CN105274008B - 一株淡紫拟青霉PlTS01及其在防治烟粉虱中的应用 - Google Patents
一株淡紫拟青霉PlTS01及其在防治烟粉虱中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物农药技术领域，具体公开了一株淡紫拟青霉PlTS01及其在防治烟粉虱中的应用。所述菌株从甘肃省永登县中川镇的土壤中分离纯化获得，于2015年3月31日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC No.M2015168。该菌株对烟粉虱具有很强的杀虫活性，在处理后第6天，对B型烟粉虱2龄若虫的半致死浓度LC50为1.66×106孢子/mL，半致死时间LT50为4.35 d（在1.0×107孢子/mL剂量下）。该菌株展现了作为环境友好的微生物农药用于防治农业重要害虫‑烟粉虱的良好前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物农药技术领域，具体地，涉及一株淡紫拟青霉PlTS01及其在防治烟粉虱中的应用。
背景技术
烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)是一类刺吸式口器的小型昆虫，也是一个正在快速进化的复合种，其生物型B与生物型Q属于世界性大害虫。20世纪80年代以来，随着世界范围内的贸易往来，烟粉虱借助花卉、苗木及其他经济作物的迅速扩散，在世界各地广泛传播并爆发成灾，目前烟粉虱已广泛分布于亚洲、欧洲、美洲、大洋洲、非洲等90多个国家和地区，给全球农业生产带来了严重的经济损失。在我国，烟粉虱已蔓延为害至除西藏以外的各省、市与自治区，严重影响农业生产。
烟粉虱是多食性害虫，寄主范围广泛，可危害农作物、花卉植物、野生植物，如豆科、十字花科、茄科、菊科、葫芦科、旋花科、大戟科等。烟粉虱若虫、成虫通过口针直接刺吸植物汁液，造成寄主营养缺乏，导致植株衰弱、黄化等症状；其分泌的大量蜜露可诱发煤污病，造成植物光合作用下降及果实等商品价值降低；最重要的是，烟粉虱又是植物病毒的传播媒介，其传播的双生病毒给农业生产造成严重的危害。
防治烟粉虱依然以化学杀虫剂为主，但是化学防治的安全性及抗药性等问题越来越突出，因此生物防治越来越受到人们的重视。淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)是一类常见的土壤真菌，也是昆虫、线虫的重要病原真菌，已有一些有关淡紫拟青霉的发明专利：申请号为201310669589.X的专利公开了一种淡紫拟青霉菌株分生孢子用于防治温室蚜虫、温室白粉虱等刺吸式害虫。
申请号为201210358765.3的专利公开了一种淡紫拟青霉菌株，并用于防治香蕉根结线虫。
申请号为201310538318.0的专利公开了淡紫拟青霉航天诱变突变株的微生物制剂及其在防治根结线虫生物中的应用。
申请号为201210074067.0的专利公开了一种淡紫拟青霉的培养方法及其对线虫卵的应用。
申请号为201110289518.8的专利公开了一种包含淡紫拟青霉和丁硫克百威的杀线虫组合物。
申请号为201110024803.7的专利公开了一种含阿维菌素和淡紫拟青霉的杀线虫组合物。
申请号为201310117537.1的专利公开了一株对柑橘木虱具强致病力的淡紫拟青霉菌株。
申请号为201210229012.2的专利公开了一株具有抑菌活性的淡紫拟青霉。
综上可见，利用淡紫拟青霉防治线虫的发明专利较多，防治害虫的也有少量专利申请，但是应用于防治烟粉虱的却未有报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是为开发新的真菌杀虫剂提供材料，提供一株对烟粉虱具有杀灭作用的淡紫拟青霉菌株。
本发明的另一个目的是提供所述淡紫拟青霉菌株在防治烟粉虱方面的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
一株淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)菌株PlTS01，所述菌株于2015年3月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC No.M2015168，保藏地址为中国武汉武汉大学。
PlTS01菌株的菌落特征：在察氏培养基上，起初菌落规则圆形，隆起，菌丝白色，背面淡黄色或近米黄色；延长培养，菌落仍呈圆形，形成淡粉色色孢子层；培养14天后，菌落直径44～46mm。
显微结构：菌丝细长，无色透明，具分隔，宽度1.58～3.61μm；分生孢子梗上着生2～5个瓶梗，瓶梗椭圆形或梭形膨大，向上逐渐细管状，长6.07～7.44μm，宽2.77～3.66μm；其上产大量分生孢子，分生孢子串生、无色透明，单胞子呈椭圆形至卵圆形，长2.51～3.66μm，宽1.77～2.66μm。
分子系统发育：采用通用引物ITS1、ITS4扩增PlTS01菌株的r DNA-ITS基因序列(如SEQ ID NO：1所示)，测序后与NCBI数据库中已知序列比对，构建系统发育树，结果表明，PlTS01菌株与淡紫拟青霉处在同一分支上，同源性为99％。
