CN101050429A - 一种致病力相对稳定的杀虫真菌选育方法 - Google Patents

一种致病力相对稳定的杀虫真菌选育方法 Download PDF

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CN101050429A CN 200710077691 CN200710077691A CN101050429A CN 101050429 A CN101050429 A CN 101050429A CN 200710077691 CN200710077691 CN 200710077691 CN 200710077691 A CN200710077691 A CN 200710077691A CN 101050429 A CN101050429 A CN 101050429A
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赵杰宏
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赵德刚
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Abstract

本发明公开了一种使致病力相对稳定的杀虫真菌选育方法，包括下述步骤：将分离获得的各虫生真菌的单孢子在氯酸盐土豆培养基(KPS)上诱发突变，打孔分离出抗氯酸盐角变，并在基础培养基(MM)、氯酸盐土豆培养基(KPS)上鉴定后获得硝酸盐利用缺陷型(nit)突变株；通过营养亲和性实验将亲和能力高的nit菌株作亲本，挑取各亲本菌株亲和配接区孢子，培养所形成的菌株作为异核体菌株；对异核体菌株的菌丝用Hoechest33258进行荧光染色后观察，确定其细胞存在异核现象(heterokaryosis)。本方法用于生产具有相对稳定高致病力菌剂防治农业、林业和牧业的虫害。

Description

一种致病力相对稳定的杀虫真菌选育方法
技术领域
本发明涉及到生物防治领域中的一种虫生真菌选育方法。
背景技术
运用昆虫的真菌天敌研制成真菌制剂以防治虫害，是害虫生物防治的重要内容。但是始终面临着两个难以解决的问题，其中之一就是真菌菌株对害虫致病力不稳定问题。一般一个生产菌株连续3代后致病力会下降，这是由于在准性重组过程中不同基因型的核易于分离，从而出现所谓“菌种退化”，给生产应用带来很多麻烦。
从理论上讲，理化诱变、异核体合成及准性重组是大多数半知菌亚门昆虫病原真菌培育高毒力菌株的三个基本途径。只是目前的一些工作表明，理化因素诱变的昆虫病原真菌的形态或营养缺陷型突变体，其毒力常常降低甚至完全丧失。在昆虫病原真菌中，不少的间接材料已说明了异核体具有比合成它的亲本菌株较高的毒力水平。在生防实践中采用人工合成异核体“制种”，是一值得探索的途径。目前仅在金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliea)等为数不多的种中通过原生质体融合实现了准性重组真正育成比亲本毒力更高的新菌种。然而，比原生质体融合手段更简便，而又不需要对亲本菌株做理化诱变的方法未见报道。
发明内容
本发明的目的是克服上述缺点，而提供一种用于生产防治农业、林业和牧业的虫害的菌剂的致病力相对稳定的杀虫真菌选育方法。。
本发明的致病力相对稳定的杀虫真菌选育方法，包括下述步骤：
(1)将分离获得的虫生真菌的单孢子在氯酸盐土豆培养基(KPS)上诱发突变，打孔分离出抗氯酸盐角变，并在基本培养基(MM)、氯酸盐土豆培养基(KPS)上鉴定后获得硝酸盐利用缺陷型(nit)突变株；
(2)通过营养亲和性实验将亲和能力高的nit菌株作亲本，挑取各亲本菌株亲和配接区的孢子，培养所形成的菌株作为异核体菌株；
(3)对异核体菌株的菌丝用Hoechest 33258进行荧光染色后观察认定其细胞存在异核现象(heterokaryosis)。
