CN110628649B - 一株淡紫拟青霉菌株及其应用和从中提取毒素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种对烟粉虱具有致病作用的淡紫拟青霉毒素(Purpureocillium lilacinum)菌株SCAUPL‑1，保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），保藏号为GDMCC NO:60732；本发明还提供一种有效的玫烟色棒束孢毒素提取的方法及其在烟粉虱的生物防治中的应用。

Description

一株淡紫拟青霉菌株及其应用和从中提取毒素的方法
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体涉及生物防治领域，尤其涉及一种淡紫拟青霉毒素提取及鉴定的方法。
背景技术
烟粉虱(Bemisia tabaci Gennadius)隶属半翅目(Hemiptera)，粉虱科(Aleyrodidae)，小粉虱属Bemisia，又名棉粉虱、一品红粉虱、甘薯粉虱等。烟粉虱为多食性害虫，生物型众多，寄主广泛，危害极大。烟粉虱可通过直接刺吸及其有效传播病毒而对作物造成损害(吴乾兴,刘勇,张友军,等.烟粉虱常用药剂抗性监测研究[J].植物保护,2018,2(1):119-120)。给许多国家的农业生产造成了巨大损失。烟粉虱所传播的病毒种类超过150种，其中由双生病毒引起的番茄黄化曲叶病是一种毁灭性病害，严重时可导致番茄100％损失，并已蔓延至其它作物。之前主要采用化学防治。
由于化学杀虫剂的滥用，烟粉虱已对多种杀虫剂产生了抗性。农药的滥用不仅会导致土壤酸化、影响土壤微生物、不利作物的生长，人的健康也会因食用农药残留作物而受到影响。有机磷农药是我国生产量最大、应用最多的农药，也是我国主要环境污染源之一，研究微生物来解决农药污染的问题是未来趋势。
虫生真菌的资源丰富，已经记载种类有800多种(杨运华,杜开书,石明旺.虫生真菌的生物防治研究进展[J].河南科技学院学报(自然科学版),2011,39(01):34-37)，主要分属于子囊菌及结合菌门，其中子囊菌类的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)、绿僵菌(Metarhizium)等被开发成为重要的害虫生防制剂。病原真菌防治昆虫具有毒性低、无污染、可持续性强、有害生物不易产生抗性等优点，可有效避免化学农药带来的农药残留超标、害虫抗药性增加等一系列问题。杀虫真菌农药的研制可以使化学防治与生物防治充分协调的结合使用，使害虫防治工作更加合理、有效。我国自50年代后期开始研究用虫生真菌治虫，主要是应用球孢白僵菌防治大豆食心虫等害虫(万方浩,叶正楚,郭建英,等.我国生物防治研究的进展及展望[J].昆虫知识,2000,(02):65-74)。因此，开发研究高效、质量稳定的杀虫真菌农药已成为害虫防治的关键问题。
淡紫拟青霉菌(Purpureocillium lilacinum)，隶属丝孢纲(Hyphomycetes)、丝孢科(Hyphomycetales)、丛梗孢科(Monilaceae)、拟青霉属(Purpureocillium)。从建属以来，有近50多种淡紫拟青霉菌被报道，且多为虫生真菌(赵培静,任文彬,缪承杜,等.淡紫拟青霉研究进展与展望[J].安徽农业科学,2007,35(30):9672-9674)，淡紫拟青霉菌(Purpureocillium lilacinum)最早分离于秘鲁根结线虫卵囊(梁照文.淡紫拟青霉的发酵条件研究及其与线虫互作机理研究方法的初探[D].南京农业大学,2007)，分布于世界各地，且寄主广泛、培养简单，防治植物病原线虫效果显著，可侵染半翅目、鳞翅目害虫，在防治植物病原菌方面也有良好效果，还能产生类生长素促进植物生长，对难溶磷酸盐类农药有降解作用。随着传统化学农药的长期使用，害虫和病原菌的抗药性日益增强、农药残留、环境污染等问题亟待解决。使用以天然产物作为先导化合物来开发新型农药是未来的一种趋势，因此深入研究淡紫拟青霉菌及其代谢产物得到了国内外研究学者广泛关注。
