CN105176835A

CN105176835A - 一株桉蝙蛾高毒力球孢白僵菌菌株及其筛选和鉴定方法

Info

Publication number: CN105176835A
Application number: CN201510550948.9A
Authority: CN
Inventors: 邹东霞; 史国英; 廖旺姣; 蒋学建; 吴耀军; 黄华艳; 黄乃秀
Original assignee: Guangxi Zhuang Autonomous Region Forestry Research Institute
Current assignee: Guangxi Zhuang Autonomous Region Forestry Research Institute
Priority date: 2015-09-01
Filing date: 2015-09-01
Publication date: 2015-12-23

Abstract

本发明公开了一株桉蝙蛾高毒力球孢白僵菌菌株及其筛选和鉴定方法，筛选出的高毒力球孢白僵菌<i>(Beauveria？bassiana(Balsamo)Vuillemin</i>)菌株,其代号为B-36，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC？NO．11057，通过室内毒力测定显示B-36菌株对桉蝙蛾具有较高的毒力，具有很好的开发利用价值,可为桉树蛀干害虫的防治提供了新的思路。

Description

一株桉蝙蛾高毒力球孢白僵菌菌株及其筛选和鉴定方法

技术领域

本发明属于微生物杀虫剂技术领域，尤其是一株桉蝙蛾高毒力球孢白僵菌菌株及其筛选和鉴定方法。

背景技术

白僵菌(Beauveriabassiana)是当前世界上研究和应用最广泛的一种虫生真菌之一，它具有致病力强、寄主范围广、不污染环境、使用方便、不伤害天敌、能持续控制害虫等特点。白僵菌目前已经被广泛应用于农林害虫的防治，可用于防治蛴螬、家蝇、介壳虫、白粉虱、蚜虫、蓟马、马铃薯叶甲、蜚蠊、蝗虫、蚱蜢、蟋蟀、棉铃象、棉跳盲蝽、玉米螟、天牛、甘蔗金龟子等害虫。多年来，国内应用白僵菌对40余种农林害虫的防治已经取得成功，如今在生产中使用的主要有：松毛虫、玉米螟、蛴螬、蝗虫、马铃薯甲虫、松褐天牛、白蚁、茶小绿叶蝉、桃小食心虫等。依据形态指标、生理生化指标及核酸指标将白僵菌属分为7个种，分别是球孢白僵菌、布氏白僵菌、白色白僵菌、多形白僵菌、蠕孢白僵菌、粘孢白僵菌和苏格兰白僵菌，其中最为常见和应用最广泛的是球孢白僵菌。

桉蝙蛾是近年来危害南方主要人工林树种桉树的主要蛀干害虫，该虫主要危害桉树主干，侧枝也有危害，轻则影响木材的生长，重则主干断裂导致死亡。目前为止，关于该虫的防治主要集中在化学农药的防治，化学农药的使用虽然见效快，但破坏了土壤结构，造成土壤污染不利于作物生长，长期使用使病虫有抗逆性从而影响了防治效果，而且给环境造成不良的影响。生物防治具有对环境友好且有持续控制害虫的作用，白僵菌作为生物防治的主要手段之一已被广泛应用用于数多种害虫的防治。据研究报道，白僵菌对桉蝙蛾的寄生率很高，有望成为控制该虫的生物防治手段。因此，研究桉蝙蛾高毒力白僵菌的筛选及鉴定等基础研究工作，对利用生物防治手段持续该虫意义重大，为蛀干害虫的防治提供了新的思路。

发明内容

本发明是通过从感染白僵菌的桉蝙蛾幼虫上分离纯化获得球孢白僵菌，经过和其他5株来源于桉蝙蛾的白僵菌在同等条件对桉蝙蛾的毒力测定，筛选出1株高毒力的B-36球孢白僵菌菌株，具有很大的开发应用价值。

本发明的目的是提供一株新的球孢白僵菌((Beauveriabassiana(Balsamo)Vuillemin)，代号为B-36。

本发明的另一目的是提供B-36球孢白僵菌的培养、筛选及鉴定方法。

为了实现以上目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明公开的球孢白僵菌菌株，代号B-36，于2015年7月7日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO.11057，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

本发明公开的B-36球孢白僵菌菌株的形态学特征和核糖体DNA-ITS测序如下：

形态特征：菌丝细长，菌丝宽度为1-3μm，透明无色，分支，有横隔膜，分生孢子梗为瓶状，由分支的菌丝长出分生孢子梗，分生孢子梗成直角分支，排列成“Z”字形或螺旋状，梗上长出圆柱形或瓶装的产孢结构，分生孢子产于产孢结构的顶端，分生孢子球形或椭圆形,分生孢子大小长为2.20-2.93μm，宽为1.62-2.03μm。

