CN104621185A - 一种金龟子绿僵菌菌株在制备杀蚜虫的药剂中的应用 - Google Patents

Abstract

金龟子绿僵菌CQMa421菌株在制备防治蚜虫的药剂中的应用。防治蚜虫的药剂由绿僵菌CQMa421干孢子粉（35-52%）、硅藻土(40-50%)、纳米氧化铝（1-2%）、羧甲基纤维素钠（3-5%）、OP-10 （2-4%）和HEL-40（2-4%），均以重量百分比。本发明金龟子绿僵菌CQMa421菌株能侵染桃蚜和萝卜蚜，致死率可分别达到71.5%和70.8%，采用本发明增强毒力的方法制得的金龟子绿僵菌CQMa421菌株，其致死率可达到100%，提高约30%，效果非常突出。本发明金龟子绿僵菌制剂中各成分的有效配合、起到了协同增效作用，采用本发明金龟子绿僵菌制剂兑水喷雾，对桃蚜和萝卜蚜的田间防效达到80%以上，该制剂具有良好的抗紫外和润湿分散特性，且保持了长期储存中的生物活性，贮存时间可长达12个月。

Description

一种金龟子绿僵菌菌株在制备杀蚜虫的药剂中的应用

技术领域

本发明涉及一种金龟子绿僵菌菌株的新应用，具体涉及一种杀蚜虫金龟子绿僵菌制剂及其应用，属于生物农药领域。

背景技术

菜蚜是重要的蔬菜害虫，除直接取食危害外，还是多种植物病毒的主要传播媒介，后者的危害常超过直接吸食。其中我国主要菜蚜包括桃蚜和萝卜蚜是广食性害虫，寄主主要有梨、桃、李、梅、樱桃等蔷薇科果树和白菜、甘蓝、萝卜、芥菜、芸苔、芜菁、甜椒、辣椒、菠菜等多种作物。萝卜蚜可为害白菜、菜心、萝卜、芥蓝、青花菜、薹菜等十字花科蔬菜，常与桃蚜混合发生。目前，主要施用广谱性化学农药控制蚜虫，不仅直接影响人体健康和水产养殖业的安全，而且由于蚜虫产生抗药性和化学农药大量杀伤蚜虫天敌，破坏生态平衡，严重削弱田间自然控制能力，容易导致蚜虫的再猖獗、难以控制。采用安全的微生物制剂替代化学农药成为蚜虫控制的重要发展方向。

昆虫病原真菌是最重要的杀虫微生物类群，具有安全、持续控制和昆虫不易产生抗药性的优点。绿僵菌（Metarhizium）是最早用于防治害虫的昆虫病原真菌之一，能感染全世界约有200多种昆虫。利用绿僵菌来防治害虫的研究与实践已愈百年，目前已分离筛选到多个侵染蚜虫的菌株，一些菌株制剂被登记用于控制蚜虫，但未能大量广泛用。主要原因是缺乏高毒力杀虫真菌菌株和相应制剂。

金龟子绿僵菌CQMa421是一株从自然感染的稻纵卷叶螟僵虫上分离筛选出的一株生产性状好、对稻纵卷叶螟具有高毒力杀虫真菌，已在中国专利CN102212483中公开，该菌株于2011年02月25日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，保藏编号：CGMCC NO.4609。 该菌株及其制剂对蚜虫的毒力与防治效果未见报道。可湿性粉剂是一种最基本的农药剂型，可制成悬浊液，进行喷雾。杀虫真菌可湿性粉剂是由真菌孢子粉中加入一定量的表面活性剂和填充料，通过过筛制成。由于真菌孢子活性受润湿剂的影响，制剂中往往减少表面活性剂的用量，导致湿润分散效果差，同时产品贮存期仍较短，防效受紫外影响大。因此，筛选驯化高毒力菌株和研制湿润分散特性良好、防效稳定的真菌杀虫剂可湿性粉剂，提高其其贮存稳定性，可促进蚜虫的生物控制，减少化学农药用量。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种金龟子绿僵菌菌株在杀蚜虫中的应用。