淡紫拟青霉菌次级代谢产物存在活性物质，能抑制线虫卵及二龄幼虫发育和生长，有研究显示乙酸就是此活性物质，在浓度为0.0044mol/L距能达到抑制线虫的效果，李小龙分离得到麦角甾醇、D-甘露糖醇、麦角甾醇-7,22(E)、酵母甾醇、白僵菌素(李小龙.淡紫拟青霉518的抗菌活性及其次生代谢产物研究[D].南京农业大学,2012)。1972年，Tadashi从淡紫拟青霉的代谢产物中首次分离出一种新的抗生素leucinostatins(TadashIA,Yuzuru M,Kazutaka F,Takehiko U,et al.A new antibiotic,leucinostatin,derivedfrom Penicillium lilacinum[J].Journal of Antibiotics,1973,26(3):157-61)，它是一种非核糖体肽类化合物，对多种革兰氏阳性菌和真菌有毒杀活性，对肿瘤细胞也有抑制(王刚.生防菌淡紫拟青霉的基因组及其抗生素leucinostatins生物合成途径的研究[D].中国农业科学院,2016)，也有研究表明此抗生素是杀线虫活性的指标(Park JO,Hargreaves JR,Mcconville EJ et al.Production Of leucinostatins andnematicidal activity of Australian isolates of Paecilomyces lilacinus(Thom)Samson[J].Letters in Applied Microbiology,2004,38(4):271-276)。崔香(崔香,李长伟,吴长景,等.深海来源淡紫拟青霉ZBY-1的代谢产物及其抗肿瘤活性[J].国际药学研究杂志,2013,40(2):177-86)通过对来源深海的淡紫拟青霉ZBY-1代谢产物的研究中，分离出了7个化合物，它们分别为9(11)-去氢过氧化麦角甾醇、过氧化麦角甾醇、5α，6α-环氧-3β-羟基麦角甾-22-烯-7-酮、脑苷脂A、脑苷脂B、脑苷脂C、脑苷脂D。并对这7个化合物进行了体外抗肿瘤活性的初步测定，发现有两种化合物对4种癌细胞有较强的抑制作用。
在实际中，仍然有必要筛选到对烟粉虱具有高致病作用的淡紫拟青霉菌，并研究其毒素具有重要意义。
发明内容
本发明从西藏亚拉山雪地土壤中分离到一株对烟粉虱具有高致病作用的淡紫拟青霉菌菌株，具体是淡紫拟青霉毒素(Purpureocillium lilacinum)菌株SCAUPL-1，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏号为GDMCC NO:60732。
用菌株SCAUPL-1孢子悬浮液(1.0×107孢子/mL)对烟粉虱二龄若虫进行处理后第7天校正死亡率分别为达68.88％，对二龄烟粉虱具有较明显的致病力。
因此，本发明第一方面是提供一株淡紫拟青霉毒素(Purpureocilliumlilacinum)菌株SCAUPL-1。进而提供其在防治烟粉虱中的应用。
为了进一步开发菌株的潜力，本发明人对其产生的毒素的提取进行研究，构成本发明第二个方面。通过对不同萃取剂提取方法的研究，获得了更好的毒素提取方法，因而完成本发明的第二个方面。
本发明还提供一种从上述的菌株中提取淡紫拟青霉毒素的方法，其包括如下步骤：
(1)在所述菌株的发酵液加0.8-1.2倍体积的有机溶剂乙酸乙酯；
(2)超声波震荡以打破细胞壁加速毒素萃取，优选超声振荡30-50min，最优选为40min；
(3)震荡后放入0-6℃冰箱静置，用分液漏斗把萃取液进行分液，保留萃取后的有机相；进一步地，其是放入4冰箱中静置，时长20-28h，最好在期间每隔7-9h搅拌一次。
