CN117660202A - 一种集峰曲霉Aspergillus nomius及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物筛选技术领域，具体涉及一种集峰曲霉Aspergillus nomius及其用途。本发明要解决的技术问题是为生物防治昆虫提供一种新选择。本发明的技术方案是一种集峰曲霉Aspergillus nomius，其保藏号为CGMCC No.40484。本发明筛选到一株新的集峰曲霉，该菌株对柳蓝叶甲和草地贪夜蛾有较强的致病性。本发明为生物防治柳蓝叶甲和草地贪夜蛾提供了一种新选择。
Description
技术领域
本发明属于微生物筛选技术领域，具体涉及一种集峰曲霉Aspergillus nomius及其用途。
背景技术
植食性害虫种群的爆发给人类粮食安全和生态安全造成了极大威胁，喷洒化学农药是应用最为广泛的害虫防控策略，据初步估计，大约三分之一的农产品的生产依赖于化学农药的使用，但是大量农药的残留对生态环境造成了极大污染，所以寻找更加安全且高效的害虫防治方法刻不容缓。昆虫病原真菌在自然界中普遍存在，是一类可以用于害虫生物防治的微生物，因其对环境友好且具有广谱杀虫性，在许多农业生态系统中被认为是化学农药的可替代品，具有十分广阔的应用前景。Aspergillus nomius集峰曲霉，属于曲霉属(Aspergillus)真菌，是黄曲霉素的三种重要生产者真菌之一，该真菌会污染农产品，是人类的潜在病原体，也是一种昆虫病原真菌，目前其基因组已被测序，且有许多文章报导集峰曲霉可以对几种蚂蚁和白蚁具有较强的致病能力，比如孢子浓度在107个/mL时，集峰曲霉侵染胸臭蚁(Dolichoderus thoracicus)7天的致死率可达到100％；孢子浓度在106个/mL时，侵染切叶蚁(Acromyrmex echinatior)10天的致死率也可达到100％，但是集峰曲霉对其他昆虫是否也具有致病性少有研究。
发明内容
本发明要解决的技术问题是为生物防治昆虫提供一种新选择。
本发明的技术方案是一种集峰曲霉Aspergillus nomius，其保藏号为CGMCCNo.40484。该菌株已于2023年1月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.40484，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。
本发明还提供了所述集峰曲霉在生物防治昆虫中的应用。
具体，所述昆虫为柳蓝叶甲或草地贪夜蛾。
特别的，所述的生物防治为采用集峰曲霉的孢子侵染昆虫。
进一步的，所述孢子配制成孢子悬液，其浓度为1×106～2×108个/mL。
优选的，所述孢子悬液浓度为1×108～2×108个/mL。
菌落状态：菌落初期为白色，随时间逐渐变黄色，最终为暗沉的黄绿色，有放射性沟纹，菌落反面带褐色；分生孢子形态：由孢囊梗末端膨大形成暗绿色链状球形的分生孢子。
培养条件：使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基在28℃培养箱中避光培养，12～15天左右可产生成熟分生孢子。
本发明的有益效果：本发明筛选到一株新的集峰曲霉，该菌株对柳蓝叶甲有较强的致病性。本发明为生物防治柳蓝叶甲提供了一种新选择。
保藏信息：本发明的集峰曲霉Aspergillus nomius已于2023年1月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.40484，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。
附图说明
图1、集峰曲霉在PDA培养基上生长15天。
图2、柳蓝叶甲幼虫被集峰曲霉侵染后的生存曲线，黑色实线为对照组，黑色虚线为集峰曲霉侵染组。
图3、柳蓝叶甲未感染幼虫(左)和柳蓝叶甲幼虫被集峰曲霉侵染后，被黄绿色菌丝覆盖(右)。
图4、草地贪夜蛾被集峰曲霉侵染后的生存曲线。
图5、集峰曲霉侵染草地贪夜蛾后的培养板背面(左)和正面(中)图；从被侵染的草地贪夜蛾幼虫上挑取菌丝在PDA培养15天后的菌丝形态(右)。
具体实施方式
实施例1集峰曲霉的筛选、鉴定试验过程
(1)将柳蓝叶甲尸体上的黄绿色真菌用接种环以划线的方式接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)培养基上，多次进行划线培养以得到纯化的真菌菌株，用PDA培养基对该真菌进行扩大培养，该真菌在PDA平板上生长速度较快，培养箱28℃避光培养10天左右可看见成熟孢子。图1展示集峰曲霉在PDA培养基上生长15天后的形态，可以看见集峰曲霉孢子成熟后呈暗沉黄绿色且产生簇状分生孢子。
