CN112205423B - 一种病原真菌的应用、防治害虫的方法及杀虫剂 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物防治领域，提供了一种病原真菌的应用、防治害虫的方法及杀虫剂。本发明为了解决化学农药防治害虫存在的药剂残留、选择性差、持效期短等问题，分离得到两种真菌，并分别测定了这两种真菌的生物学特性及抗虫活性，经实验证明，本发明中所述的病原真菌具有良好的抗虫活性且侵染范围广泛，可用作生防菌株。本发明为害虫的生物防治提供了备选菌株。

Description

一种病原真菌的应用、防治害虫的方法及杀虫剂
技术领域
本发明属于生物防治领域，具体涉及一种病原真菌的应用及杀虫剂。
背景技术
因化学杀虫剂药剂残留问题严重，目前利用生物手段来防治害虫成为重要选择。利用昆虫病原菌(例如白僵菌、绿僵菌)防治害虫，被认为是一种有效的绿色防控手段。但一些害虫例如双斑长跗萤叶甲(Monolepta hieroglyphica)，缺少绿色防控手段，尚未见到利用昆虫病原菌防治双斑长跗萤叶甲的报道。绿僵菌作为昆虫病原菌被广泛应用于害虫防治，具有较好的防治效果，其中金龟子绿僵菌由于毒力强、侵染范围广、持效时间长等优点，被应用的最广。
双斑长跗萤叶甲(Monolepta hieroglyphica)属于鞘翅目叶甲科，分布范围广，取食能力强，是一种杂食性昆虫，除了危害玉米外，还危害高粱、大豆、棉花等，目前主要采取化学防治方法防治，害虫数量较少时可进行人工捕捉，有关生物防治的手段较少。绿豆象(Callosobruchus chinensis)属于鞘翅目豆象科，成虫在仓库豆粒或田间豆荚上产卵，从而降低绿豆产量和绿豆品质。玉米蚜(Rhopalosiphum maidis)属于同翅目蚜科，可以危害玉米、水稻，繁殖能力强，还能传播多种禾本科谷类病毒。目前主要施用化学农药控制玉米蚜，不仅影响人体健康、造成生态环境污染，长期施用还会导致蚜虫产生抗药性，导致蚜虫的再猖獗，难以控制。因此选择一种安全有效的微生物制剂来代替化学农药具有重大的意义。
发明内容
为了避免利用化学手段防治害虫所产生的问题，并为害虫的生物防治提供备选菌株，本发明提供了一种病原真菌在生物防治上的应用，所述病原真菌为：菌株编号为SGSF001的肉色基思菌(Keithomyces carneus)和菌株编号为SGSF221的金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)。上述两株菌株均保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期均为2020年9月29日，保藏单位地址均为湖北省武汉市武昌区八一路199号武汉大学保藏中心，其中菌株SGSF001的保藏编号为CCTCC No:M 2020554；菌株SGSF221的保藏编号为CCTCCNo:M 2020556。
在本发明的一个实施例中，将菌株SGSF001或菌株SGSF221制备成孢子悬液，用于生物防治。
在本发明的一个实施例中，上述生物防治指的是害虫防治。
在本发明的一个实施例中，上述害虫为双斑长跗萤叶甲(Monoleptahieroglyphica)、绿豆象(Callosobruchus chinensis)和玉米蚜(Rhopalosiphum maidis)中的一种或两种以上。
本发明还提供了将所述病原真菌作为杀虫剂有效成分用于生物防治的应用。
进一步地限定，所述杀虫剂杀灭或抑制的害虫为双斑长跗萤叶甲(Monoleptahieroglyphica)、绿豆象(Callosobruchus chinensis)和玉米蚜(Rhopalosiphum maidis)中的一种或两种以上。
本发明还提供了一种防治害虫的方法，所述方法包括利用病原真菌孢子悬液处理害虫的步骤，所述病原真菌为菌株编号是SGSF001的肉色基思菌(Keithomyces carneus)，保藏编号为CCTCC No:M 2020554；或菌株编号为SGSF221的金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)，保藏编号为CCTCC No:M 2020556。
在本发明的一个实施例中，上述防治害虫的方法中防治的害虫为双斑长跗萤叶甲(Monolepta hieroglyphica)、绿豆象(Callosobruchus chinensis)和玉米蚜(Rhopalosiphum maidis)中的一种或两种以上。
