CN109055238B - 一株对植物病原菌有抑制作用的黄柄曲霉菌菌株tr32及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株对植物病原菌有抑制作用的黄柄曲霉菌菌株TR32及其应用。本发明通过筛选获得的菌株TR32，经鉴定确定其分类命名为黄柄曲霉菌Aspergillus flavipes，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2018504。本发明经过对禾谷镰刀菌、苹果腐烂病菌、苹果轮纹病菌、链格孢菌等常见植物病原菌的抑菌实验，证明本发明获得的菌株TR32具有对多种植物病原菌的广谱高效抑制作用，可以将其制备成防治多种植物病原菌的生防制剂，具有良好的市场应用前景。

Description

一株对植物病原菌有抑制作用的黄柄曲霉菌菌株TR32及其 应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株对植物病原菌有抑制作用的黄柄曲霉菌菌株TR32及其应用。

背景技术

联合国粮农组织(FAO)估计，世界上农作物的产量因病虫杂草的危害造成的损失约40％左右(4400-5500亿元)，对树木的影响更是难以估计。通过全世界从事病虫害研究的科学家和各类技术推广人员的工作挽回的损失达到3000-4000亿元。长期以来，化学防治一直是防控植物病害的主要手段。化学农药的大量长期使用不仅导致抗性问题的产生，而且会造成药剂残留，杀伤非靶标生物，污染生态环境，并最终经过生物富集对人体产生危害。为解决以上问题，植物病害的生物防治成为研究热点。

生物防治是植物病害防治的重要措施之一，生防菌通过诱导寄主植物抗病性的产生或者通过对植物病原菌的拮抗作用而到达防治或减轻病害的目的。目前已有木霉菌、枯草芽胞杆菌、沙雷氏菌、链霉菌等多种微生物对灰霉病菌拮抗作用的相关报道。生物菌剂或制剂可以减少或替代化学农药的使用，从而既能有效防治病害，又可避免化学农药的使用带来的负面效应。

生物源农药的应用是是植物病害生物防治的重要措施之一。从我国生物源农药的整体发展来看，微生物农药有效成分登记的数量最多。长期以来，微生物农药的研发一直以陆生生物资源为主，由于生防真菌次级代谢产物丰富，产量高，易于筛选、分离、培养等优点，成为天然产物研究的一类最为重要的资源。

发明内容

本发明的目的在于提供了一株对植物病原菌有抑制作用的黄柄曲霉菌菌株TR32及其应用。本发明通过筛选获得了一株能够强烈抑制植物病原菌菌丝生长的黄柄曲霉菌菌株TR32，通过生防真菌与植物病原菌共培养实验，该菌株的发酵液对多种植物病原菌的防治效果较强，实验结果证明该菌株或其制剂对常见植物病原菌的防治具有广阔的应用前景。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一株对植物病原菌有抑制作用的黄柄曲霉菌菌株TR32，其分类命名为黄柄曲霉菌Aspergillus flavipes，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2018504。

所述菌株TR32在PDA上生长时，菌丝白色呈丝绒状，偶有大滴浅褐色透明液渗出；分生孢子结构多，初期为浅黄褐色，后期为粉红肉桂色；菌落背面呈黄褐色，菌株形成柔软的细胞团块，后期在菌落背面呈深褐色；分生孢子梗顶囊近球形或卵形，孢子梗茎稍弯曲，呈浅褐色。

本发明还提供了所述的黄柄曲霉菌菌株TR32在制备防治植物病原菌的生防制剂中的应用。

对上述技术方案的进一步改进：所述植物病原菌包括苹果轮纹病菌、禾谷镰刀菌、牡丹拟盘多毛孢菌、尖孢镰刀菌、细极链格孢菌和链格孢菌。

对上述技术方案的进一步改进：所述黄柄曲霉菌菌株TR32的发酵物配制的发酵滤液对植物病原菌菌丝的生长具有抑制作用。

对上述技术方案的进一步改进：所述发酵滤液中发酵物的浓度为1mg/ml以上对植物病原菌菌丝生长具有较强抑制作用。

对上述技术方案的进一步改进：所述黄柄曲霉菌菌株TR32的发酵物用DMSO配制成发酵滤液。

对上述技术方案的进一步改进：所述黄柄曲霉菌菌株TR32的发酵物的制备步骤为：将所述菌株TR32接种到PDB培养基中在25℃-28℃下震荡培养，然后减压抽滤、超声破碎、萃取、分液、旋蒸、烘干后获得菌株TR32的发酵物。