本发明第二目的在于提供一种金龟子绿僵菌制剂，该制剂耐紫外照射、保存期长、防效好。

本发明第三目的在于提供一种增强金龟子绿僵菌毒力的方法，该方法不影响其产孢和耐热特性。

本发明目的是通过如下技术方案实现的：

金龟子绿僵菌CQMa421菌株在制备预防或防治蚜虫的药剂中的应用。

优选地，金龟子绿僵菌CQMa421菌株在制备预防或防治桃蚜或萝卜蚜的药剂中的应用。该菌株对桃蚜和萝卜蚜具有侵染作用，致死率可分别达到71.5%和70.8%。

不同的绿僵菌菌株具有侵染不同虫害，如公开报道：金龟子绿僵菌FI-1045菌株能侵染甘蔗蛴螬（Anoplophora glabripennis），金龟子绿僵菌A ESALQ818菌株能侵染埃及斑蚊(Aedes aegypti)，金龟子绿僵菌EAMb 09/01-Su菌株能侵染地中海果实蝇，金龟子绿僵菌PDRL526菌株能侵染萝卜蚜（Lipaphis erysimi），金龟子绿僵菌M2 菌株能侵染螺旋粉虱（Aleurodicus dispersus Russell），金龟子绿僵菌ICIPE-30菌株能侵染冈比亚按蚊（anopheles gambiae），金龟子绿僵菌ESC 1菌株能侵染白蚁，金龟子绿僵菌ATCC62176能侵染甜菜根蛆（sugarbeet root maggot），金龟子绿僵菌M105菌株能侵染蝗虫，金龟子绿僵菌广谱菌株F-52能侵染蛴螬（Anoplophora glabripennis）、核桃象甲、光滑足距小蠹（Xylosandrus germanus），金龟子绿僵菌广谱菌株549能侵染烟草天蛾(Manduca sexta)、埃及斑蚊（Aedes aegypti），罗伯茨绿僵菌广谱菌株ARSEF 23能侵染蝗虫、鳞翅目幼虫、甲虫等。

优选地，上述防治蚜虫的药剂由绿僵菌CQMa421干孢子粉35-52%、硅藻土40-50%、纳米氧化铝1-2%、羧甲基纤维素钠 3-5%、OP-10 2-4% 和 HEL-40 2-4%组成，均以重量百分比。

一种金龟子绿僵菌制剂，其特征在于：它是由硅藻土40-50%、纳米氧化铝1-2%、羧甲基纤维素钠 3-5%、OP-10 2-4%、HEL-40 2-4%和绿僵菌CQMa421干孢子粉35-52%组成，均以重量百分比。

上述各组分均为本领域明确的组分，OP-10为烷基酚聚氧乙烯醚，HEL-40为氢化蓖麻油与环氧乙烷缩合物，绿僵菌CQMa421在中国专利CN102212483中公开、该菌株于2011年02月25日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏、保藏编号：CGMCC NO.4609；纳米氧化铝为粒径为纳米级的氧化铝。

上述OP-10 和HEL-40优选纯度>95%的OP-10 和HEL-40；上述羧甲基纤维素钠（CMC）优选纯度大于95%；上述硅藻土优选为白色至浅褐色疏松粉末，纯度大于85%，含水量小于1%；上述纳米氧化铝优选为粒径小于40nm。上述绿僵菌CQMa421干孢子粉为纯孢子粉，含孢量≥150亿孢子/克，含水量≤5%；以上均以质量百分含量计。

上述金龟子绿僵菌制剂中纳米氧化铝能够附着在真菌孢子表面，有效阻隔了制剂中高浓度（2-4wt%）OP-10 和 HEL-40的不良影响，有效保证了孢子的生物活性。

进一步优选地，本发明金龟子绿僵菌制剂，其特征在于：它是由硅藻土40-45%、纳米氧化铝1.3-1.7%、羧甲基纤维素钠 3-5%、OP-10 2-4%、HEL-40 2-4% 和绿僵菌CQMa421干孢子粉40-50%组成，均以重量百分比。

上述绿僵菌CQMa421干孢子粉优选采用强毒力金龟子绿僵菌CQMa421孢子粉，所述强毒力金龟子绿僵菌CQMa421孢子粉由以下方法得到：在28℃、湿度50-70%环境中，将金龟子绿僵菌CQMa421接种于桃蚜幼虫后饲养，将最先感病死亡的桃蚜幼虫放入28℃培养箱中保湿培养3-5天，使其昆虫表面生长出新鲜孢子；收集新鲜孢子，再接种萝卜蚜幼虫，同上获得昆虫表面生长出的新鲜孢子，如上所述循环接种桃蚜和萝卜蚜15次得到驯化后的金龟子绿僵菌CQMa421新鲜孢子；在无菌条件下，用接种环挑取驯化后新鲜孢子在含有100微克/毫升氨苄青霉素的1/4SDA培养基平板上划线；将划线好的培养皿翻转放置于28℃恒温箱中培养；3—4日后挑选长出的典型而无杂菌的菌落，在菌落边缘用移菌针挑取带有菌丝的培养基一小块，转入试管斜面培养基中央，28℃恒温培养10-15天得到强毒力的金龟子绿僵菌CQMa421母种，将CQMa421菌株母种接种在1/4SDA平板上，28℃培养15天，收集成熟分生孢子制得绿僵菌CQMa421干孢子粉。