(4)将萃取后的有机相进行蒸发得到粗毒素，优选采用旋转蒸发方式。
通过检测，采用乙酸乙酯萃取获得较多的毒素，经与真菌化合物数据库对比筛选出97种出现频率高、可信度高的小分子化合物。
优选地，在第(1)步，第(3)步或/和第(4)步测定其蛋白浓度，监测毒素产生和提取效果。
更优选地，在第(1)步中添加的有机溶剂乙酸乙酯的量为所述菌株的发酵液的同等体积。
其中菌株的发酵液按下述方法制备：
将所述菌株的孢子悬浮液，在恒温摇床内摇瓶发酵后对菌液行抽滤，得到菌丝和发酵液，对发酵液离心取上清备用。
本发明还提供一种上述的方法获得的淡紫拟青霉毒素粗毒素在防治烟粉虱中的应用。优选制备成液体浓缩剂型，在使用时稀释合适倍数，防治时喷施到作物上。
本发明筛选分离到到一株对烟粉虱具有较强的致病力的菌株，并且在毒素分泌方面具有较大开发潜力。通过对多种提取方法的比较，确定了最佳的粗毒素的提取方法，其中通过乙酸乙酯萃取粗毒素对烟粉虱的致病力最强，在侵染后第7天，烟粉虱的校正死亡率达到86.67％，达到较高的水平。因此，该菌株本身及其分泌毒素具有较大潜力用于烟粉虱的生物防治，也具有进一步的开发价值。
本发明的淡紫拟青霉毒素菌株SCAUPL-1，于2019年8月2日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏号为GDMCC NO:60732。
附图说明
图1 SCAUPL-1菌落形态图
注:左图和右图为SCAUPL-1菌落正面图和背面图
图2 ITS区扩增电泳图
图3 SCAUPL-1系统发育树
图4蛋白浓度标准曲线
图5菌株淡紫拟青霉SCAUPL-1不同处理蛋白浓度变化
其中：图中所示为菌株SCAUPL-1不同处理蛋白浓度。1.发酵液蛋白浓度，2.乙酸乙酯萃取后有机相蛋白浓度，3.甲醇萃取后有机相蛋白浓度，4.正己烷萃取后有机相蛋白浓度，5.乙酸乙酯萃取后粗毒素蛋白浓度，6.甲醇萃取后粗毒素蛋白浓度，7.正己烷萃取后粗毒素蛋白浓度。图中数据为3次重复的平均值与标准误。数据后具有相同字母，表示在0.05水平上差异不显著(TUKEY’S法)。
图6菌株淡紫拟青霉SCAUPL-1发酵液LC-MS鉴定图谱
图7菌株淡紫拟青霉SCAUPL-1乙酸乙酯萃取粗毒素LC-MS鉴定图谱
图8菌株淡紫拟青霉SCAUPL-1甲醇萃取粗毒素LC-MS鉴定图谱
图9菌株淡紫拟青霉SCAUPL-1正己烷萃取粗毒素LC-MS鉴定图谱
图10菌株淡紫拟青霉SCAUPL-1不同处理对烟粉虱二龄若虫的校正死亡率
具体实施方式
下面通过本发明的研发过程和具体实施方式进行介绍，但不构成对本发明的限制。
实施例一：菌株的鉴定
1菌株SCAUPL-1的采集
菌株SCAUPL-1最初于西藏亚拉山雪地土壤中分离而来，为中国本土菌株。
采集土壤样品，采样时取表土下10～15cm处土壤100g左右，用塑料袋封装后带回实验室处理。土壤样品过筛去掉石粒和杂物，然后取净土10g悬浮于90mL 0.1％的吐温80溶液中，摇匀，静置15min，取其上清液2mL稀释于8mL 0.05％吐温80中，配制为土壤悬浮液。将0.1mL土壤悬浮液接种于孟加拉红琼脂培养基平板上，用三角玻璃刮子将悬浮液推匀于平板表面下，25℃培养3～7d，然后用接种环切取长势均匀单菌落，接种于PDA板上继续培养，得到淡紫拟青霉菌株SCAUPL-1。切取菌丝块移植于PDA斜面，继续培养，4℃下保藏于冰箱中。菌株SCAUPL-1在PDA平板上，25℃，10天，菌落直径87.9mm，菌落表面平整，淡紫色，绒毛状，背面呈淡紫色(图1)。
2分子生物学鉴定
针对菌株进行分子生物学鉴定。
采用CTAB法提取DNA，包括以下步骤：
(a)将淡紫拟青霉菌株SCAUPL-1在PDA平板上培养一周后，小心刮取菌丝体于研钵中，加入液氮迅速充分研碎；
(b)取适量研碎的菌丝体迅速转移到离心管中，加入300μL经65℃预热的DNA提取液裂解液，充分混匀，加入等体积的氯仿/异戊醇(24/1)混合液混匀，65℃下水浴1h，10min左右轻轻震荡一次，12000rpm常温条件下离心5min；