对上述技术方案的进一步改进：所述旋蒸的温度为36-38℃。

与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明筛选到对植物病原菌具有抑制作用的菌株TR32，经分类鉴别为黄柄曲霉菌，并将其发酵液与多种植物病原菌共培养实验，证明本发明获得的菌株TR32具有对多种植物病原菌的较强抑制作用，可以将其制备成防治植物病原菌的生防制剂，具有良好的市场应用前景。

附图说明

图1是菌株TR32菌落的正面图。

图2是菌株TR32菌落的背面图。

图3是菌株TR32的分生孢子梗及分生孢子的显微观察图。

图4是本发明所述TR32菌株的发酵液与植物病原菌共培养的实验结果。

图5是本发明所述TR32菌株的发酵液与禾谷镰刀菌等三种病原菌混合培养产生的形态变化。

图6是本发明所述TR32菌株的发酵液链格孢菌等三种病原菌混合培养产生的形态变化。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细的描述。

实施例1

一、菌株的筛选

用打孔器在生防真菌和指示菌的平板上打出菌饼，直径约6mm。用挑针挑取菌饼，有菌丝的一侧朝下，将其接种在直径为9cm的培养基平板上，接种位置距培养皿边缘3cm，一侧为生防真菌，另一侧为指示菌。将接种好的平板放置在恒温培养箱中，28℃，黑暗条件下培养。每隔24小时观察一次，有抑菌带出现记为有生防作用。

筛选出有生防作用的真菌菌株，按上述方法将这些真菌与禾谷镰刀菌做对峙培养，每个处理三个重复，半径平均值记为R。对照组除了不接种海洋真菌，其它处理相同。每隔24小时观察一次，拍摄照片并记录数据。抑菌率计算方法：抑菌率(％)＝(对照组菌落半径-实验组菌落半径)/对照组菌落半径×100％。通过此方法筛选出生防菌株TR32。

所述生防菌株TR32的菌落正面图如图1所示，菌落背面图如图2所示，分生孢子梗及分生孢子如图3所示，从图中可以看出，所述菌株TR32在PDA上生长时，菌丝白色呈丝绒状，偶有大滴浅褐色透明液渗出；分生孢子结构多，初期为浅黄褐色，后期为粉红肉桂色；菌落背面呈黄褐色，菌株形成柔软的细胞团块，后期在菌落背面呈深褐色；分生孢子梗顶囊近球形或卵形，孢子梗茎稍弯曲，呈浅褐色。

二、TR32菌株的分类鉴定

1.分子鉴定：

利用引物扩增所属菌株TR32的rDNA-ITS序列，

1)引物ITS1/ITS4

ITS1∶5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′(SEQ ID NO：2)；

ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′(SEQ ID NO：3)；

2)PCR反应体系为25μL，反应液为：10×buffer 2.5μL，dNTP 1μL，引物(ITS1和ITS4)各1μL，Taq酶0.5μL，DNA模板3μL，ddH2O 16μL。

PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸1min，进行30个循环；72℃总延伸10min。

在质量浓度为1％的琼脂凝胶上检测PCR结果，进行TA克隆，挑取单菌落送往生工生物工程(上海)股份有限公司测序，并进行BLAST同源性对比。

3)经测序，所述菌株TR32的rDNA-ITS片段序列如下：

rDNA-ITS序列(SEQ ID NO：1)：

TCCGTAGGTGAACCTTGCGGCTCGTGGCCCACCTCCCACCCGTGACTACTGTACCACTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCAGCGTCTGCTGGCCGCCGGGGGGCTTCTGCCCCCGGGCCCGTGCCCGCCGGAGACCCCAACACGAACACTGTTTCTGAAAGCCTGTATGAATCCGATTCTTTGTAATCAGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTACTGCCCTCAAGCCCGGCTTGTATTGGGTCCTCGTCCCCCCGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCCAGCCCACGCATCACCTTTTTTTCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA。

4)结论：经过NCBI数据库比对，待检测TR32菌株与黄柄曲霉菌(Aspergillusflavipes)，GenBank：NR_135397.1的序列一致性为99％，所以待检测TR32菌株确定为黄柄曲霉菌。