通过上述生物学性状及生理生化和分子鉴定可知，PlTS01菌株分类地位属于真菌界(Eumycetes)、半知菌亚门(Deuteromycotina)、丝孢纲(Hyphmycetes)、丝孢目(Hphomycetales)、丛梗孢科(Monilaceae)、拟青霉属(Paecilomyces)。
本发明同时提供了所述淡紫拟青霉菌株PlTS01在防治烟粉虱中的应用。
PlTS01菌株以浓度为1×108个分生孢子/ml，在处理第10天，2龄B型烟粉虱若虫的累计校正死亡率达到92.78％，半致死浓度LC50为1.66×106孢子/mL(处理后第6天)，半致死时间LT50为4.35d(在1.0×107孢子/mL剂量下)。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明所述淡紫拟青霉菌株对防治烟粉虱高效；本发明所述的菌株是一种昆虫病原真菌，作为一种生物活体农药，具有不同现有化学杀虫剂的全新作用机理、对发展绿色生态控制技术，为农林业的可持续发展有促进作用，具有非常好的推广应用价值。
附图说明
图1为菌株在察氏培养基上培养14天的菌落形态，A：菌落正面；B：菌落背面。
图2为淡紫拟青霉PlTS01菌株产孢结构与分生孢子。
图3为PlTS01菌株及相关菌株的r DNA-ITS构建的系统发育树。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例来进一步详细阐述本发明。如下实施例为本发明较佳的实施方式，本发明主要阐述所述菌株的发明思想，实施方式不一一在实施例中追述，但并不因此限制本发明，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，应被视为等效的置换方式，包含在本发明内。
实施例1 淡紫拟青霉菌株PlTS01的分离、筛选
采集甘肃省永登县中川镇的土壤，土壤样品过筛去掉石粒和杂物，取净土10g悬浮于90mL 0.05％的吐温80溶液中，摇匀，静置15min，取其上清液2mL稀释于8mL 0.05％吐温80中。
选择培养：将0.1mL上述悬浮液接种于选择培养基平板表面上，用三角玻棒均匀涂抹。25℃下，恒温培养3～6d，然后用接种环于单菌落上挑取菌丝，接种于PDA平板上继续培养，纯化后保存于4℃冰箱中备用。
经过上述操作，从土壤中筛选出一株对烟粉虱具有致病作用的真菌，编号PlTS01。
实施例2 菌株PlTS01的鉴定
实施例1筛选的菌株PlTS01在察氏培养基上，起初菌落规则圆形，隆起，菌丝白色，背面淡黄色或近米黄色；延长培养，菌落仍呈圆形，形成淡粉色色孢子层；培养14天后，菌落直径44～46mm。
显微结构：菌丝细长，无色透明，具分隔，宽度1.58～3.61μm；分生孢子梗上着生2～5个瓶梗，瓶梗椭圆形或梭形膨大，向上逐渐细管状，长6.07～7.44μm，宽2.77～3.66μm；其上产大量分生孢子，分生孢子串生、无色透明，单胞子呈椭圆形至卵圆形，长2.51～3.66μm，宽1.77～2.66μm。
分子系统发育：采用通用引物ITS1、ITS4扩增PlTS01菌株的r DNA-ITS基因序列(如SEQ ID NO：1所示)，测序后与NCBI数据库中已知序列比对，构建系统发育树，结果表明，PlTS01菌株与淡紫拟青霉处在同一分支上，同源性为99％。
通过上述生物学性状及生理生化和分子鉴定可知，PlTS01菌株分类地位属于真菌界(Eumycetes)、半知菌亚门(Deuteromycotina)、丝孢纲(Hyphmycetes)、丝孢目(Hphomycetales)、丛梗孢科(Monilaceae)、拟青霉属(Paecilomyces)。
该菌株于2015年3月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC No.M2015168，保藏地址为中国武汉武汉大学。
实施例3
分生孢子悬浮液配制：从斜面菌种上挑取分生孢子，接入已经灭菌的0.05％的吐温-80溶液中，用血球计数板测量孢子浓度，并调整到107个分生孢子/mL。备用。
种子培养：将2mL孢子悬浮液接种于98mL种子培养基中，在180r/m和26℃条件下摇瓶培养2-3天即成种子液。种子培养基为0.5％蛋白胨的Czapek-Dox培养基，其成分为：蛋白陈5g，NaN033g，K2HP041g，MgS04·7H200.5g，KCl 0.5g，FeS04·7H200.01g，茂糖30g，琼脂15-20g，水1000mL。
固体发酵：先将大米蒸熟，装入保鲜袋中，待其冷却至常温后，接种上述种子液，接种比例为5-15％(V/W)，在25-28℃条件下培养2周左右，待米粒表面长满分生孢子是过筛分离分生孢子，封口包装，保温保藏备用。
几种虫生真菌对烟粉虱的致病力比较
供试菌株培养与孢子悬浮液配制：以PlTS01及MaTS01等5个菌株供试(表1)。在PDA培养基平板上培养3周后，取分生孢子，用0.05％吐温80溶液配制成1.0×108个孢子/mL的悬浮液，采用浸渍法处理，将孢子接种于盆栽扶桑苗上的2龄B型烟粉虱若虫上，以清水处理作为对照，重复3次，每隔48小时检查烟粉虱的死虫数，最后计算13天后烟粉虱的累积死亡率。