(c)缓慢吸取上清液于另一新离心管中，缓慢加入等体积的氯仿/异戊醇(24/1)混合液进行再次抽提，12000rpm常温条件下离心5min；
(d)缓慢吸取上清液于另一新离心管中，加入1/10体积的醋酸钠，等体积预冷的异丙醇，室温静止15min；
(e)加入70％乙醇洗涤沉淀2次；
(f)移液枪紧贴管壁缓慢吸出乙醇，置于超净工作台内吹干；
(g)所得沉淀溶于50μL的TE中；
(h)用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，其余提取物置于-20℃条件下保存。
真菌DNA的PCR所用引物是针对ITS基因的通用引物：B5.1F：5’-cgacccggccaactactttga-3’和B3.1R：5’-gtcttccagtaccactacgcc-3’。扩增条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸10min。
50μL反应体系如下：
Figure BDA0002165991010000051
Figure BDA0002165991010000061
PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(含EB)，缓冲液为1×TAE，电压150V、电流220mA，Marker DL2000作为分子量标准参照物，电泳结束后，在凝胶成像仪上检测并拍照记录。
特异性PCR产物委托上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。序列比对与发育树构建：测序结果用BLAST搜索同源性较高的相关序列，使用MEGA5.1软件中的Cluster W进行序列比对和多重序列比对。并在该软件中构建Neighbour-joining(NJ)系统发育树。
3鉴定结果
(1)如图2所示，泳道的电泳条带比较清晰，可以根据PCR产物的迁移距离来准确判断该菌株的基因片段约为600bp，其中编号1为SCAUPL-1菌株。
(2)将得到的该菌株基因型的ITS序列和从GenBank下载的5株淡紫拟青霉菌相关序列组合，构建分子系统树，结果如图3所示，SCAUPL-1菌株属于Purpureocilliumlilacinum，为淡紫拟青霉。
综合形态学特征与生理生化特性鉴定结果显示，该菌株属于淡紫拟青霉属，命名为SCAUPL-1，并于2019年8月2日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为60732，保藏地址为中国广州。
实施例二：不同有机溶剂萃取蛋白浓度比较
1材料与方法
1.1供试菌株、培养基及器皿灭菌
供试菌株为实施例一获得的淡紫拟青霉SCAUPL-1。
马铃薯琼脂培养基(PDA)：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g，加纯净水至1000mL。121℃灭菌15min。本培养基用于菌株平板和斜面的纯培养。
发酵培养基(Asaff et al,2005)：30g葡萄糖，3g酵母提取物，0.39g KH2PO4，1.42gNa2HPO4·12H2O，0.60g MgSO4·7H2O，0.70g NH4NO3，1.00g KCl，加纯净水至1000mL。每150mL发酵培养基装入一个500mL锥形瓶中，121℃灭菌15min，备用。本培养基用于摇瓶发酵。
1.2孢子悬浮液的配制方法
将供试菌株接种到PDA平板上，在恒温26℃、光照(12L:12D)的生化培养箱中培养7天，待大量产孢后，用接种针轻刮真菌的菌丝及孢子至放有20mL0.05％Tween-80无菌水的锥形瓶中，用磁力搅拌器搅拌30min，待孢子完全分散后，用双层纱布过滤菌液，弃去未分散的菌丝和培养基残物。用血球计数板计数，使用0.05％Tween-80无菌水调整到1×107孢子/mL的孢子悬浮液。