DNA-ITS测试结果：B-36球孢白僵菌菌株特异性核糖体DNA-ITS序列碱基数535bp，具体的氨基酸顺序为：

高毒力B-36球孢白僵菌菌株的筛选方法

从感染白僵菌的桉蝙蛾幼虫分离获得，采用常规的组织分离法分离和单孢分离法获得6株白僵菌菌株，具体如表1所示，分离后采用SDAY培养基在温度为25℃，湿度为95％培养8-12天，用钩针钩取一定量的孢子粉放入装有0.1％吐温的20mL无菌水中充分混匀，逐步稀释至1000倍，10000倍，100000倍，1000000倍，得到不同稀释倍数的菌液，由于浓度太高无法挑取单菌落，取上述后三个浓度的菌液50-100μL分别涂布于SDAY培养基平板，在温度为25-26℃，湿度为80-90％，pH值为6.0-7.0的培养箱培养，培养3-4天的过程中，待长出单个白色的菌落后，挑取单菌落转至另一个SDAY培养基平板上培养，培养过程中未发现有青霉等杂菌污染时，即可转移至SDAY试管培养基，培养2周后有大量分生孢子长出，即可得到白僵菌分生孢子粉，即可将试管贴好标签后转入4℃冰箱冷藏保存，保存半年左右后转管培养后继续保存。

将6株白僵菌菌株培养得到的分生孢子粉，用含有0.1％吐温-80的无菌水将将孢子洗下，调整孢子悬浮液的浓度为1.0×10⁷个/mL,将桉蝙蛾幼虫侵入孢子悬浮液中5s后拿出吸干虫体表面的水分，放入铺有湿润滤纸的玻璃瓶中，盖好瓶盖放入25℃，90％湿度条件下培养，每处理3个重复，每个重复12头幼虫，以侵入无菌水的处理为对照。逐日观察桉蝙蛾的死亡情况，统计死亡率，并计算致死中时LT₅₀值。

以各菌株的死亡率对应的几率值为纵坐标，以培养天数的对数值为横坐标，做线性回归方程，根据死亡率计算LT₅₀值，LT₅₀值越小毒力越大，从中筛选出高毒力的B-36球孢白僵菌。

上述SDAY培养基的制备方法：葡萄糖40g、蛋白胨10g、酵母粉10g、琼脂粉15-20g和水1L，PH值自然。制备过程：取上述称好的葡萄糖40g，蛋白胨10g,酵母粉10g加入1L水中，搅拌至溶解，在将琼脂粉加入上述溶液边搅拌边加热，待琼脂粉溶解后分装至250ml三角瓶内，0.1MPa压力下，121℃灭菌20-25min。

B-36球孢白僵菌的鉴定方法

将B-36球孢白僵菌于SDAY液体培养2周后，纱布过滤，收集菌丝至底部垫滤纸的灭菌的培养皿上，自然风干后放冰箱冷藏备用。将上述干菌丝放入灭菌研钵中，加入液氮充分研磨，采用北京康为世纪生物科技有限公司植物基因组DNA提取试剂盒提取DNA，步骤如下：

a.将研磨菌丝装入1.5ml离心管，加入700μL65℃预热的BufferGP1,迅速颠倒混匀后，将离心管置于65℃水浴20min，期间颠倒离心管数次。

b.接入700μL氯仿，充分混匀，12000rpm离心5min。

c.将上清液转入一新的离心管,加入700μLGP2,充分混匀。

d.将步骤3所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，室温放置3min，若以此不能加完溶液，可分多次转入，10000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱重新放回收集管中。

e.向吸附柱中加入500μLBufferGW1，10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

f.向吸附柱中加入500μLBufferGW2，10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

g.12000rpm离心2min,倒掉收集管中的废液，将吸附柱置于室温4min，以彻底晾干。

h.将吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入50-100Buffer灭菌水，室温放置3min,10000rpm离心1min，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。

rDNA-ITS片段PCR扩增及测序

采用通用引物

ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')，

ITS5(5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3')进行扩增；

PCR反应体系如下：

2×ExTaqMasterMix25μL，ForwardPrimer2μL，ReversePrimer2μL,TemplateDNA1μL,RNase-FreeWater25μL.在PCR仪上进行扩增。

PCR反应程序如下：

反应混合液在94℃预变性2min；然后进入循环，94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物送上海立菲生物技术公司广州测序部测序。