上述的致病力相对稳定的选育方法，包括下述步骤：
(1)将分离获得的虫生真菌的单孢子在氯酸盐土豆培养基上诱发突变；从氯酸盐土豆培养基上打孔分离出抗氯酸盐角变，并在基础培养基、氯酸盐土豆培养基上鉴定；凡是氯酸盐土豆培养基上生长良好，而同时在基础培养基上菌落生长只有微弱菌丝的角变就是真正的硝酸盐利用缺陷型突变株；
(2)将选出的硝酸盐利用缺陷型突变株在基础培养基上配对培养，间隔3-5cm，25℃，暗培养21天左右，观察菌株间的亲和能力。如果亲和，菌落间则形成旺盛生长的配接丛，如果不亲和，菌落间没有特殊生长的配接丛；
(3)通过营养亲和性实验将亲和能力高的硝酸盐利用缺陷型突变株作亲本，挑取各亲本菌株亲和配接区孢子作为异核体菌株，保存在基础培养基上；
(4)间隔3月重复亲和性实验，检测筛选出的亲本菌株间亲和能力的稳定性，如此重复3次，从而分离出亲和能力最稳定的亲本菌株和亲和后形成的异核体菌株；
(5)对异核体菌株的菌丝用Hoechest 33258进行荧光染色后观察认定其细胞存在异核现象；
(6)通过在实验室进行致病试验，然后挑选出对蚜虫具有较高致病力的异核体菌株，同时明确该异核体菌株的亲本菌株；
(7)最后挑选出具有较高致病力的异核体菌株，明确亲和形成该异核体菌株的亲本菌株。
其中培养基配方如下：
氯酸盐土豆培养基(KPS)：土豆200g；琼脂20g；蔗糖20g；KClO3 20g；蒸馏水补1000ml。
BM培养基：蔗糖30g；KH2PO4 1g；MgSO4.7H2O 0.5g；FeSO4 0.01g；KCl 0.5g；琼脂20g；微量元素液0.2ml；蒸馏水补足1000ml。
微量元素液组分：ZnSO4.7H2O 5g；CuSO4.5H2O 250mg；MnSO4.H2O 50mg；NaMO4.2H2O 50mg；水1000ml。
基础培养基(MM)：1000mLBM中加入NaNO33g。
上述方法可应用的杀虫真菌。指可以自然侵染某种节肢动物或线虫，使某种节肢动物或线虫致病或死亡的真菌。如：白僵菌属(Beauveria)、绿僵茵属(Metarhizium)、被毛孢属(Hirsutella)、拟青霉属(Paecilomyces)、轮枝霉属(Verticillium)等具有准性生殖过程的虫生真菌。因为在准性生殖过程中异核体的形成是一种必然，但是一般异核体又是很容易分解的。所以人为地选择稳定而优良的亲本配接形成异核体是很好方法。
本发明的方法与现有技术相比，由以上技术可知，使用可以稳定地实现亲和的两个亲本菌株，亲和后形成异核体，该异核体具有两亲优良特性，用以发酵生产菌剂防治虫害。当异核体菌剂的致病力下降时，可以通过长期保存的亲本菌株重新亲和配接形成。这样达到育成具有相对稳定高致病力杀虫真菌之目的。使用该方法获得的菌株可以用于生产菌剂防治农业、林业和牧业的虫害。
具体实施方式
实施例1：
(1)从采自全国的8个蝉拟青霉[Paecilomyces cicadae(Miq.)Samson]菌株上分离获得32个单孢子菌株，将分离获得的各虫生真菌的单孢子在氯酸盐土豆培养基(KPS)上诱发突变；
(2)从氯酸盐土豆培养基(KPS)上打孔分离出抗氯酸盐角变，并在基础培养基(MM)、氯酸盐土豆培养基(KPS)上鉴定；
(3)凡是氯酸盐土豆培养基(KPS)上生长良好，而同时在基础培养基(MM)上菌落生长只有微弱菌丝的角变就是真正的硝酸盐利用缺陷型(nit)突变株；
(4)将选出的各个nit菌株在基础培养基(MM)上配对培养，间隔3-5cm，25℃，暗培养21天左右，观察菌株间的亲和能力。如果亲和，菌落间则形成旺盛生长的配接丛，如果不亲和，菌落间没有特殊生长的配接丛(见表1)；
(5)通过营养亲和性实验将亲和能力高的nit菌株作亲本，挑取各亲本菌株亲和配接区孢子作为异核体菌株，保存在基础培养基(MM)上；
