CN109401981B - 金龟子绿僵菌ippmhbhc-7及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种金龟子绿僵菌IPPMHBHC‑7及其应用。金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)IPPMHBHC‑7，保藏编号为CGMCC No.15999，其对于亚洲小车蝗、毛足棒角蝗具有良好的半数致死时间和僵虫率。

Description

金龟子绿僵菌IPPMHBHC-7及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种金龟子绿僵菌IPPMHBHC-7及其应用。
背景技术
蝗虫为直翅目蝗科灾害性昆虫，蝗灾频繁的在我国发生，给我国农业造成了巨大的伤害。目前，我国控制草原蝗虫危害的手段主要是采用化学防治法，其具有快速、高效、使用灵活等优点，但是，随着人们越来越重视环境经济的可持续发展，生物治蝗方法被研发出来并运用到实际工作中去。生物灭蝗法，特别是绿僵菌、白僵菌等，具有一定的专一性，对人畜无害，同时还具有不污染环境、无残留、害虫不会产生抗药性等优点。
虽然杀虫真菌防治蝗虫具有一定的防治效果，但是真菌击倒、杀死害虫作用缓慢，需要经过一段时间才能起作用，适合一般发生年份防治应用，而在蝗虫大发生年份，或局部地区严重发生时，杀虫真菌不能短时间内快速降低虫口密度。同时，生产实践和应用过程中发现一些菌株常出现一定程度的退化，表现为经过几代人工培养后，菌落不稳定、气生菌丝徒长、产孢量减少等特点，从而影响防治效果。
发明内容
为了解决现有技术中存在的真菌击倒、杀死害虫作用缓慢等问题，本发明提供一种金龟子绿僵菌IPPMHBHC-7及其应用。
本发明的目的在于提供一种金龟子绿僵菌IPPMHBHC-7。
本发明的再一目的在于提供金龟子绿僵菌IPPMHBHC-7的应用。
本发明的再一目的在于提供含有金龟子绿僵菌IPPMHBHC-7的生防制剂。
本发明的再一目的在于提供利用金龟子绿僵菌IPPMHBHC-7防治蝗虫的方法。
根据本发明具体实施方式的金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)IPPMHBHC-7，其保藏编号为CGMCC No.15999，该菌株于2018年8月2日保存于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所。
根据本发明具体实施方式的生防制剂，可将金龟子绿僵菌IPPMHBHC-7制成孢子粉直接施用，或者与其他化学药品联用使用。
根据本发明的具体实施方式的防治蝗虫的方法，包括向田间播撒或喷洒含有金龟子绿僵菌IPPMHBHC-7的农用制剂。
本发明的金龟子绿僵菌IPPMHBHC-7对毛足棒角蝗致死时间分别为3.59d，僵虫率分别为96.67％，对亚洲小车蝗的半致死时间为3.55d，僵虫率为93.33％，因此，本发明的金龟子绿僵菌IPPMHBHC-7具有较好的应用前景。
附图说明
图1显示绿僵菌的菌落及孢子形态；
图2显示9种绿僵菌对毛足棒角蝗15d的校正累计死亡率曲线；
图3显示9种绿僵菌对亚洲小车蝗15d的校正累计死亡率曲线。
金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)IPPMHBHC-7，其保藏编号CGMCCNo.15999，该菌株于2018年8月2日保存于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所。
具体实施方式
本发明菌株来源：
本发明测试9种绿僵菌(Metarhizium anisopliae)菌株，分别编号为：
①IPPBHC-5；
②IPPMHBHC-7；
③IPPMHK-7；
④IPPM189；
⑤IPPM803；
⑥IPPM200614；
⑦IPPM2010-10；
⑧IPPB054；
⑨IPPMC384；
本发明试虫的来源：
①毛足棒角蝗(Dasyhippus barbipes Fischer-Waldheim)：2～3龄蝗蝻，扫网法采集于内蒙古锡林郭勒盟白云库伦蝗区。
②亚洲小车蝗(Oedaleus decorus asiaticus B.Bienko)：2～3龄蝗蝻，扫网法采集于内蒙古锡林郭勒盟西乌旗巴彦高勒北7公里处蝗区。
采集的蝗虫饲养于试验站内专门用于养蝗虫的大框中，每天饲喂适量的新鲜羊草叶片。为保证试验效果，试验前一天饥饿处理。
实施例1绿僵菌IPPMHBHC-7的筛选与鉴定
采用大蜡螟诱集法从收集的土壤中诱集绿僵菌菌株。用消毒的废胶卷盒装入供试土样，每盒埋人1头大蜡螟，重复3次。土样盒放置在24～27℃，保湿诱集1周后，拣出死虫，在恒温25～26℃，相对湿度100％RH中培养7～10天后，从僵虫上分离目标菌株，菌株分离用培养基为PDAY。
将分离到的绿僵菌接种到PDAY固体培养基上，培养至产孢，如图1所示，左图显示绿僵菌的菌落形态，右图显示绿僵菌的孢子形态。孢子粉用0.1％吐温水悬浮，漩涡振荡器振荡均匀，调整孢子浓度为1×108个/mL。取1mL孢子悬浮液接种到100mL产菌丝培养基，置28℃、200r/min摇床振荡培养3d至对数期。用真空泵抽滤得到菌丝，取1g菌丝用液氮研磨至粉末，提取基因组DNA。
