CN105039167B8 - 一种球孢白僵菌dsxj-07及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种球孢白僵菌DSXJ-07，该菌株已进行保藏，藏编号为CGMCC No.7192，其内转录间隔区的序列为SEQ ID No.7192。本发明还提供了该菌株用于防治禾本科作物上害虫的应用，作为制备防治禾本科作物上害虫药物的应用，所述的禾本科作物为水稻、玉米、甘蔗、小麦、大麦或牧草，所述的害虫为稻水象甲及亚洲玉米螟。利用该菌株生产的杀虫真菌制剂，可有效控制稻水象甲及亚洲玉米螟的种群数量。

Description

一种球孢白僵菌DSXJ-07及其应用

技术领域

[0001]本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种球孢白僵菌菌株DSXJ-07,及其该菌 株用于防治农作物害虫的应用。

背景技术

[0002] 稻水象甲（Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel)属鞘翅目，象虫科，沼泽象亚 科，稻水象属。主要危害水稻并以玉米、甘蔗、小麦、大麦、牧草、禾本科杂草等为寄主，具有 危害时间长，繁殖传播速度快，抗药性和抗逆性强等特点。成虫啃食稻叶，幼虫蛀食稻根，一 般造成水稻减产15%〜2〇%，严重的减产50%以上，甚至绝收，是水稻上重要检疫性害虫， 被国际自然保护联盟列为全球100种最具威胁性的外来入侵生物之一。1986年我国将其列 为对外检疫对象。此虫原产地为美国。上世纪70年代初，孤雌生殖型稻水象甲传入亚洲。 I976年，在日本爱知县首见此虫，至1983年，此虫几乎蔓延遍及日本全境。1988年，由日本传 入韩国及朝鲜。我国于I988年在河北省唐海县首次发现稻水象甲。此后，稻水象甲在我国迅 速蔓延，截至2011年底已在我国2〇个省市自治区发现了稻水象甲危害。稻水象甲已经成为 我国水稻生产的一大潜在威胁，我国将其列为近年来重点加强防治的5个外来入侵生物之 〇

[0003]玉米已成为我国的第一大粮食作物(2012年起），作为主要的粮食作物、饲料作物 和加工工业的重要原料，在发展国民经济中具有重要地位。玉米螟是玉米的主要害虫，一般 发生年份引起玉米减产10%，大发生年减产可达3〇%。玉米螟危害成为限制我国玉米产量 的主要因素之一。

[0004]长期以来，我国主要依赖于化学农药防治以上两种害虫，由于化学杀虫剂的大量、 连年施用，使农产品、土壤和水域受到农药残留污染，对人类健康已构成严重威胁和损害； 害虫抗药性的增强，使得用药量不断增加，防治费用倍增;有益天敌生物被大量损伤，生态 环^遭到严重破坏，导致害虫的再增猖獗。为保护生态环境，保证食品和饲料的产量、品质 和安全性，应用生物防治技术大面积控制农业害虫，采取害虫可持续治理措施势在必行。 [0005]昆虫病原真菌是最重要的杀虫微生物类群，在自然条件下约70%的昆虫病害是真 菌引起的。其致病机制复杂，不会引起害虫产生抗性，对解决害虫的抗药性问题极具潜力。 因昆虫病原真菌作为重要的替代农药，近年来受到广泛关注。在我国，球孢白僵菌和绿 /[里囷已被广泛应用于亚洲玉米螺（〇strinia furnacalis Guenge)、飞幢（L〇custa mimtoria)和松毛虫(Dendrolimus punctatus Walker)等多种大田及林业害虫的防治，并 取得了显者的经济、社会和生态效益。截止到2〇〇7年，世界上先后有18〇余种真菌杀虫剂问 世。昆虫病原微生物是唯-通过穿透昆虫体壁主动侵入昆虫的微生物，是鞘翅目和飄式 害^勺最有效的生物防治手段。另外，昆虫麵真菌具有较强的垂直和水平扩散能力，有助 持续控制，对于迁飞性害虫稻水象甲的控制尤为有力，利用杀虫額控制稻水象 =已AJU相关霞，但杀虫效果均不獅，其主要麵之—是缺乏賴水餅具有高毒 力的昆虫病原真菌菌株。

发明内容

[0006]本发明的目的在于提供一种对稻水象甲及亚洲玉米螟两种害虫均有防治效果，且 防治效^及生产性状均良好的球孢白僵菌菌株DSXJ-07,利用该菌株生产的杀虫真菌制剂， 能够大幅度提高对稻水象甲及亚洲玉米螟的防治效果。

