KR102670639B1 - 뿌리응애 방제능을 가지는 메타리지움 아니소플리애 432 균주 및 이의 용도 - Google Patents
뿌리응애 방제능을 가지는 메타리지움 아니소플리애 432 균주 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 응애 방제능 및 우수한 포자 열안정성을 가지는 메타리지움 아니소플리애(Metarhizium anisopliae) 432 균주(기탁번호: KACC 83053BP), 상기 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 응애 방제용 조성물 및 상기 조성물을 식물, 식물의 종자 또는 식물 식재 토양에 처리하는 단계를 포함하는 응애 방제 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 뿌리응애 방제능을 가지는 메타리지움 아니소플리애(Metarhizium anisopliae) 432 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
식물 생육의 가장 큰 장애 요인으로 지적받고 있는 해충과 식물병을 방제하기 위하여 다양한 작물보호제들이 사용되고 있으며, 더욱 효과적인 보호제의 개발을 위한 연구 개발이 전 세계적으로 활발히 이루어지고 있다. 식량 생산 등의 경제적인 목적 또는 조경을 위한 목적 모두 식물을 키우는 데 있어서 해충의 방제를 위한 작물보호제는 거의 필수적으로 요구되고 있으며, 그에 따른 경제적 비용도 매우 높은 실정이다. 현재까지 이러한 작물보호제는 거의 대부분이 화학물질을 이용하여 개발되고 이용되어 왔으며, 그로 인해 근래에는 이들 화학물질을 바탕으로 한 작물보호제의 인축에 대한 위해성을 비롯하여 생태계 파괴 등의 여러 가지 부작용이 잇따르고 있다. 또한 화학물질을 이용한 살충제의 경우 많은 해충들이 저항성이 발달하여 그 방제를 더욱 어렵게 하고 있으며, 이러한 화학살충제에 대한 해충의 저항성은 연중 많은 세대가 발생하는 흡즙성 미소해충들에서 특히 심하게 발생하고 있다. 이러한 작물보호제의 부작용을 해결하기 위하여 다양한 친환경 방제 방법들이 개발되고 있으며, 그 중 주목받고 있는 방법 중의 한 가지가 곤충병원성(entomopathogenic) 미생물을 이용한 미생물 살충제의 개발과 이용이다.
미생물 살충제의 소재로 이용될 수 있는 미생물은 세균, 바이러스 그리고 곰팡이 등 다양한 미생물이 있으며, 그 중에서 곤충병원성 곰팡이는 가장 오랜 역사를 지니고 있다. 곤충병원성 곰팡이는 곤충에 병을 일으켜 치사시키는 미생물로서 곤충 기주에 침입하여 증식하는 과정 중에 다양한 세포외 효소나 독소물질 그리고 2차 대사산물들을 생산하여 기주 곤충의 면역 반응을 극복하거나, 기주를 치사시키는데 이용되고 있으며 그와 더불어 다른 미생물들과의 경쟁에도 이용되고 있다. 이러한 특징을 이용하여 곤충병원성 곰팡이의 다양한 대사산물에 의한 항세균 및 항진균 활성에 대한 연구 개발 역시 최근에 활발히 이루어지고 있다.
미생물 살충제 소재로써 가장 많이 이용되는 곤충병원성 곰팡이는 뷰베리아(Beauveria)와 메타리지움(Metarhizium) 속에 속하는 곰팡이들이다. 이들 곰팡이 균주들을 이용하여 나비목 해충이나 딱정벌레목 해충 등 매우 다양한 해충에 대한 살충제가 개발되어 시판되고 있다. 이들 곤충병원성 곰팡이를 이용한 살충제는 살아있는 곰팡이를 소재로하여 개발되기 때문에, 개발된 살충제의 보관, 유통 및 처리시의 안정성이 매우 중요하게 평가되고 있다. 곰팡이의 활성에 영향을 줄 수 있는 여러 가지 환경 인자들 중에서도 특히, 열안정성과 자외선 안정성이 매우 중요한 요소로 여겨지고 있다. 따라서, 최근에는 곰팡이를 이용한 살충제의 개발에 있어서 이들 열안정성과 자외선 안정성이 높은 곰팡이 균주를 이용하려는 연구가 활발히 이루어지고 있다.