(6)间隔3月重复亲和性实验，检测筛选出的亲本菌株间亲和能力的稳定性，如此重复3次，从而分离出亲和能力最稳定的亲本菌株和亲和后形成的异核体菌株；
(7)对异核体菌株的菌丝用Hoechest 33258进行荧光染色后观察认定其细胞存在异核现象(heterokaryosis)；
                 表1蝉拟青霉nit突变株间的营养亲和反应
 nit菌株   54     55     56     57     58     59     60
 55565758596054   ++++++-     --+-+++     --+--++     ++-++++     --+--++     +-+--++     +++++++
注：“+”表示营养亲和；“-”表示营养不亲和；
通过以上步骤分离出的具有稳定的高亲和能力的蝉拟青霉异核体菌株有55-57、56-57、58-57，和其亲本菌株55、56、57、58。菌株的培养特性和产孢结构是：在查氏培养基上25℃14天菌落直径16mm，菌丝纯白色致密毡状、粉质，具有放射状沟纹；背面纯白色有凹陷。分生孢子梗浓密地分枝，3.5μm宽，由2-5个瓶状小梗组成的轮生体。瓶状小梗基部膨大或纺锤形无明显膨大，9.6-33×3-3.6μm其上端为突然变细大约0.6μm的管状偏离主轴，分生孢子为长圆至柱形常弯曲，壁光滑，透明6-10×2.4-3.6μm.。在PDA培养基上25℃14天菌落直径64mm白色粉质，背面豆汁黄。
其中培养基配方如下：
氯酸盐土豆培养基(KPS)：土豆200g；琼脂20g；蔗糖20g；KClO3 20g；蒸馏水补足1000ml。
BM培养基：蔗糖30g；KH2PO4 1g；MgSO4.7H2O 0.5g；FeSO4 0.01g；KCl 0.5g；琼脂20g；微量元素液0.2ml；蒸馏水补足1000ml。
微量元素液组分：ZnSO4.7H2O 5g；CuSO4.5H2O 250mg；MnSO4.H2O 50mg；NaMO4.2H2O 50mg；水1000ml。
基础培养基(MM)：1000mLBM中加入NaNO3 3g。
固体发酵培养基为：麸皮70％，大米粉20％，黄豆粉10％，几丁质0.5％，水100％，121℃灭菌备用。每500ml三角瓶装80g。
(8)首先通过在实验室进行致病试验，然后挑选出对蚜虫具有较高致病力的异核体菌株，同时明确该异核体菌株的亲本菌株。步骤如下：
制备孢子悬浮液：在培养好的平板菌落上倒入适量的0.05％土温-80溶液，用接种环轻轻刮下孢子，充分震荡后用灭菌的擦镜纸过滤入无菌三角瓶中，稀释到3×108备用。
测定分生孢子的萌发率：取各菌株分生孢子的营养稀释液一滴，滴在载玻片上，三个重复。采用悬滴法适温培养，24h和48h后显微镜下测定萌发率。
致病力测试：摘取生有两龄蚜虫的番茄叶(或萝卜叶)，叶柄插入浸湿的花泥小块，然后将叶片(叶柄不浸入)浸入含有试剂悬液的烧杯中3s立即取出，室温下将蚜虫和叶片晾干。置于大培养皿内。每皿一片叶每片叶上30头虫，25℃恒温培养。每d给花泥加一次无菌水，每日光照10h，每日检查死亡虫数，及时把死虫取出，放置到一干净培养皿中继续培养，连续记数直到全部虫死。最后镜检死虫的感染情况，以确证被该拟青霉菌侵染。所测的数据绘制曲线，然后统计获得LT50、LT90值(见表2)。
                      表2蝉拟青霉各菌株对蚜虫的致死时间(LT)
  菌株   55     56     57   58   55-57   56-57     58-57
  萌发率(％)1d2d3d4d5d6d7dLT50(d)LT90(d)   47％41％58％74％84％93％100％35.7     210％16％64％8％99％100％100％35.4     13％34％71％82％99％100％100％2.85.2   18％23％57％72％98％99％100％3.15.5   112％3％62％82％97％100％100％2.85.3   111％24％69％78％88％97％100％2.95.5     210％40％66％79％99％100％100％2.65.3