[0007]本发明具体通过以下技术方案实现：

[0008]本发明提供的一种球孢白僵菌(beauveria bassiana)DSXJ_〇7，该菌株已进行保 藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心;地址:北京市朝阳区北辰 西路1号院3号;保藏日期:2〇13年01月23日；藏编号:CGMCC No.7192。

[0009]本发明所述的球孢白僵菌DSXJ-〇7的内转录间隔区的序列为SEQ ID如」。

[0010] 一本发明球孢白僵菌DSXJ-07接种在PDA培养基上培养，初期菌落呈白色绒毛状至棉 絮状，产孢后变成淡黄色;菌丝透明，具有分隔和分支，直径为3 • 0_3 • 5wn;分生孢子梗浓密 簇生、轮生或单生，呈帚状分支，大小2_5〜5.5 XI _5〜2.5wn，其末端产生瓶形小梗，大小 15.5〜25.5 X 1 • 5〜3 • Own;从瓶梗的末端以向基式连续形成长串链的分生孢子，分生孢子 为单细胞，呈球形或近球形，大小2〜3 X 2〜2.5um。

[0011] >本发明球孢白僵菌DSXJ-O7用于防治禾本科作物上害虫的应用。所述的禾本科作 物为水稻、玉米、甘蔗、小麦、大麦或牧草，所述的害虫为稻水象甲和亚洲玉米螟。

[0012]本发明球孢白僵菌菌株DSXJ-〇7作为制备防治禾本科作物害虫生物农药的应用， 通过常规的液固双相发酵生产，获得白僵菌高孢粉，然后加入表面活性剂如分散剂、稳定 剂、湿润剂、粘结剂、消泡剂、崩解剂、抗冻剂等中的一种或几种，或吸附载体按一定比例混 合后，制备成可湿性粉剂、水分散粒剂、悬浮剂、悬乳剂、水乳剂或微乳剂;所述的禾本科作 物为水稻、玉米、甘蔗、小麦、大麦或牧草，所述的害虫为稻水象甲及亚洲玉米螟。

[0013]本发明球孢白僵菌菌株DSXJ-07防治禾本科作物上害虫的方法也属于本发明的保 护范围，该方法是在植物生长过程中进行喷雾处理;所述喷雾为球孢白僵菌菌株DSXJ_〇7的 菌悬液或发酵液或代谢产物或制备的农药制剂。

[0014]本发明的有意效果为:本发明从自然感染的稻水象甲僵虫直接分离筛选的球孢白 僵菌菌株DSXJ-〇7,产孢能力强、其生产性状好、生长迅速;同时对稻水象甲及亚洲玉米螟杀 虫活性强、对稻水象甲成虫及亚洲玉米螟3龄幼虫的LTgo值分别为(5.10±0. U)天和(6.'07 ±0 • 52)天。利用该菌株生产的杀虫真菌制剂，可有效控制稻水象甲及亚洲玉米螟的种群数 量。

具体实施方式

[0015 ]下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施 例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示 的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明 的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。 [0016]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0017] 实施例1球孢白僵菌菌株DSXJ-07的分离与鉴定

[0018]将采集到的自然感染的稻水象甲僵虫先用75%酒精浸没3〜5s，再用〇.5%NaC1〇 表面消毒3min，灭菌水冲洗3次，在无菌条件下，用灭菌刀具将感染虫体切成5mm见方小块， 置于9cm PDA平板上培养，放入28°C培养箱中培养3〜5天，使其昆虫表面生长出新鲜孢子； 然后用接种环挑取新鲜孢子在含有50ug/ml头孢霉素和30ug/ml卡那霉素的PDA平板上划 线;将划线好的培养皿倒置于28°C培养箱中培养;3〜4日后挑选出典型而无杂菌的菌落，在 菌落边缘用接种环挑取带有菌丝的一小块培养基，转入平板培养基中央，28°C培养10〜15 天，待产孢后，转移至斜面培养基，获得球孢白僵菌菌株DSXJ-07,4°C保藏。

[0019] 1)形态鉴定

[0020] 将分离到的球孢白僵菌DSXJ-07菌株接种在PDA平板上，28 °C培养观察菌落形态特 征、产孢结构和孢子形状与大小。

[0021]结果显示在PDA培养基上培养初期菌落呈白色绒毛状至棉絮状，产孢后变成淡黄 色;菌丝透明，具有分隔和分支，直径为3 • 0-3.5um;分生孢子梗浓密簇生、轮生或单生，呈帚 状分支，大小2.5〜5.5 XI. 5〜2.5wn，其末端产生瓶形小梗，大小15.5〜25.5 XI. 5〜3. On m;从瓶梗的末端以向基式连续形成长串链的分生孢子，分生孢子为单细胞，呈球形或近球 形，大小2〜3 X 2〜2.5umum。