뿌리응애(Rhizoglyphus robini Claparede)는 응애목(Acarina) 가루응애과(Acaridae)에 속하는 해충으로, 토양에 널리 분포하고 있으며, 마늘, 쪽파 등 파속 작물과 백합, 글라디올러스 등의 구근류 14과 28종의 작물에 피해를 준다. 뿌리응애는 토양속에서 뿌리를 물리적으로 가해하여 1차 피해를 입힌 뒤, 가해로 생긴 상처로 곰팡이나 세균의 침입이 이루어지면서 부패, 병원균의 감염 등 2차 피해를 유발한다. 뿌리응애를 방제하기 위해서는 비펜트린(bifenthrin), 델타메트린(deltamethrin), 프로메캅(promecarb), 디아지논(diazinon) 등의 합성농약이 주로 사용되고 있으나, 뿌리응애의 저항성 획득 및 환경오염 문제 등이 문제점으로 나타나고 있어 그 방제가 매우 어려운 해충으로 여겨지고 있다.
한편, 한국공개특허 제2016-0140560호에는 '해충방제 및 항균활성을 가지는 곤충병원성 곰팡이 메타리지움 아니소플리애 SD4-2 균주와 뷰베리아 바시아나 SD15 균주'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2021-0012341호에는 '진드기에 방제효과를 갖는 Metarhizium anisopoliea JEF-214, Metarhizium anisopoliea JEF-279 또는 Metarhizium anisopoliea JEF-290, 이를 포함하는 진드기 방제용 조성물 및 이를 이용한 진드기 방제방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 '뿌리응애 방제능을 가지는 메타리지움 아니소플리애 432 균주 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 뿌리응애(Rhizoglyphus robini Claparede)와 같은 흡즙성 해충에 높은 살충성을 보이면서 저항성 발생이 거의 없는 생물적 방제 방법인 곤충병원성 곰팡이를 이용한 방제 방법을 개발하고자, 국내에서 분리·확보된 342개의 곤충병원성 곰팡이 균주들을 이용하여 뿌리응애에 대해 높은 살비력을 가지는 곰팡이 균주들을 선발한 결과, 메타리지움 아니소필리애(Metarhizium anisopliae) 432 균주가 뿌리응애에 대해 높은 살비력과 더불어 포자의 열안정성이 매우 높은 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 응애 방제능 및 우수한 포자 열안정성을 가지는 메타리지움 아니소플리애(Metarhizium anisopliae) 432 균주(기탁번호: KACC 83053BP)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 응애 방제용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 식물, 식물의 종자 또는 식물 식재 토양에 처리하는 단계를 포함하는, 응애 방제 방법을 제공한다.
본 발명의 메타리지움 아니소플리애 432 균주는 뿌리응애에 대해서만 특이적인 살충 효과를 보이므로, 인축이나 환경 생태계에 매우 안전한 해충 방제원으로서 사용될 수 있으며, 본 발명의 균주는 포자 열안정성이 매우 높아 제제화시 유통 및 보관상의 안정성이 높은 특징이 있어 산업적으로 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
도 1은 곤충병원성 곰팡이 균주에 감염되어 죽은 뿌리응애 사충들을 보여주는 사진이다.
도 2는 곤충병원성 곰팡이 균주 11개의 뿌리응애(Rhizoglyphus robini Claparede)에 대한 7일간의 살비력을 나타내는 그래프이다. 대조구는 Tween80 만을 처리한 것이고, 수직선은 표준오차를 나타낸다. 111, Metarhizium pemphigi 111; 1101, M. pemphigi 1101; 312, M. pingshaense 312; 441, M. pingshaense 441; 322, M. anisopliae 322; 432, M. anisopliae 432; 481, M. anisopliae 481; 4141, M. anisopliae 4141; 4183, M. anisopliae 4183; 423, M. anisopliae 423; 4312, M. anisopliae 4312.
도 3은 곤충병원성 곰팡이 균주 11개의 열안정성을 평가하기 위하여 각 균주의 포자를 45℃에서 처리한 후의 포자 발아율을 나타내는 그래프이다.