进一步地限定，所述处理害虫的条件是24℃-26℃、相对湿度65％-75％和24h全黑暗。
本发明还提供了一种杀虫剂，所述杀虫剂有效成分为病原真菌，所述病原真菌为菌株编号是SGSF001的肉色基思菌(Keithomyces carneus)，保藏编号为CCTCC No:M2020554；或为菌株编号为SGSF221的金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)，保藏编号为CCTCC No:M 2020556。
在本发明的一个实施例中，对所述菌株SGSF001和SGSF221进行分子生物学鉴定的方式为：通过提取DNA并进行PCR扩增的方法对两株真菌进行了初步鉴定。此外，结合通过对两株真菌的TEF片段进行扩增的结果，确定了两株真菌的相似性及所属菌种。
在本发明的一个实施例中，对所述菌株SGSF001和SGSF221进行的形态学鉴定包括以下内容：统计所述两种真菌在不同培养基上的生长速度、菌落大小、颜色及菌落特征，还包括利用光学显微镜观察所述两种真菌在不同培养基及不同昆虫表面形成的真菌孢子、色素、渗出物、产孢结构与菌丝等特征。
在本发明的一个实施例中，对所述菌株SGSF001和SGSF221进行了生物学特性的测定，包括对不同温度及pH下菌株生长速率及产孢量的测定。
在本发明的一个实施例中，对所述两种病原真菌进行了抗虫活性测定，测定方法为分别制备所述两种病原真菌的孢子悬液，再通过不同的方法用其孢子悬液处理双斑长跗萤叶甲、绿豆象及玉米蚜。在完成接种后，进行培养，每日统计害虫的死亡率与校正死亡率，并观察两株真菌对三种昆虫的侵染情况。
有益效果
本发明提供了2株病原真菌，菌株SGSF001(Keithomyces carneus)，最早分类学地位为肉色拟青霉(Paecilomyces carneus)，2014年被命名为肉色绿僵菌(Metarhiziumcarneum)，2020年被命名为肉色基思菌(Keithomyces carneus)。该属菌种有关其生物活性的报道较少，查阅文献发现除了对玉米螟(Ostrinia nubilalis)具有一定的抗虫活性外，无其他活性被报道。菌株SGSF001及菌株SGSF221的抗虫活性测定结果表明，两株真菌对双斑长跗萤叶甲、玉米蚜和绿豆象均具有良好的抗虫活性，可以侵染多种害虫，防治范围广，此外由于两株真菌还具有产孢量大，易于培养，耐受pH范围广泛等特点，而具有良好的抗害虫的生物防治潜力，可用作生防菌株。
附图说明
图1.A为菌株SGSF001在PDA培养基上的菌落形态特征；B为菌株SGSF221在PDA培养基上的菌落形态特征；
图2.A为菌株SGSF001侵染双斑长跗萤叶甲后在其表面形成的菌丝特征；B为菌株SGSF001侵染玉米蚜后在其表面形成的菌丝特征；C为菌株SGSF001侵染绿豆象后在其表面形成的菌丝特征；
图3.A为菌株SGSF221侵染双斑长跗萤叶甲后在其表面形成的菌丝特征；B为菌株SGSF221侵染玉米蚜后在其表面形成的菌丝特征；C为菌株SGSF221侵染绿豆象后在其表面形成的菌丝特征；
图4.A为菌株SGSF001和SGSF221的双斑长跗萤叶甲毒力测试结果；B为菌株SGSF001和SGSF221的玉米蚜毒力测试结果；C为菌株SGSF001和SGSF221的绿豆象毒力测试结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
按以下培养基配方配制培养基备用：
马铃薯葡萄糖培养基(PDA)：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，定容至1L。
麦芽提取物琼脂培养基(MEA)：麦芽浸粉30g，琼脂20g，水1L。
平板计数琼脂培养基(PCA)：胰蛋白胨5g，酵母浸粉2.5g，葡萄糖1g，琼脂20g，水1L。
萨氏培养基(SDAY)：酵母浸粉10g，葡萄糖40g，蛋白胨10g，琼脂20g，1L水。
燕麦培养基(OA)：燕麦30g，琼脂20g，水1L。
实施例1、病原真菌的分离及鉴定
(1)菌株SGSF001和菌株SGSF221的分离
以大兴安岭林下凋落物为分离源，进行菌株的分离。首先将采集到的经风干的凋落物样品粉碎至颗粒状，用滤网过滤得到凋落物样品颗粒大小在100-200μm的颗粒。然后利用平板稀释法，将颗粒状的样品与无菌水按照1:100的质量比混合，制备成颗粒混悬液。再用移液枪吸取50μL、100μL、150μL、200μL和250μL分别涂抹至PDA培养基平板上，用涂布棒涂布至颗粒均匀分散，放置于室温下培养，每12h观察一次，待真菌菌落长出，将菌落挑取至PDA平板，进行纯化。经纯化培养得到两株真菌，将其编号分别为SGSF001和SGSF221。