[0022] 2)球孢白僵菌菌株DSXJ-07的ITS序列扩增、序列测定及分子鉴定

[0023] 将球孢白僵菌DSXJ-07菌株在SDAY液体培养基震荡培养3天(200rpm，28°C)。4。〇， lOOOOrpm离心2〇min，以收集菌丝。液氮研磨破碎后采用真菌基因组DNA提取试剂盒提取球 孢白僵菌DSXJ-07的基因组总DNA。以提取得到的总DNA为模板，参照White设计引物扩增球 孢白僵菌ITSl-5.8S-ITS2rDNA区域。所用引物为I TS15’ -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ 和 ITS45’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，产生550bp扩增产物。扩增条件：94。(：预变性4min，l个 循环;94°C变性lmin，53°C退火0.5min，72°C延伸45s，35个循环;最后72°C延伸10min。采用 凝胶回收试剂盒回收扩增产物，交由生工生物工程(上海)股份有限公司采用双脱氧测序法 测定扩增产物序列。球孢白僵菌DSXJ-07ITS1 -5 • 8S-ITS2rDNA测序结果见SEQ ID No. 1。 [0024] 对所测得的ITS序列与Genbank中已知序列比对，结果表明，与该菌株ITS序列最为 接近的为球孢白僵菌，其ITS序列同源性为％ %，将该菌株鉴定为球孢白僵菌属球孢白僵菌 种（Beauveria bassiana (Bals，Cr iv.) Vuill) 0

[0025]实施例2球孢白僵菌DSXJ-07对稻水象甲室内杀虫活性测定 [0026]收集在^^平板上培养的球孢白僵菌08\11-〇7成熟孢子，用0.05%(1八)吐温-80分 散，配制成终浓度为1 X 107个孢子/ml的悬浮液。从田间采集的稻水象甲成虫饲养在含有稻 苗的带有透气孔的5〇ml离心管中，每管50只稻水象甲，将稻水象甲浸入孢子悬液mi-Ss进 行接种。接种后在28°C，RH = 90%的培养箱中，实验共设置3个重复，以清水为空白对照。每 天记录死虫数，计算稻水象甲存活率，经DPS软件统计分析得LT9q值。

[0027] 实验结果显示，将球孢白僵菌DSXJ-07对稻水象甲有明显的杀虫活性。接种3天后 到达死亡高峰期，稻水象甲成虫感病死亡后虫体僵硬，保湿培养3天后开始从关节处长处白 色菌丝，10天后成虫关节处长满白色孢子。对实验结果进行统计分析发现，将球孢白僵菌对 稻水象甲的LT90为6.07 ± 0 • 52天，尽管高于化学农药水胺.马拉松的LT9Q，但却低于生物农 药绿僵菌及苦参碱的LT9q值(见表1)。

[0028] 表1球孢白僵菌菌株DSXJ-07对稻水象甲致病力(LT90) -.:- ...... .........................：. ,: ..... ......... 菌株 毒力相关方程 »系@ 水胺.马拉松 Y= 1.695 X+1.567 r=0.9809 2 78±〇74

[0029] 白画 Y=0.猶 »1.561 r=G 細!6.〇7±_2 绿8¾ Y=0：J65:1；+1,43¾ 6.34 ±0.28 :普参械： Y=0.531 X+1.056 r «0,9912 .9.84±0.84

[0030]实施例3球孢白僵菌可湿性粉剂防治稻水象甲田间药效试验

[0031]将DSXJ-07菌株白僵菌高孢粉配制成90亿/g白僵菌可湿性粉剂，用喷雾器配制浓 度为9〇亿/g白僵菌可湿性粉剂，田间兑水喷雾。对照药剂（生物农药--苦参碱，化学农 药一一水胺•马拉松） — "

[0032]本实验安排在吉林省公主岭市南崴子镇大榆树村水稻田内，药前调查水稻稻水象 甲百丛虫量，在水稻插秧7d后施药，间隔7d后再次施药，每次施药后3d调查百丛虫量并计算 防效。试验结果如表2所示：