用醋酸锂提取DNA的方式提取到了该真菌的DNA，具体步骤如下：
1)在1.5mL管中加入100μL的200mM LiOAc+1％SDS溶液；
2)在超净工作台中将200μL真菌孢子溶液溶于混合液中，混匀后70℃加热15min；
3)加入300μL的无水乙醇，用振荡器震荡10s，再反复颠倒3～4次；
4)离心机15000g离心6min，弃上清，将离心管开盖，置于超净台风干乙醇；
5)加入50μL的1×TE溶液(Tris-EDTA buffer solution，懋康，中国)，混匀，4000g离心1min，取上清，为总DNA，测浓度后放-20℃保存。
(2)菌落初期为白色，随时间逐渐变黄色，最终为暗沉的黄绿色，有放射性沟纹，菌落反面带褐色，真菌成熟后由孢囊梗末端膨大形成暗沉黄绿色链状分生孢子，这与Zhou等人2020年在Frontiers in Microbiology上发表的一种集峰曲霉的菌落和孢子形态是相似的，所以初步该真菌确定为曲霉属细菌；随后利用ITS序列对真菌进行进一步分类鉴定，利用通用引物ITS-1(SEQ ID No.1：5’-CCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS-4(SEQ ID No.2：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC--3’)对真菌总DNA进行PCR扩增，扩增的产物约500～750bp，同时准备加入无菌水的组作为阴性对照(NC)，建立PCR反应体系：18μL 1.1×PCR mix、0.5μL ITS-1、0.5μL ITS-4和1μL模板DNA(100ng)，设置PCR扩增程序：95℃3min；95℃30s，55℃1min，72℃1min，循环数28次；72℃维持10min，4℃保存，对PCR产物使用1％的琼脂糖凝胶进行凝胶电泳，观察目标条带的大小。对凝胶条带在500～750bp大小的PCR产物进行一代测序，测序引物为ITS-1和ITS-4，将获得的片段序列放入NCBI的Blast工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上进行比对，确定其属于曲霉属真菌集峰曲霉(Aspergillus nomius)，且与已有的集峰曲霉菌株的ITS序列相似度均未达到100％，所以认定该菌株为一种新的集峰曲霉菌株。同时，为了保证验证结果的准确性，又使用ITS-4和ITS-5(SEQ ID No.3：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’)这对引物进行了鉴定，扩增得到的序列在NCBI数据库上比对结果与使用ITS-1和ITS-4引物时一致。
用引物ITS-1和ITS-4扩增的ITS序列(SEQ ID No.4)：
GTGGTCGAGTGTAGGTTCTAGCGAGCCCAACCTCCCACCCGTGTTTACTGTACCTTAGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCGCAAGGCCGCCGGGGGGCATCCGCCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGGAGACACCACGAACTCTGAACGATCTAGTGAAGTCTGAGTTGATTGTATCGCAATCAGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAGTGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCATCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGTCGTCGTCCCCTCCTCCGGGGGGGACGGGCCCTAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGATCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCTTGCCGAACGCAAAACAACCATTCTTTCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGAGA
用引物ITS-4和ITS-5扩增的ITS序列(SEQ ID No.5)：