将测序的结果与NCBI基因数据库的菌株序列进行比对结果显示：

经引物ITS序列获得B-36菌株核糖体DNA-ITS的长度为535bp,与NCBI数据库的一株球孢白僵菌的同源性达到100％。

与现有技术相比，本发明的优点及有益效果为：

本发明从桉蝙蛾中分离、筛选出的B-36球孢白僵菌菌株，其具有很高的毒力，可用于防治桉蝙蛾，是一种无公害、环保和害虫生物防治措施，B-36球孢白僵菌菌株具有很大的开发利用价值，可为桉树蛀干害虫的防治提供了新的思路。

附图说明

图1为B-36球孢白僵菌的系统发育图。

具体实施方式

下面将结合具体实施方式对本发明进一步说明，但不限于本发明保护范围。

实施例1白僵菌菌株的分离和纯化

采用常规组织分离法及单孢分离法从感染白僵菌的桉蝙蛾幼虫共分离获得6株白僵菌菌株，具体如下所示：

表1.分离获得的桉蝙蛾白僵菌菌株

菌株编号	地理来源
		B-36	广西玉林市福绵区
B-41	广西玉林市福绵区
		B-42	广西玉林市福绵区
B-46	广西玉林市福绵区
		B-76	广西兴业县
B-77	广西武鸣县

实施例2高毒力B-36球孢白僵菌菌株的筛选

主要材料：6个菌株的白僵菌分生孢子粉、SDAY培养基、老熟桉蝙蛾幼虫、1％吐温灭菌水、灭菌底部铺有双层滤纸的玻璃瓶、恒温恒湿培养箱、超净工作台、全自动高温高压灭菌锅、取液器，培养皿、血球计数板和显微镜。

SDAY培养基的制备方法：葡萄糖40g、蛋白胨10g、酵母粉10g、琼脂粉15-20g和水1L，PH值自然。制备过程：取上述称好的葡萄糖40g，蛋白胨10g,酵母粉10g加入1L水中，搅拌至溶解，在将琼脂粉加入上述溶液边搅拌边加热，待琼脂粉溶解后分装至250ml三角瓶内，0.1MPa压力下，121℃灭菌20-25分钟。

将上述分离的6株白僵菌菌株采用SDAY培养基在温度为25℃，湿度为95％培养10天，用钩针钩取一定量的孢子粉放入装有0.1％吐温的20ml无菌水中充分混匀，得到不同稀释倍数的菌液，取上述菌液50-100μL涂布于SDAY培养基平板，在温度为26℃，湿度为90％，pH值为7.0的培养箱培养，培养4天的过程中，待长出单个白色的菌落后，挑取单菌落转至另一个SDAY培养基平板上培养，培养过程中未发现有青霉等杂菌污染时，即可转移至SDAY试管培养基，培养2周后有大量分生孢子长出，即可得到白僵菌分生孢子粉，即可将试管贴好标签后转入4℃冰箱冷藏保存，保存半年左右后转管培养后继续保存。

对各菌株导致桉蝙蛾的死亡率(％)及致死的天数(d)的数据，采用DPS数据处理系统数量型数据几率值分析计算LT₅₀值，其结果如表2所示。

编号	回归方程	相关系数	LT50
				B-36	y＝11.4988x-4.7578	0.967658	7.06
B-77	y＝10.5002x-4.2433	0.974791	7.59
				B-46	y＝13.1154x-6.8621	0.986844	8.02
B-76	y＝13.9158x-7.6773	0.974718	8.15
				B-42	y＝14.8710x-8.9975	0.99188	8.73
B-41	y＝8.1105x-3.0621	0.970578	9.86

从表中可以看出，各菌株LT₅₀值不同，LT₅₀值越小毒力越大，各菌株的毒力的大小顺序是B-36＞B-77＞B-46＞B-76＞B-42＞B-41，其中B-36的毒力大于其他5株，LT₅₀值为7.06，具有很强的毒性，有较好的开发利用价值。

实施例3B-36球孢白僵菌菌株的形态学特征

方法：采用载玻片培养法，在显微镜下直接观察，孢子萌发产孢结构及产孢方式，采用显微成像系统拍照并测量菌丝的宽度及孢子的大小。

观察结果:菌丝细长，透明无色，分支，有横隔膜，分生孢子梗为瓶状，由分支的菌丝长出分生孢子梗，分生孢子梗成直角分支，排列成“Z”字形或螺旋状，梗上长出圆柱形或瓶装的产孢结构，分生孢子产于产孢结构的顶端，分生孢子球形或椭圆形。

观察结果：菌丝细长，菌丝宽度为1-3μm，透明无色，分支，有横隔膜，分生孢子梗为瓶状，由分支的菌丝长出分生孢子梗，分生孢子梗成直角分支，排列成“Z”字形或螺旋状，梗上长出圆柱形或瓶装的产孢结构，分生孢子产于产孢结构的顶端，分生孢子球形或椭圆形,分生孢子大小长为1.62-2.03μm，宽为2.20-2.93μm。