[0033]表2球孢白僵菌可湿性粉剂防治稻水象甲药效试验

[0034] 处理前成虫量(头 3d启成蛊董祕1⑽后成識鸶（头 、 川)0 丛） 綱丛） /IQ〇iL> 權农_ ~^ ~ ；-- 飢 18 8 編嫉:a 機 ； 尨 ； 15 W.讎 b M ; 55： _一 m 64.29% c 菁__^_J_66 43： 46.25% ：i _CK__W_ ：8| ：...... ?i ~~

[0035] 由表2可以看出，球孢白僵菌粉剂能有效防治水稻稻水象甲，防治效果达到 77.94%，虽然没有化学农药效果能达到90• 00%，但均高于对照生物农药绿僵菌及苦参碱 的防效，且差异显著。

[0036] 实施例4球孢白僵菌DSXJ-07对亚洲玉米螟室内杀虫活性测定

[0037]收集在PDA平板上培养的球孢白僵菌DSXJ-07成熟孢子，用0.1% (W/V)吐温-80分 散，配制成终浓度为1.5X 106个孢子/ml的悬浮液。将人工培养的供试亚洲玉米螟3龄幼虫 浸入孢子悬液中1〜2s进行接种。接种后将玉米螟3龄幼虫单头放入装有滤纸条的离心管 中。离心管管口用棉球塞好，以保持通气。对照组用等量的〇. i %吐温-80无菌水接种。将处 理和对照均置于25°C ;RH = 90%条件下。实验共设置4个重复，每个重复2〇头玉米螺3龄幼 虫。以实验室保存的玉米螟高毒力菌株GS-18为对照菌株。三日内向离心管内加水以保持高 湿，第二天起逐日调查统计感染死亡虫数，并记录僵虫数，累计调查15d，最后统计累计死亡 率。 _8]球孢白僵菌DSXj-07对亚洲玉米螟有明显的杀虫活性。接种3天后到达死亡高峰 期，亚洲玉米螟幼虫感病死亡后虫体僵硬，保湿培养3天后开始从虫体处长出白色菌丝，6天 后虫体长M白色孢子。试验结果如表3所不，由表3可以看出，球孢白僵菌菌株dsxj-〇7能有 效防治玉米螟，校正死亡率达到M.74%，虽然低于化学农药98_68%g防效，但却高于实验 室原有保存CK囷株，且差异显著;LTgo值仅为5 • 10d，尽管没有化学农药低，但却低于实验室 原保存CK菌株，且差异显著。可见，球孢白僵菌菌株DSXJ-07对玉米螟有很好的杀虫活性。 [0039]表3球孢白僵菌菌株DSXJ-07对玉米螟的致病力

[0040] mtm ^ | ....... 無¥毒^着相_ ^时 数（头)包翁复复（％>率 程 数 扣 ^ ^ it I 鳴爾 _ ____Wj_： 麵難 10 10 I MM 98.68a ; 2識±:: ___g 6 〇___槪 1 •瓣 0.g809 ：賺:a :職爾 賴 1：9 1 ： J f 95,00： 94m Y=l；jl9 3C+ 細戈： 致：發 0 b 〇j6f 0J7S7 H O.Iife 纖 80 19 ^ 1 1 «.〇§ 89 4¾ ^=0-486 X+ r=： IM± ___;r [ 7 m I ' 2.095 0i675 ； ： 0,3¾

[0041] 实施例5球孢白僵菌菌株DSXJ-07粉剂喷施玉米秸杆垛防治玉米螟药效试验

[0042] 试验时间：2013年4月15日至20日 〜

[0043] 试验地点:吉林省公主岭市

[0044] 试验材料：

[0045]制剂：由白僵菌菌株DSXJ_〇7制得的白僵菌粉剂;性状：白色粉末，无特殊气味，有 效含量25〜30亿孢子/克。

[0046]仪器:背负式机动喷粉机一台。

[0047]试验方法:在吉林省公主岭市黑林子镇不同村屯选取有代表性的5个玉米秸杆垛 作为试验对象，将白僵菌粉剂装入机动喷粉机内，将喷粉机的喷粉管插入洞内，启动喷粉 机，喷施3-5s，再喷第二个位置（1点/m3)，如此重复直到全垛喷完为止。认真检查洞中喷施 的均匀程度，最后将整个秸杆垛四围用机动喷粉机再彻底、全面喷洒一遍。

[0048]在喷粉防治后1个月内进行玉米秸秆垛内玉米螟幼虫僵虫率调查。采用随机调查 方法，选择有代表性的不同对照区及处理区，分别记录每点100株玉米秸秆内玉米螟幼虫活 虫数、死虫数、僵虫数、其他死亡虫数(细菌、蜂寄生和蝇寄生）、活蛹数(见表4)。在秋后系统 调查喷粉秸杆垛周围玉米田玉米植株危害情况(见表5)。