도 2는 곤충병원성 곰팡이 균주 11개의 뿌리응애(Rhizoglyphus robini Claparede)에 대한 7일간의 살비력을 나타내는 그래프이다. 대조구는 Tween80 만을 처리한 것이고, 수직선은 표준오차를 나타낸다. 111, Metarhizium pemphigi 111; 1101, M. pemphigi 1101; 312, M. pingshaense 312; 441, M. pingshaense 441; 322, M. anisopliae 322; 432, M. anisopliae 432; 481, M. anisopliae 481; 4141, M. anisopliae 4141; 4183, M. anisopliae 4183; 423, M. anisopliae 423; 4312, M. anisopliae 4312.
도 3은 곤충병원성 곰팡이 균주 11개의 열안정성을 평가하기 위하여 각 균주의 포자를 45℃에서 처리한 후의 포자 발아율을 나타내는 그래프이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 응애 방제능 및 우수한 포자 열안정성을 가지는 메타리지움 아니소플리애(Metarhizium anisopliae) 432 균주(기탁번호: KACC 83053BP)를 제공한다.
본 발명의 메타리지움 아니소플리애 균주는 곤충병원성 곰팡이로, 곤충병원성 곰팡이는 곤충을 비롯한 무척추동물에 곰팡이병을 일으켜 숙주를 죽게 만들어 자연 상태에서 숙주의 밀도를 조절하는 역할을 하며, 곰팡이 종류에 따라서 병을 일으킬 수 있는 곤충이 제한적이기 때문에 목적으로 하는 해충에게만 피해를 주고 환경이나 다른 인축에 대한 독성은 없을 뿐만 아니라, 곤충에 의한 저항성 기작 역시 거의 발현되지 않는 것으로 보고되어 방제가 어려운 해충들의 방제를 위해 많은 연구 개발이 이루어지고 있다.
본 발명자들은 342개의 곤충병원성 곰팡이 균주들을 이용하여 뿌리응애(Rhizoglyphus robini Claparede)에 대해 높은 살비력을 가진 곰팡이를 분리한 결과, 메타리지움 속(Metarhizium spp.)에 속하는 11개 균주가 높은 살비력을 가지는 것을 확인하였다. 또한, 살충제로써 상품성의 유용성을 높이기 위하여 상기 11개 곰팡이 균주들의 포자 열안정성을 평가한 결과, 최종적으로 메타리지움 아니소플리애(M. anisopliae) 432 균주가 가장 높은 살비 활성과 함께 높은 포자 안정성을 가지는 것을 확인하였다. 이에, 상기 메타리지움 아니소플리애 432 균주를 2021년 08월 20일자로 농업생명공학연구원(KACC)에 기탁하여 기탁 번호 KACC 83053BP를 부여받았다.
본 발명의 메타리지움 아니소플리애 432 균주는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 ITS 영역 서열과, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 EF-1α 영역 서열의 동정을 통해 메타리지움 아니소플리애 균주로 확인되었다.
본 발명은 또한, 상기 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 응애 방제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 응애 방제용 조성물은 뿌리응애(Rhizoglyphus robini Claparede)에 높은 살비 활성을 가지는 메타리지움 아니소플리애(Metarhizium anisopliae) 432 균주(기탁번호: KACC 83053BP) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하여, 응애 방제 효과가 있다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 '배양물'은 메타리지움 아니소플리애 432 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 또는 상기 배양물의 건조물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 배양물은 본 발명의 균주를 포함하는 배양물 자체의 형태로도 사용할 수 있으며, 또는 배양액 중의 배양배지를 제거하고 농축된 균체만을 회수하기 위해 원심분리 또는 여과과정을 거칠 수 있으며, 이러한 단계는 당업자가 필요에 따라 수행할 수 있다. 농축된 균체는 통상적인 방법에 따라 냉동(frozen)하거나 또는 냉동건조(lyophilized)하여 그 활성을 잃지 않도록 보존할 수 있다.