注：LT50、LT90分别表示致死中量所需时间和致死90％所需时间。
从表中数据显示55-57、56-57、58-57菌株的LT50、LT90较低于亲本株，由此可以看出，异核体致病能力相对较高。特别是55-57、56-57菌株的萌发率特别低的情况下有相对较低的致死时间，说明该实验中55-57、56-57菌株的致病力最高。
(9)最后挑选出具有较高致病力的异核体菌株是55-57、56-57，明确亲和形成该异核体菌株的亲本菌株是55、56、57。蝉拟青霉亲本菌株在4℃冰箱条件下保存。用蝉拟青霉异核体菌株P.cicadae(GZDXIFR-H).55-57，56-57，58-57进行在固体发酵培养基上发酵生产杀虫菌剂，可以用来防治温室蚜虫。
实施例2
(1)倾入含0.05％ Toween-80的无菌水，于已形成分生孢子的粉质拟青霉[Paecilomyces farinosus(Holm.ex Gray)Brown & Smith]平板菌落上，用玻璃刮轻压菌落表面洗下孢子。将孢子悬液移入加有数粒玻璃珠的小三角瓶中，充分振荡使其分散，然后用无菌玻璃棉过滤除去菌丝。稀释孢子悬液至每ml含孢子300个左右，吸此液0.1ml于直径9cm的基础培养基(MM)平板上，用玻璃刮均匀涂布，25℃培养，显微镜下观察确定和标记出同心放射生长的单孢子菌落，肉眼可见后，分离培养作为单孢子菌株；
(2)从采集的粉质拟青霉[Paecilomyces farinosus(Holm.ex Gray)Brown & Smith]菌株上分离获得26个单孢子菌株，将分离获得的各单孢子在氯酸盐土豆培养基(KPS)上诱发突变；
(3)从氯酸盐土豆培养基(KPS)上打孔分离出抗氯酸盐角变，并在基础培养基(MM)、氯酸盐土豆培养基(KPS)上鉴定；
(4)凡是氯酸盐土豆培养基(KPS)上生长良好，而同时在基础培养基(MM)上菌落生长只有微弱菌丝的角变就是真正的硝酸盐利用缺陷型(nit)突变株，共筛选出30个nit突变株；
(5)将选出的30个nit菌株在基础培养基(MM)上配对培养，间隔3-5cm，25℃，暗培养21天左右，观察菌株间的亲和能力。如果亲和，菌落间则形成旺盛生长的配接丛，如果不亲和，菌落间没有特殊生长的配接丛。结果来自4个单孢子(A、B、C、D)的5个nit菌株可以相互亲和(见表3)，其余来自22个单孢子(E-Z)的25个nit菌株间皆不亲和；
(6)通过营养亲和性实验将亲和能力高的nit菌株作亲本，挑取各亲本菌株亲和配接区孢子作为异核体菌株，保存在基础培养基(MM)上；
(7)间隔3月重复亲和性实验，检测筛选出的亲本菌株间亲和能力的稳定性，如此重复3次，从而分离出亲和能力最稳定的亲本菌株和亲和后形成的异核体菌株；
(8)对异核体菌株的菌丝用Hoechest 33258进行荧光染色后观察认定其细胞存在异核现象(heterokaryosis)；
       表3粉质拟青霉nit突变株间的营养亲和反应
nit菌株 A B C     D
    D1    D2
 AB    ++    ++    ++     ++    ++
   CD1D2    +++    +++    +++    +++    +++
注：“+”表示营养亲和；“-”表示营养不亲和；
通过以上步骤分离出的具有稳定的高亲和能力的粉质拟青霉异核体菌株有B-A，C-A，D1-A，和其亲本菌株A，B，C，D1。其培养特性和产孢结构是：在查氏培养基上25℃14天菌落直径42mm白色、毡状、粉质，近同心圆形具有钩状纹路。背面蛋壳黄具有脊状轮纹，边缘整齐。个体形态：瓶状小梗(产孢细胞)基部柱状或瓶状膨大，向上具有细长管状7.2-9.6×1.2-1.7μm；分生孢子卵形或纺锤形1.8-2.2×1.2-1.8μm。