(2)两株病原真菌的分子生物学鉴定及形态学鉴定
首先利用CTAB法对已纯化的菌株进行总DNA的提取，然后利用真菌通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)对内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer，ITS)进行PCR扩增，用于初步鉴定。由于对于绿僵菌菌属来说，翻译延伸因子1-α(Translation elongation factor 1-α，TEF)比ITS序列，含有更多的绿僵菌种间差异的信息，所以利用引物EF-983F(GCYCCYGGHCAYCGTGAYTTYAT)和EF-2218R(ATGACACCRACRGCRACRGTYTG)进一步对目标真菌的TEF序列片段进行扩增。PCR产物经电泳检测后，送至测序公司进行双向测序。将测序后获得的可信序列，利用NCBI网站的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool，https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)进行比对分析。
通过对真菌的ITS片段以及TEF片段进行扩增及利用BLAST工具对比可知，与菌株SGSF001最相近的菌种为肉色基思菌(Keithomyces carneus)，相似性为100％；与菌株SGSF221最相近的菌种为金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)，相似性为100％，具体的分子鉴定结果如表1所示。
表1菌株SGSF125及菌株SGSF355的分子鉴定结果
Figure BDA0002724004260000061
Figure BDA0002724004260000071
将分离纯化获得的病原真菌转接至PDA、MEA、SDAY、OA、PCA培养基上，培养14天后，记录真菌的生长速率、菌落大小、颜色及菌落特征。另外，利用光学显微镜观察真菌在不同培养基及其不同昆虫表面形成的真菌孢子、色素与渗出物、产孢结构与菌丝等特征，对比相关文献进行形态学鉴定。
实验结果表明，菌株SGSF001在不同培养基上的菌落为白色或浅棕色，表面光滑无褶皱，菌落背面为淡黄色或褐色。如图1中的A所示，菌株SGSF001在25℃条件下PDA培养基上培养14天后，菌落正面为白色绒毛状、有较少褶皱，菌落背面为浅褐色、褶皱与正面相对应，菌落直径为23.5mm。该菌株在光学显微镜下分生孢子为球形至近球形，表面光滑，大小为2.44-4.28×2.36-4.28μm，分生孢子梗具有二级分枝，且次级分枝呈管瓶状，分枝较多，大小为9.11-20.23×2.38-3.81μm。菌株SGSF001侵染双斑长跗萤叶甲、玉米蚜和绿豆象后在其表面形成的菌丝特征如图2所示。结合形态学特点和分子鉴定结果，可以确定号菌株SGSF001为肉色基思菌Keithomyces carneus(曾用名Metarhizium carneum)。
如图1中的B所示，金龟子绿僵菌SGSF221在PDA培养基上培养14天后，菌落正面中间墨绿色，外围橄榄绿色，菌落背部白色，边缘菌丝呈放射状。该菌株在光学显微镜下分生孢子呈圆柱形至长圆形，有的略有弯曲，两端基本对称，截断处较为平滑圆润，大小为(2.56～4.61)μm×(2.44～3.87)μm。体式显微镜下观察，分生孢子梗多级分支，分生孢子绿色、串生。菌株SGSF221侵染双斑长跗萤叶甲、玉米蚜和绿豆象后在其表面形成的菌丝特征如图3所示，该菌侵染昆虫后首先从腹部长出白色菌丝，初期产生白色产孢结构与分生孢子，后来分生孢子变为绿色，遍布全身。结合形态学特点和分子鉴定结果，可以确定SGSF221号菌株为金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)。
两株植物病原真菌的菌种信息如表2所示。
表2菌株SGSF001及菌株SGSF221的菌种信息
Figure BDA0002724004260000081
实施例2、两株病原真菌的生物学特性
1.实验方法
(1)不同温度下菌株生长速率及产孢量测定