1.3 BCA法测定蛋白浓度
标准曲线的绘制：
(1)将0.5mg/mL蛋白标准品按0μl、1μl、2μl、4μl、8μl、12μl、16μl、20μl加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μl，相当于标准品浓度分别为0mg/mL、0.025mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL。
(2)各孔加入200μl BCA工作液，37℃放置20-30min(室温放置2h)。
(3)用酶标仪测定A595nm处的吸光值。
(4)根据标准曲线查出回归方程，见图2，计算出样品的蛋白浓度。
1.4菌株SCAUPL-1发酵液蛋白浓度测定试验流程
(1)配置淡紫拟青霉SCAUPL-1的孢子悬浮液，调整到1×107孢子/mL。
(2)每瓶发酵培养基中加入5mL1.0×107孢子/mL孢子悬浮液，每个处理设三个重复，在温度26℃，转速180rpm/min的恒温摇床内摇瓶发酵六天。
(3)六天后对菌液行抽滤，得到菌丝和发酵液。
(4)收集发酵液，取发酵液1mL，8000rpm/min短暂离心，用BCA蛋白浓度试剂盒测定吸光值并根据公式计算蛋白浓度。
1.5淡紫拟青霉SCAUPL-1发酵液中毒素的萃取
按下列步骤萃取毒素：
(1)将上述获得的发酵液装入150mL干净的锥形瓶中，分别加同等体积的三种有机溶剂(乙酸乙酯、甲醇、正己烷)。
(2)超声波震荡40min以打破细胞壁加速毒素萃取。
(3)震荡后放入4℃冰箱静置24h(期间每隔8h搅拌一次)，用分液漏斗把萃取液进行分液，保留萃取后的有机相，测定蛋白浓度。
(4)将萃取后的有机相进行旋转蒸发得到粗毒素，测定蛋白浓度。
2结果与分析
菌株SCAUPL-1摇瓶发酵后的发酵液、乙酸乙酯萃取后有机相、甲醇萃取后有机相、正己烷萃取后有机相、乙酸乙酯萃取后粗毒素、甲醇萃取后粗毒素、正己烷萃取后粗毒素进行对比，见图5，结果显示：乙酸乙酯和甲醇萃取后，蛋白浓度均有增高，粗毒素蛋白浓度增高显著，乙酸乙酯萃取效果略优于甲醇；正己烷萃取发酵液后蛋白含量没有增高，毒素萃取效果不理想。
实施例三：淡紫拟青霉粗毒素表征鉴定
对菌株淡紫拟青霉SCAUPL-1发酵液和三种有机溶剂萃取粗毒素进行高效液相色谱与色谱连用(LC-MS)鉴定，旨在明确发酵液和粗毒素中所含组分，为淡紫拟青霉真菌中杀虫毒素及其它生物活性物质的筛选提供依据。
1材料与方法
1.1高效液相色谱质谱连用(LC-MS)制样方法及试验参数
(1)摇瓶发酵后的发酵液用滤膜过滤，4℃冰箱保存待测。
(2)提取的粗毒素用相同试剂溶解，放在通风橱中待有机溶剂蒸发后用1mL色谱纯异丙醇溶解，4℃冰箱保存待测。
(3)测试条件：流动相A:乙腈(0.1％甲酸)，B含0.1％甲酸+10mM甲酸铵水溶液，流速：100μl/min，进样量：5μl，检测波长：215nm。
2结果与分析
2.1菌株SCAUPL-1发酵液LC-MS鉴定结果
菌株SCAUPL-1摇瓶发酵后发酵液LC-MS分析结果如图6和表1所示。SCAUPL-1发酵液中组分复杂，经与真菌化合物数据库对比筛选出49种小分子化合物供后续试验参考。
表1 SCAUPL-1发酵液主要组分
Figure BDA0002165991010000081
Figure BDA0002165991010000091
Figure BDA0002165991010000101
2.2菌株SCAUPL-1乙酸乙酯萃取粗毒素LC-MS鉴定结果
菌株SCAUPL-1乙酸乙酯萃取粗毒素LC-MS分析结果如图7和表2所示。SCAUPL-1乙酸乙酯中毒素较多，经与真菌化合物数据库对比筛选出97种出现频率高、可信度高的小分子化合物。
表2 SCAUPL-1乙酸乙酯萃取粗毒素主要组分