上述金龟子绿僵菌制剂的制备方法，是先将绿僵菌CQMa421干孢子粉和纳米氧化铝在混合机中混匀，再依次加入硅藻土、羧甲基纤维素钠、OP-10 2-4% 和HEL-40 2-4%，边加入边搅拌，直至各组分完全混合均匀制得。

一种增强金龟子绿僵菌毒力的方法，其特征在于：在28℃、湿度50-70%环境中，将金龟子绿僵菌CQMa421接种于桃蚜幼虫后饲养，选择最先感病死亡的桃蚜幼虫，放入28℃培养箱中保湿培养3-5天，使其昆虫表面生长出新鲜孢子；收集新鲜孢子，再接种萝卜蚜幼虫，同上获得昆虫表面生长出的新鲜孢子，如上所述循环接种15次得到驯化后的金龟子绿僵菌CQMa421新鲜孢子。在无菌条件下，用接种环挑取驯化后新鲜孢子在含有100微克/毫升氨苄青霉素的1/4SDA培养基平板上划线，将划线好的培养皿翻转放置于28℃恒温箱中培养；3—4日后挑选长出的典型而无杂菌的菌落，在菌落边缘用移菌针挑取带有菌丝的培养基一小块，转入试管斜面培养基中央，28℃恒温培养10-15天得到强毒力的金龟子绿僵菌CQMa421母种。

采用本发明增强毒力的方法驯化后的强毒力金龟子绿僵菌CQMa421菌株，对蚜虫致死率可提高约30%、达到100%，效果非常突出。

本发明具有如下的有益效果：

本发明金龟子绿僵菌CQMa421菌株在制备防治蚜虫的药剂中的应用，该菌株能侵染桃蚜和萝卜蚜，致死率可分别达到71.5%和70.8%，采用本发明增强毒力的方法制得的金龟子绿僵菌CQMa421菌株，其致死率达到100%，提高约30%，效果非常突出。本发明金龟子绿僵菌制剂中各成分的有效配合、起到了协同增效作用，采用本发明金龟子绿僵菌制剂兑水喷雾，对蚜虫的田间防效达到80%以上，该制剂具有良好的抗紫外特性和润湿分散特性、润湿时间＜60s，且保持了长期储存中的生物活性，贮存时间可达12个月，非常适于规模化生产和大面积推广使用。

具体实施方式

    下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1   CQMa421菌株经接种桃蚜和萝卜蚜驯化后的毒力、产孢特性与耐热特性

将CQMa421菌株接种在1/4SDA平板上，28℃培15天，收集成熟分生孢子，用0.05%（W/V）吐温-80分散，配制成终浓度为1×10⁷个孢子/ml的悬浮液。将室内饲养的桃蚜幼虫转入长放有白菜叶的500ml三角瓶中，每瓶30-50只蚜虫，采用喷雾塔（POTTER，BURKARD 公司）喷雾接种，接种5瓶，每瓶接种0.5 ml。接种后放入室温28℃，湿度50-70%的生测室中饲养；选择最先感病死亡的蚜虫僵虫，放入28℃培养箱中保湿培养3-5天，使其昆虫表面生长出新鲜孢子；收集新鲜孢子，再接种萝卜蚜幼虫，同上获得昆虫表面生长出的新鲜孢子。如上述循环接种14-16次进行驯化。在无菌条件下，用接种环挑取驯化后新鲜孢子在含有100微克/毫升氨苄青霉素的1/4SDA培养基平板上划线；将划线好的培养皿翻转放置于28℃恒温箱中培养；3—4日后挑选长出的典型而无杂菌的菌落，在菌落边缘用移菌针挑取带有菌丝的培养基一小块，转入试管斜面培养基中央，28℃恒温培养10-15天。驯化后的菌株按上述方法培养分生孢子，测定其对蚜虫毒力，以驯化前菌株为对照。重复3次，记录死虫数，计算累计死亡率，用SPSS软件进行统计分析。