상기 배양물은 통상적인 미생물의 배양방법에 의해 대량으로 배양하여 수득할 수 있으며, 배양배지로는 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄을 포함하는 배지를 사용할 수 있으며, 상기 탄소원으로는 전분, 수크로즈, 시트레이트, 말토스, 글루코스, 만니톨, 글리세롤 또는 자일로스를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 균주를 배양하는 방법은 당업계에 통상적으로 이용되는 방법에 따라 배양할 수 있으며, 특별한 방법에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 균주를 배양하는 단계에서 얻어지는 상기 메타리지움 아니소플리애 432 균주 또는 이의 배양물을 첨가제로 사용할 경우, 상기 균주 또는 상기 균주의 배양물을 그대로 첨가하거나 다른 첨가제를 함께 사용할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 성분의 혼합양은 그의 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 응애 방제용 조성물은 예를 들어 직접 분사가능한 용액, 분말 및 현탁액의 형태 또는 고농축 수성, 유성 또는 다른 현탁액, 분산액, 에멀젼, 유성 분산액, 페이스트, 분진, 흩뿌림 물질 또는 과립제로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 식물병 방제용 조성물은 분사, 분무, 살포, 흩뿌림 또는 붓기에 의해 사용될 수 있다. 사용 형태는 의도한 목적에 의존하는데, 모든 경우에 본 발명에 따른 조성물의 분포가 가능한 한 미세하고 균일하도록 해야 한다.
또한, 본 발명의 응애 방제용 조성물은 다양한 형태로 제제화할 수 있다. 상기 제제는 예를 들어 용매 및/또는 담체를 첨가함으로써 제조될 수 있다. 종종, 비활성 첨가제 및 표면-활성 물질, 예를 들어 유화제 또는 분산제를 제제에 혼합한다. 적합한 표면-활성 물질은 방향족 술폰산(예를 들어 리그노술폰산, 페놀-술폰산, 나프탈렌- 및 디부틸나프탈렌술폰산), 지방산, 알킬- 및 알킬아릴술포네이트, 알킬 라우릴 에테르, 지방 알코올 술페이트의 알칼리 금속, 알카라인 토금속, 암모늄염, 술페이트화 헥사-, 헵타- 및 옥타데칸올, 지방 알코올 글리콜에테르의 염, 술포네이트 나프탈렌 및 이의 유도체, 포름알데히드의 축합물, 나프탈렌 또는 나프탈렌술폰산, 페놀 및 포름알데히드의 축합물, 폴리옥시에틸렌옥틸 페놀 에테르, 에톡실화 이소옥틸-, 옥틸- 또는 노닐페놀, 알킬페닐 또는 트리부틸페닐 폴리글리콜 에테르, 알킬아릴폴리에테르 알코올, 이소트리데실 알코올, 지방 알코올/에틸렌 옥사이드 축합물, 에톡실화 피마자유, 폴리옥시에틸렌 알킬에테르 또는 폴리옥시프로필렌, 라우릴 알코올 폴리글리콜 에테르 아세테이트, 소르비톨 에스테르, 리그닌-술파이트 폐액 또는 메틸셀룰로오스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
적합한 고형 담체 물질은 원칙적으로, 모두 다공성이고, 농업적으로 허용가능한 담체, 예를 들어 광물토류(예컨대 실리카, 실리카 겔, 실리케이트, 활석, 고령토, 석회암, 석회, 초크, 보울, 황토, 점토류, 백운석, 규조 토류, 황산칼슘, 황산 마그네슘, 산화마그네슘, 분쇄 합성물질), 비료(예컨대 황산암모늄, 인산암모늄, 질산암모늄, 우레아), 식물성 제품(예컨대 곡물 가루, 나무 껍질 가루, 목분(wood meal) 및 견과 껍질 가루) 또는 셀룰로오스 분말일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 고형 담체는 1종류 또는 2종류 이상을 혼합하여 사용할 수도 있다.
본 발명의 응애 방제용 조성물은 유효성분으로서 메타리지움 아니소플리애 432 균주를 단독으로, 또는 2종 이상의 다른 살비제(acaricide) 물질 등과 혼합하여 사용할 수 있다.