用打孔器分别在菌株SGSF001与菌株SGSF221的菌落上打孔，再分别转接至PDA培养基上，并分别置于20℃、25℃、30℃、35℃培养箱培养，每个处理重复三次，每天定时测量菌落生长直径，共测量14d。测量实验结束时在平板上加入5mL灭菌的1％吐温80水溶液，刮取表面孢子，用无菌棉花过滤掉多余菌丝体和琼脂后，利用血球计数板测定产孢量。
(2)不同pH下菌株生长速率及产孢量测定
用打孔器分别在菌株SGSF001与菌株SGSF221的菌落上打孔，再分别转接至pH分别为4、5、6、7、8、9的PDA培养基上，每个处理重复三次，置于25℃培养箱培养14d，每天定时测量菌落生长直径。测量实验结束时在平板上加入5mL灭菌的1％吐温80水溶液，刮取表面孢子，用无菌棉花过滤掉多余菌丝体和琼脂后，利用血球计数板测定产孢量。
2实验结果
(1)不同温度下菌株生长速率及产孢量测定结果
表3为不同温度下菌株的生长直径测定结果，由表3可知，菌株SGSF001在20℃和25℃时长势良好，在30℃和35℃时停止生长；菌株SGSF221在20℃、25℃和30℃下长势良好，在35℃时生长速率减慢。表4为不同温度下菌株产孢量，由表4可知菌株SGSF001在20℃和25℃时产孢量变化较小，菌株SGSF221在25℃时产孢量最大，在20℃和30℃时产孢量轻微下降。
表3不同温度下菌株的生长直径测定结果
Figure BDA0002724004260000091
注：单位为mm，菌落直径已去除菌饼直径6.5mm。
表4不同温度下菌株的产孢量测定结果
Figure BDA0002724004260000092
注：单位为“个”，表中数据为每个PDA培养基培养14天后总产孢量。
(2)不同pH下菌株生长速率及产孢量测定结果
表5为不同pH下菌株的生长直径测定结果，由表5可以看出，菌株SGSF001的生长受pH影响较小，在pH 4-9时能够生长稳定；菌株SGSF221在pH 4时生长速率明显减慢，在pH 5-9时生长稳定。表6为不同pH下菌株的产孢量测定结果，由表6可以看出，SGSF001号菌株在不同pH下都有较高的产孢量，SGSF221号菌株在pH 4时产孢量低于其它pH。根据表5和表6可知SGSF001号菌株对pH耐受范围较广，可以在pH 4-9条件下生长；SGSF221号菌株适合在pH 5-9的条件下生长。
表5不同pH下菌株的生长直径测定结果
Figure BDA0002724004260000101
注：单位为mm，菌落直径已去除菌饼直径6.5mm。
表6不同pH下菌株的产孢量测定结果
Figure BDA0002724004260000102
注：单位为“个”，表中数据为每个PDA培养基培养14天后总产孢量。
实施例3、两株病原真菌抗虫活性测定
(1)试验方法
首先制备孢子悬液，将菌种接于PDA培养基上培养14d后，平板上加入5mL的灭菌的0.05％吐温80水溶液，刮取表面孢子。用灭菌棉花过滤掉多余菌丝体和琼脂后，利用血球计数板计数，将孢子悬浮液最终调整至浓度为1×108spores/mL。
将双斑长跗萤叶甲(成虫)浸泡在1×108spores/mL浓度的孢子悬液中5s，然后转移至装有玉米粒的三角瓶内观察，每个处理接种35只成虫。将绿豆象(成虫)浸泡在1×108spores/mL浓度的孢子悬液中5s，然后用毛笔转移至装有绿豆的三角瓶内观察，每个处理接种20只成虫。用毛笔将无翅玉米蚜转移至培养皿内，采用喷雾法，将1×108spores/mL孢子悬液均匀的喷洒在虫子体表，每次喷洒1mL孢子悬液，再将处理过的玉米蚜转移至甘蓝叶上，每个处理接种40只玉米蚜。各处理重复三次，用灭菌的0.05％吐温80水溶液作为溶剂对照。完成接种后，所有三角瓶转移至25±1℃，相对湿度70％±5％，24h全黑暗条件的培养箱内培养，每日统计死亡率与校正死亡率，并将死虫转移至铺有无菌湿润滤纸的培养皿内观察真菌侵染情况。
(2)实验结果
如图2和图3所示，菌株SGSF001和菌株SGSF221对双斑长跗萤叶甲均有较高的致死率，死亡率随接种时间逐渐增加，两株菌的致死中时间均在3d左右，接种8d时校正死亡率在90％左右，本实验证明两株病原真菌对双斑长跗萤叶甲均有较好的防治能力。两株病原真菌接种绿豆象5d时，菌株SGSF001和菌株SGSF221致死率逐渐上升，其中菌株SGSF221的致死率显著升高，在接种6d时校正死亡率达到100％，本实验证明菌株SGSF221对绿豆象有较强的侵染能力。两株真菌对玉米蚜都有很强的致死效果，在接种第三天时死亡率均达到100％，致死中时间均在1d以内。由表7可知，两株真菌对双斑长跗萤叶甲活性效果最显著，僵虫率达到90％以上，其次是对绿豆象和玉米蚜的活性效果。这一部分结果证实，这两株菌(SGSF001和SGSF221)都具有良好的抗虫活性，可以侵染多种害虫，防治范围广，表明两株真菌具有良好的害虫的生物防治潜力，可用作生防菌株。