实例4B-36的分子鉴定

方法：将分离的菌株B-36于SDAY液体培养2周后，纱布过滤，收集菌丝至底部垫滤纸的灭菌的培养皿上，自然风干后放冰箱冷藏备用。将上述干菌丝放入灭菌研钵中，加入液氮充分研磨，采用北京康为世纪生物科技有限公司植物基因组DNA提取试剂盒提取DNA，步骤如下：

b.接入700μL氯仿，充分混匀，12000rpm离心5min。

c.将上清液转入一新的离心管,加入700μLGP2,充分混匀。

d.将步骤3所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，室温放置3min，若以此不能加完溶液，可分多次转入。10000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱重新放回收集管中。

rDNA-ITS片段PCR扩增及测序：采用通用引物ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')、ITS5(5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3')进行扩增，PCR反应体系如下：2×ExTaqMasterMix25μL，ForwardPrimer2μL，ReversePrimer2μL,TemplateDNA1μL,RNase-FreeWater25μL.在PCR仪上进行扩增。反应程序如下：反应混合液在94℃预变性2min；然后进入循环，94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物送上海立菲生物技术公司广州测序部测序，测序结果如下：

将上述得到的测序结果，将拿到的正反双向序列用MEGA5.2软件进行拼接校对，然后登陆NCBI数据库，用BLAST进行序列的同源性比对，找出与测定序列同源性最高的基因序列及其基因库登录号，用MEGA5.2软件的邻接法构建系统发育树，其结果见附图1。

表3.B-36白僵菌菌株DNA-ITS测序及同源性比对结果

结论：经过对B-36球孢白僵菌核糖体DNA-ITS特异性片段序列的测定与NCBI数据库的同源性比对，B-36球孢白僵菌菌株核糖体DNA-ITS的长度为535bp,与NCBI数据库的一株球孢白僵菌(基因库登录号为GU989641.1)的同源性达到100％。经过对B-36球孢白僵菌构建系统发育树，并选取GenBank中的几株虫生真菌的ITS序列，以绿僵菌为外群，用MEGA4.0软件邻接法构建系统发育树(图1)，从附图中可以看出，B-36与球孢白僵菌聚在一起，与其他白僵菌菌株形成明显的分支，结合形态学及分子生物学鉴定结果，将B-36鉴定为球孢白僵菌(Beauveriabassiana(Balsamo)Vuill)。

实例5高毒力菌株对家蚕的致病力测定

1.1材料

培养14d的球孢白僵菌菌株B-36孢子粉，1％吐温灭菌水，喷壶，三龄家蚕幼虫，新鲜桑叶，不锈钢托盘。

1.2研究方法

将孢子粉用1％吐温灭菌水配置成孢子悬浮液，浓度分别为3.0×10⁹个/mL，3.0×10⁸个/mL，3.0×10⁷个/mL，3.0×10⁶个/mL，3.0×10⁵个/mL,将悬浮液分别用喷雾器均匀喷洒在桑叶的正反两面，风干后放在不锈钢托盘中喂养三龄家蚕幼虫，对照组桑叶喷水处理，每个处理20头，每处理重复3次，每天观察家蚕的死亡情况,计算校正死亡率。

结果与分析：

接种4天后，有家蚕开始死亡，接种8天后接种浓度为3.0×10⁹个/ml的家蚕死亡率92.59％，僵虫率86.67％，对照及其他处理也有少数家蚕死亡，但是僵虫率很少甚至没有僵虫，结果如表4。

表4接种8天后家蚕的死亡率

浓度	校正死亡率(％)	僵虫率(％)
			3.0×10⁹个/ml	92.59	86.67
3.0×10⁸个/ml	2.47	6.67
			3.0×10⁷个/mL	3.70	0
3.0×10⁶个/mL	2.71	0
			3.0×10⁵个/mL	3.09	0
对照	10	0

结论：球孢白僵菌菌株B-36高浓度对家蚕致病力高，低浓度对家蚕基本无致病力。

核苷酸序列表

Claims

1.一株球孢白僵菌(Beauveriabassiana(Balsamo)Vuillemin)菌株，其特征在于：球孢白僵菌菌株的代号为B-36，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO.11057，保藏时间为2015年7月7日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

2.根据权利要求1所述一株球孢白僵菌菌株，其特征在于：所述B-36球孢白僵菌菌株的特异性核糖体DNA-ITS序列碱基数为535bp，具体的氨基酸顺序为：