또한, 상기 응애 방제용 조성물의 제조 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 특정 방법에 특별히 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 응애 방제용 조성물은 식물체 흡수 및 효과를 증진시키기 위하여 확산제 및 침투제, 또는 계면활성제와도 혼용이 가능하다.
본 발명은 또한, 상기 조성물을 식물, 식물의 종자 또는 식물 식재 토양에 처리하는 단계를 포함하는, 응애 방제 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 응애 방제 방법에 있어서, 상기 조성물은 뿌리응애(Rhizoglyphus robini Claparede)에 높은 살비 활성을 가지는 메타리지움 아니소플리애(Metarhizium anisopliae) 432 균주(기탁번호: KACC 83053BP) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 상기 응애 방제 방법은, 상기 메타리지움 아니소플리애 432 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 식물에 침지하거나 관주, 즉, 분무하여 수행할 수 있다. 침지하는 방법의 경우, 상기 조성물의 유효량을 식물체 주변의 토양에 붓거나 또는 종자를 상기 조성물의 유효량에 담가둘 수 있다.
본 발명의 '유효량'은 유익한 또는 원하는 결과를 일으키기에 충분한 양으로, 응애, 특히 뿌리응애(R. robini Claparede)를 방제하기 위해 상기 메타리지움 아니소플리애 432 균주 또는 이의 배양물을 물로 균일하게 희석한 후 동력살포기와 같은 적절한 살포장치를 이용하여 식물체 및 경작지에 살포할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
점박이응애
뿌리응애(R. robini)는 양파를 공급하고 온도 25℃, 상대습도 80-90%, 광조건 12L:12D 조건으로 실험실 조건하에서 사육하면서 실험에 이용하였다.
곤충병원성 곰팡이 균주
1) 곰팡이 균주의 배양
우리나라 전국 토양에서 분리된 342개의 곰팡이 균주(신 등, Biocontrol Science and Technology 2013, 23(3):288-304)를 사용하였다(표 1).
| 곰팡이 종류 | 균주수 | 곰팡이 종류 | 균주수 |
| Acremonium spp. | 1 | Metarhizium lepidiotum | 1 |
| Aspergillus spp. | 8 | Metarhizium pemphigi | 16 |
| Beauveria bassiana | 110 | Mucoromycotina spp. | 1 |
| Beauveria brongniartii | 8 | Myrothecium spp. | 5 |
| Beauveria pseudobassiana | 8 | Paecilomyces carneus | 3 |
| Bionectria spp. | 7 | Paecilomyces marquandii | 5 |
| Chaunopycnis spp. | 23 | Paraconiothyrium spp. | 2 |
| Clonostachys rosea | 1 | Phialocephala spp. | 1 |
| Fusarium spp. | 2 | Pochonia spp. | 17 |
| Isaria farinosa | 12 | Purpureocillium lilacinum | 4 |
| Isaria fumosorosea | 6 | Simplicillium spp. | 1 |
| Isaria spp. | 22 | Tolypocladium spp. | 3 |
| Lecanicillium spp. | 8 | Verticillium spp. | 3 |
| Metarhizium anisopliae | 64 |
곰팡이 균주는 감자한천배지(potato dextrose agar, PDA) 플레이트상에서 25℃에서 14일 동안 배양한 다음, PDA 플레이트에서 14일된 곰팡이 분생포자를 긁어내고 0.05% Tween-80 (Difco, USA) 용액에 물질을 재현탁시켜 수집하였다. 균사 잔해물을 제거하기 위해 상기 분생포자 현탁액을 격렬하게 교반하고 면 거즈를 통해 여과시켰다. 여과된 포자는 혈구계산기를 사용하여 농도를 측정하였다.
2) 곰팡이 균주의 동정
뿌리응애에 병원성이 확인된 균주들의 동정은 현미경적 관찰을 통한 포자의 모양 및 색을 통한 형태학적 동정과 함께 분자생물학적 동정을 실시하였다. 분자생물학적 동정을 위해서 곰팡이의 게놈 DNA 추출은 PDA에서 2주간 자란 곰팡이 균체 일부를 fungal DNA extraction buffer (0.2 M Tris-Cl (pH 7.5), 0.5 M Nacl, 10 nM EDTA (pH 8.0) and 1%(w/v) SDS)를 처리한 후 phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1)로 원심분리하여 DNA를 정제하였다. 정제된 DNA 용액은 냉에탄올을 이용하여 침전시키고 원심분리 후 멸균 증류수에 녹여 실험에 이용하였다.