其中培养基配方如下：
氯酸盐土豆培养基(KPS)：土豆200g；琼脂20g；蔗糖20g；KClO3 20g；蒸馏水补足1000ml。
BM培养基：蔗糖30g；KH2PO4 1g；MgSO4.7H2O 0.5g；FeSO4 0.01g；KCl 0.5g；琼脂20g；微量元素液0.2ml；蒸馏水补足1000ml。
微量元素液组分：ZnSO4.7H2O 5g；CuSO4.5H2O 250mg；MnSO4.H2O 50mg；NaMO4.2H2O 50mg；水1000ml。
基础培养基(MM)：1000mLBM中加入NaNO3 3g。
固体发酵培养基为：麸皮70％，大米粉20％，黄豆粉10％，几丁质0.5％，水100％，121℃灭菌备用。每500ml三角瓶装80克。
(9)首先通过在实验室进行致病试验，然后挑选出对蚜虫具有较高致病力的异核体菌株，同时明确该异核体菌株的亲本菌株。步骤如下：
制备孢子悬浮液：往培养好的平板菌落上倒入适量的0.05％土温-80溶液，用接种环轻轻刮下孢子，充分震荡后用搽镜纸滤入无菌三角瓶中，稀释到3×108备用。
测定分生孢子的萌发率：取各菌株分生孢子的营养稀释液一滴，滴在载玻片上，三个重复。采用悬滴法适温培养，24h和48h后显微镜下测定萌发率。
致病力测试：摘取生有两龄蚜虫的番茄叶(或萝卜叶)，叶柄插入浸湿的花泥小块，然后将叶片(叶柄不浸入)浸入含有试剂悬液的烧杯中3s立即取出，室温下将蚜虫和叶片晾干。置于大培养皿内。每皿一片叶每片叶上30头虫，25℃恒温培养。每d给花泥加一次无菌水，每日光照10h，每日检查死亡虫数，及时把死虫取出，放置到一干净培养皿中继续培养，连续记数直到全部虫死。最后镜检死虫的感染情况，以确证被该拟青霉菌侵染。所测的数据绘制曲线，然后统计获得LT50、LT90值(见表4)。
      表4粉质拟青霉(Paecilomyces farinosus)各菌株对蚜虫的致死时间(LT)
  菌株   A   B   C   D     B-A     C-A    D1-A
  萌发率(％)   96   95   96   92     99     96    94
 LT50(d)LT90(d)  3.16.8  3.57.2  4.37.0   4.26.9   3.36.4   4.26.7   3.06.1
注：LT50、LT90分别表示致死中量所需时间和致死90％所需时间。
(10)最后挑选出具有较高致病力的异核体菌株是D1-A，明确亲和形成该异核体菌株的亲本菌株是D1和A。粉质拟青霉亲本菌株在4℃冰箱条件下保存。用粉质拟青霉异核体D1-A菌株进行在固体发酵培养基上发酵生产杀虫菌剂，可以用来防治温室蚜虫。
实施例3
(1)倾注含0.05％ Toween-80的无菌水，于已形成分生孢子的玫烟色拟青霉[Paecilomyces fumosoroseus(Wize)Brown & Smith]菌落上，用玻璃刮轻压菌落表面洗下孢子。将孢子悬液移干加有数粒玻璃珠的小三角瓶中，充分振荡使其分散，尔后用无菌玻璃棉过滤除去菌丝。稀释孢子悬液至每ml含孢子300个左右，吸此液0.1ml于直径9cm的基础培养基(MM)平板上，用玻璃刮均匀涂布，25℃培养，显微镜下观察确定和标记出同心放射生长的单孢子菌落，肉眼可见后，分离培养作为单孢子菌株；
(2)从采集的玫烟色拟青霉[Paecilomyces fumosoroseus(Wize)Brown& Smith]菌株上分离获得20个单孢子菌株，将分离获得的各单孢子在氯酸盐土豆培养基(KPS)上诱发突变；
(3)从氯酸盐土豆培养基(KPS)上打孔分离出抗氯酸盐角变，并在基础培养基(MM)、氯酸盐土豆培养基(KPS)上鉴定；
(4)凡是氯酸盐土豆培养基(KPS)上生长良好，而同时在基础培养基(MM)上菌落生长只有微弱菌丝的角变就是真正的硝酸盐利用缺陷型(nit)突变株。每个单孢子菌株选取个nit突变株，共选出40个nit突变株；