GGAAAAGCACCTACTGATCCGAGGTCACCTGGAAGAATGGTTGTTTTGCGTTCGGCAAGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGATCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTAGGGCCCGTCCCCCCCGGAGGAGGGGACGACGACCCAACACACAAGCCGTGCTTGATGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACGGAATTCTGCAATTCACACTAGTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCATTGTTGAAAGTTTTAACTGATTGCGATACAATCAACTCAGACTTCACTAGATCGTTCAGAGTTCGTGGTGTCTCCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGGATGCCCCCCGGCGGCCTTGCGGCGGGCCCGCCGAAGCAACTAAGGTACAGTAAACACGGGTGGGAGGTTGGGCTCGCTAGGAACCCTACACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTACGACTTTTACTTCCCA
实施例2集峰曲霉的杀柳蓝叶甲实验
(1)柳蓝叶甲的饲养：待气温到达19～28℃，柳蓝叶甲成虫开始繁殖产卵，所用到的柳蓝叶甲均来自于武汉汉阳区墨水湖公园的柳树上，将不同生命阶段的柳蓝叶甲均带回实验室，准备打孔的一次性餐盒作为饲养盒，在盒中铺上打湿的吸水纸，将卵，幼虫，成虫和蛹分别放入盒中，并放置在温度为27±1℃且相对湿度为70±5％的养虫室中，光周期设置为16h︰8h(光照︰黑暗)，并在沙湖采集新鲜的柳枝进行喂养，每天更换被取食过的柳叶并收集卵块放入新的饲养盒中。
(2)集峰曲霉侵染：用无菌水将孢子液浓度制备在108个/mL，取柳蓝叶甲1天大的幼虫共100头，50头浸泡在孢子液中5s，50头泡无菌水5s，取出后分别放在养虫盒中继续喂食柳叶，将养虫盒放入养虫室中，观察并每日记录幼虫的死亡数，制作死亡曲线。图2展示了1龄柳蓝叶甲幼虫被集峰曲霉侵染后的生存曲线，黑色实线为对照组，黑色虚线为集峰曲霉侵染组，结果显示，侵染5天后，柳蓝叶甲幼虫死亡率达到90％。图3展示了柳蓝叶甲未感染幼虫及其被集峰曲霉侵染后被黄绿色菌丝覆盖。
实施例3集峰曲霉对草地贪夜蛾的杀虫活性
菌株在26℃培养15d后，用无菌水配制浓度为1.0×105、1.0×106、5.0×106、1.0×107、1.0×108、2.0×108个/mL的孢子悬浮液，以无菌水作为对照。
将30头3龄草地贪夜蛾幼虫置于培养皿中，每皿2头幼虫，将孢子液喷至玉米叶片或人工饲料上饲喂幼虫。
连续观察10d，每天统计死亡的幼虫并取出，计算集峰曲霉对草地贪夜蛾幼虫致死率、致死中浓度(LC50)；并取被侵染的幼虫和幼虫上的菌丝进行培养(如图5所示)。
结果如表1所示，在使用浓度为1.0×108个/mL时，该集峰曲霉在6天内对草地贪夜蛾幼虫的致死率可达到100％；在使用浓度为2.0×108个/mL时，该集峰曲霉侵染4天时可对草地贪夜蛾幼虫造成100％的死亡率；表2展示了该集峰曲霉侵染草地贪夜蛾幼虫的毒力方程；图4展示了使用不同浓度的集峰曲霉侵染草地贪夜蛾幼虫时的生存曲线。其中孢子浓度为1.0×105个/mL时，由于浓度过低，致死率不高，所以后续毒力方程式和生存曲线图均未使用该浓度。
表1集峰曲霉对草地贪夜蛾幼虫的致死率
| 1d | 2d | 3d | 4d | 5d | 6d | 7d | 8d | 9d | 10d | |
| 1.0×105 | 0 | 0 | 0 | 0 | 6.67％ | 6.67％ | 6.67％ | 10.00％ | 10.00％ | 16.67％ |
| 1.0×106 | 0 | 3.33％ | 3.33％ | 3.33％ | 3.33％ | 10.00％ | 20.00％ | 30.00％ | 36.67％ | 46.67％ |
| 5.0×106 | 3.33％ | 3.33％ | 6.67％ | 10.00％ | 13.33％ | 20.00％ | 40.00％ | 60.00％ | 83.33％ | 90.00％ |
| 1.0×107 | 10.00％ | 23.33％ | 33.33％ | 40.00％ | 46.67％ | 60.00％ | 70.00％ | 83.33％ | 96.67％ | 100.00％ |