분리 균주의 분자생물학적 동정을 위한 PCR 프라이머는 internal transcribed spacer (ITS1-5.8S-ITS2) 부분의 증폭을 위한 ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3', 서열번호 3)과 ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3', 서열번호 4) 프라이머를 사용하였으며, Elongation factor-1 aplha 부분의 증폭을 위해서는 1577F(5'-CARGAYGTBTACAAGATYGGTGG-3', 서열번호 5)와 2218R(5'-ATGACACCRACRGCRACRGTYTG-3', 서열번호 6) 프라이머를 사용하였다. PCR 반응은 AccuPower PCR PreMix (Bioneer Co., Korea)를 이용하여 변성(denaturation) 94℃ 5분, 결합(annealing) 55℃ 30초, 신장(extension) 72℃ 1분의 35회 반복 조건으로 Thermal Cycler (TaKaRa, Japan)를 이용하여 수행하였다.
PCR 반응 후 증폭 산물은 1.0% 아가로스 겔을 이용하여 전기영동 분석하고 Power Gel Extraction Kit (Dyne Bio Inc., Korea)를 이용하여 순수 정제하였다. 정제된 PCR 산물은 Macrogen (Korea)사에 direct sequencing 의뢰하여 염기서열을 분석하였다. 염기서열은 Multalin (http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/)를 이용하여 정렬 한 다음 BLAST search tool을 이용하여 기 보고된 다른 곰팡이들 서열과 비교 분석하였다.
생물학적 검정(Bioassay)
1) 뿌리응애 병원성 곰팡이 분리
뿌리응애에 병원성을 가진 곰팡이를 분리하기 위하여 배양 14일 된 곰팡이 포자를 생물 검정에 사용하였다. 생존율이 90%를 초과하는 포자 현탁액을 생물 검정에 사용하였다. 포자의 생존력은 SDAY+B 배지(Saboraud dextrose agar, 1% Yeast extract, 0.05% benomyl, pH 5.6)에서 결정되었다.
342개의 곰팡이 균주들을 무작위로 크게 4개 그룹으로 나누고, 각 그룹의 곰팡이 균주들의 포자 현탁액을 하나로 합쳐서 생물검정에 사용하였다. 생물검정은 각 그룹의 곰팡이 포자현탁액을 뿌리응애 성충 50마리에 침지법으로 접종하고, 접종된 뿌리응애는 10일 동안 매일 관찰하면서 각각의 사충을 수집하였다. 뿌리응애 사충들은 표피에서 곰팡이의 발생을 육안으로 확인된 경우에만 곰팡이에 의한 치사로 인정하였다.
사멸한 뿌리응애 사충으로부터 병원성 곰팡이를 분리하기 위해 사충에서 곰팡이 포자를 멸균된 이쑤시개로 수거하여 0.02% Tween-80 용액에 현탁한 후, 곤충병원성 곰팡이 선택배지인 SDA-D50 (sabouraud dextrose agar, 100 ㎍/㎖ chloramphenicol, 50 ㎍/㎖ streptomycin, 50 ㎍/㎖ dodine)에 도말하였다. 이 후 25℃, 암 조건에서 7일간 배양하면서 형성된 콜로니를 분리하여, 다시 PDA 배지에 접종하여 곰팡이를 순수 분리하고 형태학적 및 분자생물학적 동정을 완료한 후 다음 실험에 이용하였다.