以基因组DNA为模板，设计特异性引物扩增IPPMHBHC-7菌株的ITS1-5.8SrRDNA-ITS2序列。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，用胶回收试剂盒回收目的片断，克隆至pGEM-T Easy Vector载体，转化至Trans-T1Phage Resistant感受态细胞中，在氨苄青霉素平板上通过蓝白斑筛选转化子，经PCR检测后，测序。将测定的序列在GenBank中进行BLAST分析，确定菌株IPPMHBHC-7为绿僵菌菌株。
实施例2绿僵菌对毛足棒角蝗蝻致病力的生物测定
采用胃毒法测定上述9种绿僵菌菌株对蝗虫的毒力效果。
首先秤取0.2g绿僵菌孢子粉加入2.0g麦麸中，再加入0.1ml食用油，充分搅拌均匀。然后秤取0.2g配好的绿僵菌麦麸饵剂放入培养皿中，连同培养皿一起放入盖玻璃板的养虫筐，编号，再在养虫筐中放入20头大小一致的3龄毛足棒角蝗蝻。空白对照组麦麸饵剂中不加绿僵菌孢子粉。本实验共10种绿僵菌孢子粉以及一个对照CK，每种孢子粉设置3次重复，即共33个处理，于养虫室内饲养。第二天将饵剂取出，之后每天饲喂适量的新鲜羊草，并调查每筐蝗蝻的死亡情况，分别做好记录。
将死亡的蝗蝻拣出分别放入对应编号的垫有滤纸的培养皿中，保持一定湿度，使之长出僵虫。待试验蝗蝻全部死亡后调查每种菌处理后的蝗蝻的僵虫率，结合处理后15日内每日的累积死亡率和半致死时间(LT50)挑选出对蝗虫致死作用较好的菌种。
Figure GDA0001938478120000031
Figure GDA0001938478120000041
9株绿僵菌菌株对3龄毛足棒角蝗蝻致病力的生物测定结果见图2、表1。
表1 9种绿僵菌对毛足棒角蝗致病力的比较
Figure GDA0001938478120000042
由表1分析可知，上述9种供试菌株对蝗蝻均有致病性，半致死时间在3.59d～8.83d之间，僵虫率在43.33％～96.67％之间，其中绿僵菌菌株IPPMHBHC-7的半致死时间为3.59d，僵虫率分别为96.67％，而绿僵菌菌株IPPM803、IPPM200614、IPPM2010-10等菌株半致死时间稍长、僵虫率较低。因此，绿僵菌菌株IPPMHBHC-7与绿僵菌菌株IPPM803、IPPM200614比较存在显著差异，表明菌株IPPMHBHC-7对毛足棒角蝗有较高的致病力。
实施例3.绿僵菌对亚洲小车蝗致病力的生物测
测定9株菌株对亚洲小车蝗的治病力，测定方法同实施例2的方法。
9株绿僵菌菌株对亚洲小车蝗致病力的生物测定结果见图3、表2。
表2 9种绿僵菌对亚洲小车蝗致病力的比较
Figure GDA0001938478120000043
由表2分析可知，供试菌株对蝗蝻均有致病性，半致死时间在3.55d～10.67d之间，僵虫率在38.33％～93.33％之间。其中菌株IPPMHBHC-7的半致死时间为3.55d，僵虫率为93.33％。与菌株IPPM200614等相比，菌株IPPMHBHC-7的差异显著，表明其对亚洲小车蝗有较高的致病力。
实施例4.绿僵菌不同菌株生长速率和产孢量测定
将不同的绿僵菌菌株孢子稀释到相同的2.5x108孢子/克，分别取10ul转接到PDAY固体平板上，将平板置于27℃培养箱中培养，从第4天开始，每两天测定一次菌落直径。
表3不同绿僵菌菌株的生长速率比较
Figure GDA0001938478120000051
如表3所示，IPPMHBHC-7的生长速率明显高于目前生产上常用的对照菌株IPPM189和其他4个绿僵菌野生菌株。
将不同绿僵菌菌株转接到PDAY固体平板上，在室内连续培养5代，每代培养至15天(约产孢后10天)，测定其产孢量，结果见表4。
表4不同绿僵菌菌株的产孢量比较
Figure GDA0001938478120000052
如表4所示，连续培养多代后，金龟子绿僵菌IPPMHBHC-7仍然具有较好的产孢量，而且产孢性状稳定，与生产用对照菌株没有显著差异。

Claims (5)

1.金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)IPPMHBHC-7，其特征在于，所述金龟子绿僵菌的保藏编号为CGMCC No.15999。
2.根据权利要求1所述的金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)IPPMHBHC-7在防治蝗虫中的应用。
3.根据权利要求2所述的金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)IPPMHBHC-7在防治蝗虫中的应用，其特征在于，所述蝗虫为亚洲小车蝗或毛足棒角蝗。
4.一种蝗虫生物防治剂，其特征在于，所述蝗虫生物防治剂包含权利要求1所述的金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)IPPMHBHC-7。
5.一种防治蝗虫的方法，其特征在于，所述方法中包含使用权利要求1所述的金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)IPPMHBHC-7防治蝗虫的步骤。
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