaaaac aaatgaatca 180

aaactttcaa caacggatct cttggttctg gcatcgatga agaacgcagc gaaatgcgat 240

aagtaatgtg aattgcagaa ttcagtgaat catcgaatct ttgaacgcac attgcgcccg 300

ccagcattct ggcgggcatg cctgttcgag cgtcatttca accctcgaca ccccttcggg 360

ggagtcggcg ttggggaccg gcagcatacc gccggccccg aaatacagtg gcggcccgtc 420

cgcggcgacc tctgcgtagt actccaacgc gcaccgggaa cccgacgcgg ccacgccgta 480

aaacacccaa cttctgaacg ttgacctcgg atcaggtagg actacccgct gaacttaagc 540

atatcaataa gcggaggaac a 561

Claims (8)

1.一种爪哇棒束孢(Isariajavanica)IjH6102菌株，所述菌株分类地位属于真菌界、子囊菌门、粪壳菌纲、肉座菌目、虫草菌科、棒束孢属，所述菌株于广东微生物菌种保藏中心保藏，保藏日期是2019年12月18日，保藏号GDMCC No:60936。

2.如权利要求1所述的爪哇棒束孢IjH6102菌株，其特征在于，所述爪哇棒束孢菌株IjH6102具有如SEQ ID NO:1所示的ITS1-5.8S-ITS4序列。

3.如权利要求1所述的爪哇棒束孢IjH6102菌株在防治黄曲条跳甲方面的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，以所述爪哇棒束孢IjH6102菌株的分生孢子为有效成分，用于田间防治黄曲条跳甲。

5.一种农药制剂，其特征在于，所述农药制剂的有效成分包括权利要求1所述的爪哇棒束孢(Isariajavanica)菌株IjH6102。

6.如权利要求5所述的农药制剂，其特征在于，所述农药制剂为可湿性粉剂、可分散油悬浮剂、颗粒剂、种子包衣剂或丸粒剂。

7.如权利要求6所述的农药制剂，其特征在于，以质量分数计，所述可湿性粉剂包括如下组分：20％爪哇棒束孢菌株IjH6102、润湿剂3％、分散剂7％、稳定剂2％、紫外保护剂1％和载体67％。

8.如权利要求7所述的农药制剂，其特征在于，所述可湿性粉剂中所述爪哇棒束孢菌株IjH6102的分生孢子含量为5.50×10⁹个分生孢子/g。

Images