产孢特性：取配置好CQMa421的孢子悬浮液100μl接种在1/4SDA平板上，在28℃温度的培养条件下培养15天，用直径为1cm 的打孔器随机打取5 个菌块，投入装有50ml 的0.05%（W/V）吐温-80的三角瓶中分散，利用血球计数板测定孢子浓度，计算单位面积上的产孢量（孢子数/ cm²）。以驯化前菌株为对照，设3次重复。用SPSS软件进行统计分析。

耐热特性：取配置好CQMa421的孢子悬浮液。分别在50℃下分别处理5小时，各取100μl 接种在1/4SDA平板上，在28℃温度下培养。设未热处理的分生孢子悬液为对照。每一处理设三个重复。24小时后，显微镜镜检，数200—300个孢子，记录萌发的孢子数，计算萌发率。以驯化前菌株为对照，重复3次。用SPSS软件进行统计分析。

表1 CQMa421菌株经接种蚜虫驯化后的毒力、产孢特性与耐热特性

注：p = 0.01水平上，相同字母表示差异不显著，不相同字母差异显著。

从可表1以看出，CQMa421能有效侵染桃蚜和萝卜蚜，接种后7天， CQMa421处理组桃蚜和萝卜蚜死亡率分别为71.4%和70.8%；CQMa421菌株驯化15次后对桃蚜和萝卜蚜的杀虫活性显著增强，对蚜虫的致死率达到100%，较驯化前提高约30%；而CQMa421菌株驯化后在1/4SDA平板上的产孢量和耐热性与驯化前无显著性差异，说明经蚜虫15次驯化对菌株CQMa421产孢特性与耐热性无影响。

实施例2  纳米氧化铝对绿僵菌保护作用

按表2将金龟子绿僵菌CQMa421纯孢粉与纳米氧化铝先混合后，再加入45%硅藻土、5%CMC和不同含量的OP-10、HEL-40混匀。

紫外保护作用：将制剂试样用水分散配成浓度为1×10⁷孢子/mL的孢悬液后，取100μl孢子悬液涂布到1/4 SDA平板上，用玻璃推匀后在置于290-310nm紫外灯（978mW/m2）下垂直照射5小时，再置于28℃恒温箱中培养24h小时，测定萌发率（方法同上），重复3次。用SPSS软件对数据进行处理分析。

贮存实验：将制剂试样后在28℃下密封保存2个月，用水分散配成浓度为1×10⁷孢子/mL的孢悬液后，测定萌发率（方法同上），重复3次。用SPSS软件对数据进行处理分析。

表2  纳米氧化铝对绿僵菌保护作用

注：p = 0.01水平上，相同字母表示差异不显著，不相同字母差异显著。

结果见表2，1-2%的纳米氧化铝对金龟子绿僵菌CQMa421孢子具有明显保护作用，在OP-10和HEL-40含量为2～4%时，贮存保存2个月后的孢子活性在90%以上，显著高于未加纳米氧化铝处理；也显著增加孢子抗紫外能力，为田间防效稳定性奠定基础。

实施例3 金龟子绿僵菌CQMa421可湿性粉剂配制及其润湿性、贮存期和防效。

按表3将金龟子绿僵菌CQMa421纯孢粉与纳米氧化铝先混合后，再加入不同含量硅藻土、CMC、OP-10和HEL-40。

湿润分散剂的湿润性测定：取标准水100mL注入250 mL烧杯。将此烧杯置于25℃±1℃的恒温水浴中，使其液面与水浴的水平面平齐。待硬水至25℃±1℃时，准确称取5.0g待测样品置于表面皿上，将全部试样从与烧杯口齐平的位置一次性均匀地倾倒在该烧杯的液面上，但不要过分地扰动液面。加试样时立即用秒表记时，直至试样全部润湿为止(留在液面上的细粉膜可忽略不计)。记下润湿时间(精确至秒)。如此重复5次，取其平均值，作为该样品的润湿时间。

贮存稳定性：将制剂在28℃下密封保存12个月。用水分散配成浓度为1×10⁷孢子/mL的孢悬液后按实施例2测定萌发百分率。

田间防效：选择桃蚜和萝卜蚜同时发生白菜田块，将制剂兑水分散成浓度为1×10⁷孢子/mL的孢悬液后基部喷雾，施药量50L/亩。施药后15天，采用平行跳跃式取样，每小区调查10点，统计虫口减退率和。重复3次，取其平均值，作为该样品的防效。