表7菌株SGSF001及菌株SGSF221的抗虫活性测定结果
Figure BDA0002724004260000111
Figure BDA0002724004260000121
SEQUENCE LISTING
<110> 黑龙江省农业科学院齐齐哈尔分院
<120> 一种病原真菌的应用、防治害虫的方法及杀虫剂
<130>
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<170> PatentIn version 3.5
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tccgtaggtg aacctgcgg 19
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<211> 23
<212> DNA
<213> EF-2218R
<400> 4
gcyccygghc aycgtgaytt yat 23

Claims (7)

1.一种病原真菌在防治害虫上的应用，其特征在于，所述病原真菌为菌株编号是SGSF001的肉色基思菌(Keithomyces carneus)，保藏编号为CCTCC NO:M 2020554；或菌株编号为SGSF221的金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)，保藏编号为CCTCC NO:M2020556；所述害虫为双斑长跗萤叶甲(Monolepta hieroglyphica)、绿豆象(Callosobruchus chinensis)和玉米蚜(Rhopalosiphum maidis)中的一种或两种以上。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将菌株SGSF001或菌株SGSF221制备成孢子悬液用于防治害虫。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将所述病原真菌作为杀虫剂有效成分用于防治害虫。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述杀虫剂杀灭或抑制的害虫为双斑长跗萤叶甲(Monolepta hieroglyphica)、绿豆象(Callosobruchus chinensis)和玉米蚜(Rhopalosiphum maidis)中的一种或两种以上。
5.一种防治害虫的方法，其特征在于，所述方法包括利用病原真菌孢子悬液处理害虫的步骤，所述病原真菌为菌株编号是SGSF001的肉色基思菌(Keithomyces carneus)，保藏编号为CCTCC NO:M 2020554；或菌株编号为SGSF221的金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)，保藏编号为CCTCC M 2020556；所述害虫为双斑长跗萤叶甲(Monoleptahieroglyphica)、绿豆象(Callosobruchus chinensis)和玉米蚜(Rhopalosiphum maidis)中的一种或两种以上。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述处理害虫的条件是24℃-26℃、相对湿度65％-75％和24h全黑暗。
7.一种杀虫剂，其特征在于，所述杀虫剂有效成分为病原真菌，所述病原真菌为菌株编号是SGSF001的肉色基思菌(Keithomyces carneus)，保藏编号为CCTCC NO:M 2020554；或为菌株编号为SGSF221的金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)，保藏编号为CCTCC NO:M 2020556；所述杀虫剂杀灭或抑制的害虫为双斑长跗萤叶甲(Monoleptahieroglyphica)、绿豆象(Callosobruchus chinensis)和玉米蚜(Rhopalosiphum maidis)中的一种或两种以上。
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