(5)将选出的40个nit菌株在基础培养基(MM)上配对培养，间隔3-5cm，25℃，暗培养21天左右，观察菌株间的亲和能力。如果亲和，菌落间则形成旺盛生长的配接丛，如果不亲和，菌落间没有特殊生长的配接丛。结果来自7个单孢子的11个nit菌株具有亲和现象(见表5)，其余菌株皆不亲和；
(6)通过营养亲和性实验将亲和能力高的nit菌株作亲本，挑取各亲本菌株亲和配接区孢子作为异核体菌株，保存在基础培养基(MM)上；
(7)间隔3月重复亲和性实验，检测筛选出的亲本菌株间亲和能力的稳定性，如此重复3次，从而分离出亲和能力最稳定的亲本菌株和亲和后形成的异核体菌株；
(8)对异核体菌株的菌丝用Hoechest 33258进行荧光染色后观察认定其细胞存在异核现象(heterokaryosis)；
        表5玫烟色拟青霉nit突变株间的营养亲和反应
 nit菌   1    2    3    4    5    6    7
    株     I    II    III    IV    V    VI    VII     VIII     IX     X     XI
    IIIIIIIVVVIVIIVIIIIXXXI     +++-++++---    +-++++---++    ++--+++++++    -+--+++++--    +++++++++++    ++++++++++-    +-++++--+++     +-++++--+++     --++++++--+     -++-++++--+     -++-+-+++++
注：“+”表示营养亲和；“-”表示营养不亲和；
通过以上步骤分离出的具有稳定的高亲和能力的玫烟色拟青霉异核体菌株有V-III，V-VI，V-X和其亲本菌株：III，V，VI，X。分离出的玫烟色拟青霉异核体菌株，其培养特性和产孢结构是：在查氏培养基上25度14天菌落直径62mm，菌丝纯白色茸毛状、致密、隆起具有孢梗束，背面白色。较老的菌落形成分枝的粉红色孢梗束。个体形态：瓶状小梗(产孢细胞)基部球形或拟椭圆形膨大，上部为细长管状5.6-7.8×1.4-2μm；分生孢子短园柱形至梭形3-4×1.5-1.8μm。
其中培养基配方如下：
氯酸盐土豆培养基(KPS)：土豆200g；琼脂20g；蔗糖20g；KClO3 20g；蒸馏水补足1000ml。
BM培养基：蔗糖30g；KH2PO4 1g；MgSO4.7H2O 0.5g；FeSO4 0.01g；KCl 0.5g；琼脂20g；微量元素液0.2ml；蒸馏水补足1000ml。
微量元素液组分：ZnSO4.7H2O 5g；CuSO4.5H2O 250mg；MnSO4.H2O 50mg；NaMO4.2H2O 50mg；水1000ml。
基础培养基(MM)：1000mLBM中加入NaNO3 3g。
固体发酵培养基为：麸皮70％，大米粉20％，黄豆粉10％，几丁质0.5％，水100％，121℃灭菌备用。每500ml三角瓶装80克。
(9)首先通过在实验室进行致病试验，然后挑选出对蚜虫具有较高致病力的异核体菌株，同时明确该异核体菌株的亲本菌株。步骤如下：
制备孢子悬浮液：往培养好的平板菌落上倒入适量的0.05％土温-80溶液，用接种环轻轻刮下孢子，充分震荡后用擦镜纸滤入无菌三角瓶中，稀释到3×108备用。
测定分生孢子的萌发率：取各菌株分生孢子的营养稀释液一滴，滴在载玻片上，三个重复。采用悬滴法适温培养，24h和48h后显微镜下测定萌发率。
致病力测试：摘取生有两龄蚜虫的番茄叶(或萝卜叶)，叶柄插入浸湿的花泥小块，然后将叶片(叶柄不浸入)浸入含有试剂悬液的烧杯中3s立即取出，室温下将蚜虫和叶片晾干。置于大培养皿内。每皿一片叶每片叶上30头虫，25℃恒温培养。每d给花泥加一次无菌水，每日光照10h，每日检查死亡虫数，及时把死虫取出，放置到一干净培养皿中继续培养，连续记数直到全部虫死。最后镜检死虫的感染情况，以确证被该拟青霉菌侵染。所测的数据绘制曲线，然后统计获得LT50、LT90值(见表6)。