Figure BDA0002165991010000102
Figure BDA0002165991010000111
Figure BDA0002165991010000121
2.3菌株SCAUPL-1甲醇萃取粗毒素LC-MS鉴定结果
菌株SCAUPL-1甲醇萃取粗毒素LC-MS分析结果如图8和表3所示。SCAUPL-1甲醇粗毒素中组分复杂，经与真菌化合物数据库对比筛选出44种小分子化合物。
表3 SCAUPL-1甲醇萃取粗毒素主要组分
Figure BDA0002165991010000131
Figure BDA0002165991010000141
2.4菌株SCAUPL-1正己烷萃取粗毒素LC-MS鉴定结果
菌株SCAUPL-1正己烷萃取粗毒素LC-MS分析结果如图9和表4所示。SCAUPL-1正己烷萃取粗毒素中组分较多，经与真菌化合物数据库对比筛选出78种小分子化合物。
表4 SCAUPL-1正己烷萃取粗毒素主要组分
Figure BDA0002165991010000142
Figure BDA0002165991010000151
Figure BDA0002165991010000161
Figure BDA0002165991010000171
2.5菌株SCAUPL-1代谢产物中所含毒素
菌株SCAUPL-1中常见毒素有：白僵菌素(Beauvericin)、青霉素G(Penicillin G(Benzylpenicillin))、水解伏马菌素B3(B3 HFB3/Hydrolysed Fumonisin B3)、烟曲霉毒素B(Fumitremorgin B)、细胞松弛素J(Cytochalasin J)、海洋真菌次生代谢物(5-Methyl-mellein)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deepoxy deoxynivalenol)、HT-2毒素([U-13C]-HT2/HT-2Toxi)、镰刀菌酸(Fusaric acid)、茴香霉素(Anisomycin)、巴佛洛霉素A1(BafilomycinA1)、赤霉酸(Gibberellic acid)、蛇孢菌素A(Ophiobolin A)、麦角克碱(Ergocristine)、丽赤壳霉素(Calonectrin)、徘徊青霉素(Palitantin)、燕麦曲菌素(Avenaciolide)、纯绿青霉素(Viridicatin)、阿非迪霉素(Aphidicolin)、圆弧(青霉)菌素(Cyclopenin)、曲古抑菌素(TSA/Trichostatin A)、离子霉素(Ionomycin)、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-Acetyldeoxynivalenol)、K252a、Brevianamide F、Tryprostatin A、Chlamydospordioln、Paspaline B、16-Keto-Aspergillimide、Dehydrocyclopeptine、Marcfortine C、FK506(Tacrolimus)、Enniatin K1、Methylequisetin、Chrysogine、Dihydroergine、Tryptoquialanine、Penigequinolone A、[U-13C]-NIV/Nivalenol、Aspinolide A、Pestalotin、Rugulosuvine、-Hydroxyculmorin、Averantin、Monocerin、HFB1/HydrolysedFumonisin B1、Pyrenocine A。
实施例四：淡紫拟青霉及粗毒素对烟粉虱的杀虫活性
1材料与方法
1.1生物测定
测定淡紫拟青霉孢子悬浮液、摇瓶发酵后的发酵液和粗毒素对烟粉虱致死效果。
(1)选取长势一致、嫩叶多的无虫棉花苗若干株，套上接虫盒；