      表3  金龟子绿僵菌CQMa421可湿性粉剂湿润分散特性、贮存期及防效

结果见表3。试验配方的润湿性良好，润湿时间在 ＜60s 之间；贮存稳定，28℃下贮存12个月的孢子活性≥80%；田间对蚜虫防效稳定，防效达到80%以上，能作为化学农药的替代农药。

Claims (8)

1.金龟子绿僵菌CQMa421菌株在制备防治蚜虫的药剂中的应用。

2.金龟子绿僵菌CQMa421菌株在制备预防或防治桃蚜或萝卜蚜的药剂中的应用。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述防治蚜虫的药剂绿僵菌CQMa421干孢子粉35-52%、硅藻土40-50%、纳米氧化铝1-2%、羧甲基纤维素钠 3-5%、OP-10 2-4% 和 HEL-40 2-4%组成，均以重量百分比。

4.一种金龟子绿僵菌制剂，其特征在于：它是由硅藻土40-50%、纳米氧化铝1-2%、羧甲基纤维素钠 3-5%、OP-10 2-4%、HEL-40 2-4%和绿僵菌CQMa421干孢子粉35-52%组成，均以重量百分比。

5.如权利要求4所述的金龟子绿僵菌制剂，其特征在于：所述OP-10为平平加-30 （脂肪醇聚氧乙烯醚），HEL-40为氢化蓖麻油与环氧乙烷缩合物，；所述羧甲基纤维素钠为纯度大于95%；所述硅藻土为白色至浅褐色疏松粉末，纯度大于85%、含水量小于1%；所述纳米氧化铝的粒径小于50nm；所述绿僵菌CQMa421干孢子粉为纯孢子粉，含孢量≥150亿孢子/克、含水量≤5%；以上均以质量百分含量计。

6.如权利要求4或5所述金龟子绿僵菌制剂，其特征在于：它是由硅藻土40-45%、纳米氧化铝1.3-1.7%、羧甲基纤维素钠 3-5%、OP-10 2-4%、HEL-40 2-4% 和绿僵菌CQMa421干孢子粉40-50%组成，均以重量百分比。

7.如权利要求4、5或6所述金龟子绿僵菌制剂，其特征在于：所述绿僵菌CQMa421干孢子粉为强毒力金龟子绿僵菌CQMa421孢子粉，所述强毒力金龟子绿僵菌CQMa421孢子粉由以下方法得到：在28℃、湿度50-70%环境中，将金龟子绿僵菌CQMa421接种于桃蚜幼虫后饲养，将最先感病死亡的桃蚜幼虫放入28℃培养箱中保湿培养3-5天，使其昆虫表面生长出新鲜孢子；收集新鲜孢子，再接种萝卜蚜幼虫，同上获得昆虫表面生长出的新鲜孢子，如上所述循环接种15次得到驯化后的金龟子绿僵菌CQMa421新鲜孢子；在无菌条件下，用接种环挑取驯化后新鲜孢子在含有100微克/毫升氨苄青霉素的1/4SDA培养基平板上划线；将划线好的培养皿翻转放置于28℃恒温箱中培养；3—4日后挑选长出的典型而无杂菌的菌落，在菌落边缘用移菌针挑取带有菌丝的培养基一小块，转入试管斜面培养基中央，28℃恒温培养10-15天得到强毒力的金龟子绿僵菌CQMa421母种，将CQMa421菌株母种接种在1/4SDA平板上，28℃培养15天，收集成熟分生孢子制得绿僵菌CQMa421干孢子粉。

8.一种增强金龟子绿僵菌毒力的方法，其特征在于：在28℃、湿度50-70%环境中，将金龟子绿僵菌CQMa421接种于桃蚜幼虫后饲养，将最先感病死亡的桃蚜幼虫放入28℃培养箱中保湿培养3-5天，使其昆虫表面生长出新鲜孢子；收集新鲜孢子，再接种萝卜蚜幼虫，同上获得昆虫表面生长出的新鲜孢子，如上所述循环接种15次得到驯化后的金龟子绿僵菌CQMa421新鲜孢子，在无菌条件下，用接种环挑取驯化后新鲜孢子在含有100微克/毫升氨苄青霉素的1/4SDA培养基平板上划线，将划线好的培养皿翻转放置于28℃恒温箱中培养；3—4日后挑选长出的典型而无杂菌的菌落，在菌落边缘用移菌针挑取带有菌丝的培养基一小块，转入试管斜面培养基中央，28℃恒温培养10-15天得到强毒力的金龟子绿僵菌CQMa421母种。