2) 곰팡이의 살비 활성
뿌리응애에 대해 병원성이 있는 것으로 확인된 곰팡이 균주들은 정량적 병원력 검정을 위하여 PDA (potato dextrose agar) 배지에서 2주 동안 배양하여 포자 생성을 유도한 후, 생성된 포자를 0.05% Tween-80을 이용하여 포자현탁액을 만들고 혈구계산기를 이용하여 계수하고 실험에 사용하였다. 생물검정 전 포자의 생존률은 모두 90% 이상인 것을 사용하였다. 각 곰팡이 균주들의 포자 농도는 1 x 107 포자/㎖로 하여 30마리의 뿌리응애에 침지 접종하였다. 접종 후 7일 동안 매일 사충을 관찰하며 수거하였고, 사충의 표면에서 곰팡이 발생이 육안으로 확인된 경우에만 곰팡이에 의한 치사인 것으로 인정하였다. 대조구로는 0.05% Tween-80 용액만을 뿌리응애에 처리하였다.
포자의 열안정성 검정
곰팡이 균주들의 포자의 열안정성을 평가하기 위하여 포자 현탁액 100 ㎕ (5 x 106 conidia/㎖)를 0.5 ㎖ PCR 튜브에 넣고 Thermal Cycler (Takara)를 이용하여 45℃에서 1시간 또는 2시간 각각 처리하였다. 열 처리된 포자 현택액 20 ㎕를 SDYA+B 배지에 점적하고 25℃ 암조건에서 24시간 배양한 후, 400X 위상차 현미경 상에서 무작위로 포자 발아율을 조사하였다.
통계분석
살비활성과 열안정성 평가는 3회 반복 수행하였으며, 결과 값은 SPSS 통계프로그램으로 유의수준 0.05 이하로 유의성 검정을 하였다. 자료는 평균±표준오차(SE)로 표시하였다.
실시예 1. 점박이응애 병원성 곰팡이 분리
1) 병원성 곰팡이 분리
곤충병원성 곰팡이 342개 균주를 4개 그룹으로 묶고 각 그룹에 대하여 포자 현탁액을 만들어 뿌리응애에 대해 병원성을 검정하였다. 그 결과, 전체 200마리의 뿌리응애 중에서 38마리의 응애에서 곰팡이에 의한 치사를 확인하였다.
곰팡이에 의한 치사가 확인된 뿌리응애 사충으로부터 곰팡이를 분리한 결과, 57개의 균주를 분리하였다. 분리된 균주들에 대해서는 포자의 모양과 색깔에 의한 형태학적 동정과 함께 ITS 영역과 Elongation factor-1 aplha 영역에 대한 분자생물학적 동정을 실시하였다. 그 결과, 뷰베리아 바시아나(Beauveria bassiana) 29개 균주, 메타리지움 아니소플리애(Metarhizium anisopliae) 19개 균주, 메타리지움 펨피기(M. pemphigi) 5개 균주, 메타리지움 핑샤엔스(M. pingshaense) 2개 균주, 아칸토마이세스 아테누아투스(Akanthomyces attenuatus) 1개 균주와 아칸토마이세스 베시컬러(A. versicolor) 1개 균주가 동정되었다(표 2 내지 표 3 참조).
동정된 균주 57개를 이용하여 뿌리응애(Rhizoglyphus robini)에 대해서 병원성을 재검정한 결과, 15개 균주에서만 병원성이 다시 확인되었으며, 그 중 분자생물학적 동정 결과가 100% 일치하는 균주들은 동일한 균주로 판단하여 한 개의 균주만 다음 실험에 이용하였다. 최종적으로 분리한 균주 중 메타리지움 아니소플리애(M. anisopliae) 7개 균주, 메타리지움 펨피기(M. pemphigi) 2개 균주, 메타리지움 핑샤엔스(M. pingshaense) 2개 균주를 선발하였다.
실시예 2. 점박이응애에 대한 살비력
뿌리응애에 대해 병원성이 확인된 11개 균주들간의 살비력을 비교 평가하였다(도 1). 그 결과, 11개 균주의 뿌리응애에 대한 살비력은 균주에 따라 다양하게 나타났으며, 처리 후 7일에 38%에서부터 100%까지 나타났다. 그 중에서 메타리지움 아니소플리애 432와 4312 균주, 그리고 메타리지움 펨피기 111 균주가 100%의 살비력을 보였다. 이 중 메타리지움 아니소플리애 432 및 메타리지움 펨피기 111 균주는 처리 후 5일에도 99% 이상의 높은 살비력을 보였다.