将本发明筛选到的TR32菌株进行菌种保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；保藏地址：湖北省武汉市武昌珞珈山，武汉大学保藏中心；保藏日期：2018年7月30日，黄柄曲霉菌Aspergillus flavipes的保藏编号为CCTCC M 2018504。

三、TR32菌株对植物病原菌的生防实验

1、TR32菌株的发酵滤液的制备

所述黄柄曲霉菌菌株TR32的发酵物的制备步骤为：将所述菌株TR32接种到PDB培养基中在25℃-28℃下震荡培养7d，然后经减压抽滤、超声破碎、萃取、分液、旋蒸、烘干后获得含有TR32菌的发酵物，旋蒸的温度为36-38℃。

将所述菌株TR32的发酵物用DMSO溶液配制成发酵滤液。

2、TR32菌株的发酵滤液对常见植物病原菌菌丝的抑制作用

实验方法：

(1)用50％的DMSO溶液将上述制得的TR32菌株的发酵物分别配制成100mg/ml、40mg/ml、20mg/ml的浓度，作为待测液。

(2)配制50ml的PDB培养基装入250ml容量三角瓶内，灭菌待用。

(3)在超净工作台内，洗涤并刮取供试病原真菌的菌丝加入培养基内，28℃，180r/min，黑暗条件下在摇床培养3天得到菌悬液母液。将母液稀释50倍得到供试菌悬液。

(4)在无菌96孔培养板孔内加入5ul待测液，95ul的供试菌悬液，则每种待测液的实际浓度为5mg/ml、2mg/ml、1mg/ml，每个浓度的待测液做三个重复。对于相应的供试菌悬液，其对照组加入5ul的50％DMSO溶液，另加入95ul的供试菌悬液。

(5)做好标记，将其放入28℃的恒温培养箱培养，每隔24小时观察菌落生长状况。48小时后对菌落进行拍照记录，并在显微镜下观察菌丝变化。

待测试的多种植物病原菌如下：

(1)苹果腐烂病菌：苹果树腐烂病是苹果树最主要、最严重的枝干病害。该病除了侵染枝干外还可以侵染果实，造成枯枝、死树，严重时造成毁园，从而造成严重的产量和经济损失。苹果树腐烂病菌拥有比较广泛的寄主植物，危害包括苹果、楼桃、桃和梨等在内的常见果树。

(2)苹果轮纹病菌：苹果轮纹病又名粗皮病、轮纹烂果病，是苹果枝干部和果实上的重要生物灾害，常引起苹果枝干树皮粗糙、局部性坏死和果实腐烂。患病植株坐果率低，导致树体衰弱和产量减少，甚至绝产毁园。近年来，随着易感品种富士苹果的大面积栽培，苹果轮纹病发病率逐年增加，危害面积不断扩大，已成为中国苹果生产中的严重病害，严重威胁着苹果产业的可持续发展。

(3)禾谷镰刀菌：赤霉病是一种毁灭性病害，可引起穗腐，造成严重减产和品质降低，而禾谷镰刀菌是引起小麦赤霉病的主要病原菌。随着全球气候变暖、耕作制度和方式的改变，小麦赤霉病不断蔓延扩展，常常造成小麦减产、品质降低，且受侵染的小麦籽粒中含有真菌毒素，可引起人畜中毒和严重疾病。该病菌除危害小麦外，还能侵染大麦、燕麦、水稻、玉米等多种禾本科作物以及鹅冠草等禾本科杂草，此外，还可侵染大豆、棉花、红薯等作物。

(4)牡丹拟盘多毛孢菌：牡丹灰斑病是牡丹主要病害之一，是由牡丹拟盘多毛孢菌侵染所致。

(5)尖孢镰刀菌：枯萎病又名萎蔫病、蔓割病、死秧病，是一种由土壤传染，从根或根颈部侵入，在维管束内寄生的系统性病害(导管型枯萎病)，是黄瓜生产上较难防治的病害之一，常造成较大损失。枯萎病的病原菌为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，可以引起果蔬、经济作物等土传病害。

(6)链格孢菌：是全球分布最广，经济上重要的半知菌类真菌之一。95％以上的种类兼性寄生于植物上，引起多种植物叶部病害，细极链格孢就是其中一种，可以引起玉兰、广玉兰、三叶木通等园林植物的叶斑病，严重降低了观赏价值。链格孢菌侵染粮食类作物时，也会造成田间和产后巨大的经济损失，同时链格孢还会引起水果腐霉病。