供试虫源的饲养：选取长势良好且健康的扶桑苗，摘除老叶部分，留下20片左右的新叶，将叶片用清水清洗干净，放入养虫笼中。待叶片风干后，将经多代人工饲养纯化的B型烟粉虱成虫释放到养虫笼中，以每株释放50对烟粉虱成虫计算释放虫量。在光照14:10(L:D)、温度25±1℃、相对湿度70±10％条件下，让烟粉虱在笼中产卵1天，然后驱走全部成虫。继续培养，并观察烟粉虱卵孵化情况，待发育到2龄若虫期时(约7d)进行实验。
累积死亡率(％)＝调查时累积死亡虫数/处理前虫数×100％
校正死亡率(％)＝(处理死亡率-对照死亡率)/(1-对照死亡率)×100％
不同菌株对烟粉虱的累计校正死亡率如表1。结果显示PlTS01菌株效果最好，在处理后10天，烟粉虱死亡率达到92.78％。
表1 供试菌株对烟粉虱2龄若虫的致病力(×108孢子/mL)
| 菌株 | 菌株来源 | 校正死亡率％(处理第10天) |
| MaTS01 | 拉萨河边土壤 | 44.69+4.28d |
| PlTS01 | 甘肃省永登县土壤 | 92.78+1.27a |
| PlTS02 | 曲水县雅鲁藏布江土壤 | 75.78+5.30b |
| BbTS01 | 西藏白朗县土壤 | 58.09+7.20c |
| IfTS01 | 青海门源县达板山土壤 | 91.70+3.81a |
实施例4：PlTS01菌株对烟粉虱的毒力测定
在室内条件下，采用浸渍法将离体的带有2龄B型烟粉虱若虫的扶桑叶片(每叶不少于50头若虫)分别在9.0×107个/mL、3.0×107个/mL、1.0×107个/mL、3.3×106个/mL、1.1×106个分生孢子/mL浓度梯度的菌株分生孢子悬浮液中浸渍叶片10s，自然晾干后放入干净培养皿(底部垫湿滤纸及薄层脱脂棉，叶柄基部缠绕含营养液的湿棉球)中，然后将培养皿放入光照14：10(L：D)，温度25±1℃下培养，实验重复3次。
每隔2天观察记录若虫死亡情况，计算死亡率与半致死浓度(LC50)及半致死时间(LT50)
累积校正死亡率如表2，进而计算出半致死浓度LC50(95％置信区间)为1.66(0.98-2.47)×106spores/mL(处理第6天)，半致死时间LT50(95％置信区间)为4.35(4.12-4.59)天。
表2PlTS01菌株对2龄B型烟粉虱若虫的累积校正病死率(％)
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
<120> 一株淡紫拟青霉PlTS01及其在防治烟粉虱中的应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 566
<212> DNA
<213> rDNA-ITS基因序列
<400> 1
gataggggct tcactcccaa cccactgtga accttacctc agttgcctcg gcgggaacgc 60
cccggccgcc ggcccccgcg ccggcgccgg acccaggcgc ccgccgcagg gaccccaaac 120
tctcttgcat tacgcccagc gggcggaatt tcttctctga gttgcacaag caaaaacaaa 180
tgaatcaaaa ctttcaacaa cggatctctt ggttctggca tcgatgaaga acgcagcgaa 240
atgcgataag taatgtgaat tgcagaattc agtgaatcat cgaatctttg aacgcacatt 300
gcgcccgcca gcattctggc gggcatgcct gttcgagcgt catttcaacc ctcgagcccc 360
cccgggggcc tcggtgttgg gggacggcac accagccgcc cccgaaatgc agtggcgacc 420
ccgccgcagc ctcccctgcg tagtagcaca cacctcgcac cggagcgcgg aggcggtcac 480
gccgtaaaac gcccaacttt cttagagttg acctcggatc aggtaggaat acccgctgaa 540
cttaagcata tcaataagcg gaggaa 566
Claims (2)
1.一株淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)菌株PlTS01，其特征在于，所述菌株于2015年3月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC No.M2015168。
2.权利要求1所述淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)菌株PlTS01在防治烟粉虱中的应用，其特征在于，所述防治烟粉虱是收获淡紫拟青霉的分生孢子，用0.05％吐温-80溶液配制成浓度为107分生孢子/mL的悬浮液，于烟粉虱若虫发生高峰期采用叶面喷雾法将悬浮液施用于田间。
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