실시예 3. 곰팡이 포자의 열안정성
뿌리응애에 대해 살비력이 확인된 11개 균주의 포자의 열안정성을 비교 평가하였다. 45℃에서 1시간 열처리 한 결과, 메타리지움 아니소플리애 7개 균주와 메타리지움 핑샤엔스 1개 균주를 포함한 8개 균주가 97% 이상의 포자 발아율을 보이며 높은 안정성을 나타내었다. 45℃에서 2시간 동안 열처리 한 결과에서는 대부분의 균주가 낮은 열안정성을 보였으나, 메타리지움 아니소플리애 322, 432, 481, 4312의 4개 균주는 여전히 60% 이상의 포자발아율을 보였다. 특히, 메타리지움 아니소플리애 432 균주는 약 81%의 포자발아율을 보여 가장 높은 열안정성을 나타내었다.
이상의 결과들을 종합하여, 메타리지움 아니소플리애(M. anisopliae) 432 균주가 뿌리응애에 대해서 가장 높은 살비력과 포자의 열안정성을 가지고 있어 뿌리응애 방제에 가장 유용한 균주임을 확인하였다. 메타리지움 아니소플리애 432 균주는 농업생명공학연구원(Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에 2021년 08월 20일자로 기탁을 진행하였으며, 기탁기관으로부터 기탁번호 KACC 83053BP를 부여받았다.
<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation
<120> Metarhizium anisopliae 432 strain for controlling bulb mite and
uses thereof
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<213> Metarhizium anisopliae
<400> 1
agggatcatt accgagttat ccaactccca acccctgtga attatacctt taattgttgg 60
tttggcggga cttcgcgccc gccggggacc caaacctttt gaatttttta ataagtattt 120
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<210> 2
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<212> DNA
<213> Metarhizium anisopliae
<400> 2
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<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 3
tccgtaggtg aacctgcgg 19
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 4
tcctccgctt attgatatgc 20
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 5
cargaygtbt acaagatygg tgg 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 6
atgacaccra crgcracrgt ytg 23
Claims (5)
- 뿌리응애(Rhizoglyphus robini Claparede) 방제능 및 우수한 포자 열안정성을 가지는 메타리지움 아니소플리애(Metarhizium anisopliae) 432 균주(기탁번호: KACC 83053BP).
- 삭제
- 제1항의 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 뿌리응애(Rhizoglyphus robini Claparede) 방제용 조성물.
- 제3항의 조성물을 식물, 식물의 종자 또는 식물 식재 토양에 처리하는 단계를 포함하는, 뿌리응애(Rhizoglyphus robini Claparede) 방제 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 식물은 마늘, 쪽파, 양파, 감자 또는 백합인 것을 특징으로 하는, 뿌리응애(Rhizoglyphus robini Claparede) 방제 방법.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020210142671A KR102670639B1 (ko) | 2021-10-25 | 2021-10-25 | 뿌리응애 방제능을 가지는 메타리지움 아니소플리애 432 균주 및 이의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210142671A KR102670639B1 (ko) | 2021-10-25 | 2021-10-25 | 뿌리응애 방제능을 가지는 메타리지움 아니소플리애 432 균주 및 이의 용도 |
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|---|---|---|---|---|
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Family Cites Families (2)
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|---|---|---|---|---|
| KR101384515B1 (ko) * | 2011-12-29 | 2014-04-11 | 대한민국 | 메타리지움 애니소플리애를 이용한 꿀벌응애 구제용 조성물 및 이를 이용한 방제 방법 |
| KR101836007B1 (ko) * | 2016-11-29 | 2018-04-19 | 충북대학교 산학협력단 | 해충방제 및 항균활성을 가지는 곤충병원성 곰팡이 메타리지움 아니소플리애 sd4-2 균주 |
-
2021
- 2021-10-25 KR KR1020210142671A patent/KR102670639B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007112257A2 (en) | 2006-03-24 | 2007-10-04 | The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture | A strain of the fungus metarhizium anisopliae for controlling subterranean termites |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Systematic & Applied Acarology,제26권,6호,1149-1167면(2021.06.) 1부.* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20230058891A (ko) | 2023-05-03 |
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