实验结果如表1所示，菌株TR32的发酵滤液各个浓度对牡丹拟盘多毛孢菌、尖孢镰刀菌、链格孢菌、细极链格孢菌均表现出较强或明显的抑菌活性；5mg/ml的浓度对苹果轮纹病菌、禾谷镰刀菌的生长表现出明显的抑制作用，其它浓度表现的抑菌活性一般或仅表现出有抑菌活性；其发酵产物的待测液对苹果腐烂病菌的抑制作用不明显。发酵液浓度越高，对病原菌生长的抑制作用越明显。菌落生长状况如图4所示。

表1菌株TR32发酵产物对不同病原菌的抗菌活性

注：(++++：抑菌效果较强；+++：抑菌效果明显；++抑菌效果一般；+有抑菌效果；-：无抑菌效果)

3、TR32菌的发酵液对植物病原菌菌丝的影响：

实验方法：共培养后，挑取菌丝在显微镜下10×40倍镜下观察菌丝形态变化。实验结果如图5-图6所示，菌丝会产生瘤状物，或产生分枝增多、软化聚集、老化、溶解等形态变化。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一株对植物病原菌有抑制作用的黄柄曲霉菌菌株TR32及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 563

<212> DNA

<213> 黄柄曲霉菌(Aspergillus flavipes) TR32

<400> 1

tccgtaggtg aaccttgcgg ctcgtggccc acctcccacc cgtgactact gtaccactgt 60

tgcttcggcg ggcccgccag cgtctgctgg ccgccggggg gcttctgccc ccgggcccgt 120

gcccgccgga gaccccaaca cgaacactgt ttctgaaagc ctgtatgaat ccgattcttt 180

gtaatcagtt aaaactttca acaatggatc tcttggttcc ggcatcgatg aagaacgcag 240

cgaaatgcga taactaatgt gaattgcaga attcagtgaa tcatcgagtc tttgaacgca 300

cattgcgccc cctggtattc cggggggcat gcctgtccga gcgtcattac tgccctcaag 360

cccggcttgt attgggtcct cgtccccccg gggacgggcc cgaaaggcag cggcggcacc 420

gcgtccggtc ctcgagcgta tggggctttg tcacccgctc tgtaggcccg gccggcgcca 480

gcccacgcat cacctttttt tcaggttgac ctcggatcag gtagggatac ccgctgaact 540

taagcatatc aataagcgga gga 563

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcctccgctt attgatatgc 20

Claims (7)

1.一株对植物病原菌有抑制作用的黄柄曲霉菌菌株TR32，其特征在于：其分类命名为黄柄曲霉菌Aspergillus flavipes，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCM 2018504。

2.权利要求1所述的黄柄曲霉菌菌株TR32在制备防治植物病原菌的生防制剂中的应用，其特征在于：所述植物病原菌为苹果轮纹病菌、禾谷镰刀菌、牡丹拟盘多毛孢菌、尖孢镰孢菌和链格孢菌。

3.根据权利要求2所述的黄柄曲霉菌菌株TR32在制备防治植物病原菌的生防制剂中的应用，其特征在于：所述黄柄曲霉菌菌株TR32的发酵物配制的发酵滤液对植物病原菌菌丝的生长具有抑制作用。

4.根据权利要求3所述的黄柄曲霉菌菌株TR32在制备防治植物病原菌的生防制剂中的应用，其特征在于：所述发酵滤液中发酵物的浓度为1mg/ml以上对植物病原菌菌丝生长具有较强抑制作用。

5.根据权利要求3所述的黄柄曲霉菌菌株TR32在制备防治植物病原菌的生防制剂中的应用，其特征在于：所述黄柄曲霉菌菌株TR32的发酵物用DMSO配制成发酵滤液。

6.根据权利要求3所述的黄柄曲霉菌菌株TR32在制备防治植物病原菌的生防制剂中的应用，其特征在于：所述黄柄曲霉菌菌株TR32的发酵物的制备步骤为：将所述菌株TR32接种到PDB培养基中在25℃-28℃下震荡培养，然后减压抽滤、超声破碎、萃取、分液、旋蒸、烘干后获得菌株TR32的发酵物。

7.根据权利要求6所述的黄柄曲霉菌菌株TR32在制备防治植物病原菌的生防制剂中的应用，其特征在于：所述旋蒸的温度为36-38℃。

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