(2)每叶接入烟粉虱成虫150对，置于26℃室温条件下，产卵24h后将成虫吹出；
(3)待烟粉虱发育到二龄，以150头若虫为界，划定区域，浸泡到处理溶液中，10秒后取出，自然风干叶片表面水分，将叶片正面向下，平铺到放有琼脂的培养皿内；
(4)1.0×107孢子/mL浓度的悬浮液、摇瓶发酵后的发酵液以0.05％Tween-80溶液浸泡烟粉虱为空白对照。不同有机溶剂萃取的粗毒素用相应有机溶剂做对照，每处理设三个重复，置于26℃室温条件下观察；
(5)每天检查并记录烟粉虱死亡情况，将死虫挑出保湿培养，观察是否有致病菌长出。
2结果与分析
用菌株SCAUPL-1孢子悬浮液(1.0×107孢子/mL)、摇瓶发酵后的发酵液、乙酸乙酯萃取粗毒素、甲醇萃取粗毒素、正己烷萃取粗毒素对烟粉虱二龄若虫进行处理后，烟粉虱二龄若虫均有死亡，若虫的不同时间的累计死亡率见图10。
结果表明，淡紫拟青霉菌株SCAUPL-1的不同处理对烟粉虱的致病速度存在很大的差异，部分处理自处理后第1天后即引起烟粉虱死亡，侵染后13天时其死亡率均超过50％。乙酸乙酯萃取粗毒素对烟粉虱的致病力最强，侵染后第7天，烟粉虱的校正死亡率为86.67％。淡紫拟青霉SCAUPL-1孢子悬浮液(1.0×107孢子/mL)、摇瓶发酵后的发酵液和甲醇萃取粗毒素在处理后第7天校正死亡率分别为68.88％、74.44％和75.56％，对二龄烟粉虱的致病力较强。正己烷萃取粗毒素的致病力最弱，侵染后7天校正死亡率为50％，在之后死亡率没有上升。

Claims (11)

1.一种对烟粉虱具有致病作用的淡紫拟青霉 (Purpureocillium lilacinum)菌株，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC NO: 60732。
2.如权利要求1所述的菌株在防治烟粉虱中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，将所述菌株培养后制成孢子液、含孢子的菌剂。
4.一种从如权利要求1所述的菌株中提取淡紫拟青霉毒素的方法，其包括如下步骤：
（1）在所述菌株的发酵液加0.8-1.2倍体积的有机溶剂乙酸乙酯;
（2）超声波震荡30-50min以打破细胞壁加速毒素萃取；
（3）震荡后放入0-6 ℃冰箱静置，用分液漏斗把萃取液进行分液，保留萃取后的有机相；
（4）将萃取后的有机相进行蒸发得到粗毒素。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，在第(1)步，第(3)步或/和第(4)步测定其蛋白浓度，监测毒素产生和提取效果。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，在第(1)步中添加的有机溶剂乙酸乙酯的量为所述菌株的发酵液的同等体积。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，其中淡紫拟青霉 (Purpureocillium lilacinum)菌株的发酵液按下述方法制备：
将所述菌株的孢子悬浮液，在恒温摇床内摇瓶发酵后对菌液行抽滤，得到菌丝和发酵液，对发酵液离心取上清备用。
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，第(3)步是放入4℃冰箱中静置，时长20-28h，期间每隔7-9 h搅拌一次。
9.如权利要求4所述的方法，其特征在于，第（4）步所述蒸发是旋转蒸发方式。
10.一种由如权利要求4至9任一项所述的方法获得的淡紫拟青霉毒素粗毒素在防治烟粉虱中的应用。
11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，是将粗毒素液体喷施在作物上。
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