[0049] 表4:白僵菌粉剂喷施秸秆垛后玉米螟幼虫僵虫率调查表 [0050]_ __活虫数 僵虫数 11¾ |蜂寄生 丨蝇寄生 |蛹 |僵虫率 处理一 6__71__1__0___1__0 89.87%a 处理二 8__75__〇__1__2 1 86.21%a 处理三 4__69__2__2__ 2 1 86.25%a &細-----—______2__~1 I 2 | 86.67%^~~ &_五-----—______2___〇__〇_ 86.52%a CK 68 I 15 2 2 」__2 16.67%b

[OO51]由表4可以看出白j畺菌粉剂喷施玉米秸秆垛后，垛内玉米螟幼虫僵虫率明显上 升，均超过了86.00%，远远高于对照区的16.67%，施用白僵菌粉剂各组玉米垛中玉米螟幼 虫受白僵菌寄生明显增强，玉米螟幼虫僵虫率达86%以上。应用白僵菌喷施玉米垛简便易 于推广，可以有效地控制玉米螟种群基数，从源头上控制玉米螟的危害。

[0052]由表5可以看出：对照田的被害株、駐孔数、活虫数明显高于各处理田；各处理田被 害株减退率均咼于50%，处理四的被害株减退率达到7〇_ 14% ;各处理田虫孔减退率均超过 了60%，处理五的虫孔减退率达到75 • 29% ;各处理田虫口减退率均超过了6〇%，处理四的 虫口减退率最小为64 • 71 %，处理三的虫口减退率最高，达到S1 • 3?% ;各处理平均防效均超 过 65 %。

[0053]表5:白僵菌粉剂喷施玉米稻秆燦后附近玉米田玉米螟危害发生情况调查表 [0054] ~ 一 10被謙被害率1I蛀孔数I丨活虫数:I加輔丨平均跪 __m___姨退率 燦率 退率 激 .处理 会⑽：：歡幢部私 31 63. 53% 30 T0, 59% 6:5. 54%: 处理— 鑛0. : ：55 丨丨 27:..荩麵 ^1,.81¾ 33 61. .18% :海 74.51% 65.83% :处理..二;__这⑽：：67 ：： 33^50%. :53：.47% 28 ¢7.06% : 1|9 81.37% 67.30% : 斑遒四：2⑽：I m m 50% 70.1 纖—雜 m m 64. 71%~~66. 91% .敏屬衰____|4__32. 00% 55. 5^% 21 75. 29% 2.9 7L 57f〇 ： 67. 47% 一饭 2：〇〇； | m： -[- mom： | — m j —:…細 ~~—~~~

[0055]从白僵菌菌株DSXJ-07制得的白僵菌粉剂喷施玉米秸秆垛防治玉米螟试验结果可 以看出：白僵菌粉剂封垛防治玉米螟，明显提高了垛内玉米螟幼虫的僵虫率，对垛内玉米螟 幼虫的平均防治效果都在86%以上，降低了玉米螟当年发生的种群基数，从而从源头控制 了玉米螟的危害。从白僵菌粉剂喷施玉米秸杆垛后附近玉米田玉米螟危害发生情况调查结 果可以看出：附近玉米田玉米螟发生明显减轻，处理田在被害株、蛀孔数、活虫数方面明显 低于对照田，在被害株减退率、虫孔减退率、虫口减退率三个方面的平均防治效果均超过了 65%，说明该菌株对玉米螟具有很好的防治效果。

Claims (6)

1.一种球孢白僵菌(Beauveria bassiana) DSXJ-07，其特征在于:该菌株已于2013年01 月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCCNo.7192〇

2. 根据权利要求1所述的一种球孢白僵菌DSXJ-07，其特征在于：所述的球孢白僵菌 DSXJ-07的内转录间隔区的序列如SEQ ID No.l所示。

3. 权利要求1或2所述的球孢白僵菌DSXJ-07在防治禾本科作物上害虫的应用，所述的 害虫为稻水象甲及亚洲玉米螟。

4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的禾本科作物为水稻、玉米、甘蔗、小 麦、大麦或牧草。

5.权利要求1或2所述的球孢白僵菌DSXJ-07在制备防治禾本科作物上害虫的药物的应 用，所述的害虫为稻水象甲及亚洲玉米螟。 一

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于:所述的禾本科作物为水稻、玉米、甘蔗、小 麦、大麦或牧草。