| 1.0×108 | 23.33％ | 36.67％ | 53.33％ | 73.33％ | 90.00％ | 100.00％ | ||||
| 2.0×108 | 23.33％ | 76.67％ | 96.67％ | 100.00％ | ||||||
| CK | 0 | 0 | 0 | 0 | 3.33％ | 6.67％ | 6.67％ | 6.67％ | 6.67％ | 13.33％ |
表2集峰曲霉对草地贪夜蛾幼虫的毒力
| 处理时间(d) | 毒力方程 | LC50 | X2 | P |
| 2 | PROBIT(P)＝-8.468672+1.065997x | 87976546.85 | 7.697 | 0.053 |
| 4 | PROBIT(P)＝-11.083068+1.512x | 21448953.428 | 7.483 | 0.057997 |
| 6 | PROBIT(P)＝-28.840+4.145670x | 9050809.872 | 0.522 | 0.914 |
| 9 | PROBIT(P)＝-13.374+2.147x | 1689620.553 | 0.220864 | 0.974153 |
Claims (6)
1.一种集峰曲霉Aspergillus nomius，其保藏号为CGMCC No.40484。
2.权利要求1所述集峰曲霉在生物防治昆虫中的应用。
3.根据权利要求2所述集峰曲霉在生物防治昆虫中的应用，其特征在于：所述昆虫为柳蓝叶甲或草地贪夜蛾。
4.根据权利要求2所述集峰曲霉在生物防治昆虫中的应用，其特征在于：所述的生物防治为采用集峰曲霉的孢子侵染昆虫。
5.根据权利要求4所述集峰曲霉在生物防治昆虫中的应用，其特征在于：所述孢子配制成孢子悬液，其浓度为1×106～2×108个/mL。
6.根据权利要求4所述集峰曲霉在生物防治昆虫中的应用，其特征在于：所述孢子配制成孢子悬液，其浓度为1×108～2×108个/mL。
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| CN202311694445.XA CN117660202A (zh) | 2023-12-11 | 2023-12-11 | 一种集峰曲霉Aspergillus nomius及其用途 |
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| CN202311694445.XA Pending CN117660202A (zh) | 2023-12-11 | 2023-12-11 | 一种集峰曲霉Aspergillus nomius及其用途 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5162331A (en) * | 1991-07-19 | 1992-11-10 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Aspernomine, an antiinsectan metabolite |
| CN107955796A (zh) * | 2018-01-02 | 2018-04-24 | 青岛农业大学 | 红绶曲霉q-1及其在白蚁防治中的应用 |
| CN112391294A (zh) * | 2019-08-16 | 2021-02-23 | 广西壮族自治区林业科学研究院 | 集峰曲霉及其在黄野螟防治中的应用 |
| CN113163771A (zh) * | 2018-10-10 | 2021-07-23 | 农业生物群落股份有限公司 | 用于防治植物有害生物和改善植物健康的组合物和方法 |
| CN114517159A (zh) * | 2022-02-16 | 2022-05-20 | 新疆农业科学院植物保护研究所 | 一株用于防治玉米螟的生防菌株及其应用和玉米螟防治菌剂 |
-
2023
- 2023-12-11 CN CN202311694445.XA patent/CN117660202A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5162331A (en) * | 1991-07-19 | 1992-11-10 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Aspernomine, an antiinsectan metabolite |
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