              表6玫烟色拟青霉(Paecilomyces fumosoroseus)各菌株对蚜虫的致死时间(LT)
  菌株     III     V     VI     X     V-III     V-VI     V-X
  萌发率(％)LT50(d)LT90(d) 894.37.3 924.37.3 914.47.6 904.66.9 933.46.4 943.66.7 953.76.9
注：LT50、LT90分别表示致死中量所需时间和致死90％所需时间。
(10)最后挑选出具有较高致病力的异核体菌株是V-III，明确亲和形成该异核体菌株的亲本菌株是V和III。玫烟色拟青霉各菌株在4℃冰箱条件下保存。用其异核体菌株V-III进行在固体发酵培养基发酵生产杀虫菌剂，可以用来防治温室蚜虫。

Claims (10)

1、一种致病力相对稳定的杀虫真菌选育方法，包括下述步骤：
(1)将分离获得的虫生真菌的单孢子在氯酸盐土豆培养基上诱发突变，打孔分离出抗氯酸盐角变，并在基础培养基、氯酸盐土豆培养基上鉴定后获得硝酸盐利用缺陷型突变株；
(2)通过营养亲和性实验将亲和能力高的硝酸盐利用缺陷型菌株作亲本，挑取各亲本菌株亲和配接区的孢子，培养所形成的菌株作为异核体菌株；
(3)对异核体菌株的菌丝用Hoechest 33258进行荧光染色后观察认定其细胞存在异核现象。
2、如权利要求1所述的致病力相对稳定的选育方法，包括下述步骤：
(1)将分离获得的虫生真菌的单孢子在氯酸盐土豆培养基上诱发突变；从氯酸盐土豆培养基上打孔分离出抗氯酸盐角变，并在基础培养基、氯酸盐土豆培养基上鉴定；凡是氯酸盐土豆培养基上生长良好，而同时在基础培养基上菌落生长只有微弱菌丝的角变就是真正的硝酸盐利用缺陷型突变株；
(2)将选出的硝酸盐利用缺陷型突变株在基础培养基上配对培养，间隔3-5cm，25℃，暗培养20-25天，观察菌株间的亲和能力；如果亲和，菌落间则形成旺盛生长的配接丛，如果不亲和，菌落间没有特殊生长的配接丛；
(3)通过营养亲和性实验将亲和能力高的硝酸盐利用缺陷型突变株作亲本，挑取各亲本菌株亲和配接区孢子作为异核体菌株，保存在基础培养基上；
(4)间隔3月重复亲和性实验，检测筛选出的亲本菌株间亲和能力的稳定性，如此重复3次，从而分离出亲和能力最稳定的亲本菌株和亲和后形成的异核体菌株；
(5)对异核体菌株的菌丝用Hoechest 33258进行荧光染色后观察认定其细胞存在异核现象；
(6)通过在实验室进行致病试验，然后挑选出对蚜虫具有较高致病力的异核体菌株，同时明确该异核体菌株的亲本菌株；
(7)最后挑选出具有较高致病力的异核体菌株，明确亲和形成该异核体菌株的亲本菌株。
3、如权利要求1或2所述的致病力相对稳定的选育方法，其中氯酸盐土豆培养基：土豆200g；琼脂20g；蔗糖20g；KClO320g；蒸馏水补足1000ml。
4、如权利要求1或2所述的致病力相对稳定的选育方法，其中BM培养基：蔗糖30g；KH2PO4 1g；MgSO4.7H2O 0.5g；FeSO4 0.01g；KCl 0.5g；琼脂20g；微量元素液0.2ml；蒸馏水补足1000ml。
微量元素液组分：ZnSO4.7H2O 5g；CuSO4.5H2O 250mg；MnSO4.H2O 50mg；NaMO4.2H2O 50mg；水1000ml。
5、如权利要求1或2所述的致病力相对稳定的选育方法，其中基础培养基：1000mLBM中加入NaNO33g。
6、如权利要求3所述的致病力相对稳定的杀虫真菌选育方法，其中杀虫真菌指可以自然侵染节肢动物或线虫，使节肢动物或线虫致病或死亡的真菌。
7、如权利要求4所述的致病力相对稳定的杀虫真菌选育方法，其中杀虫真菌指可以自然侵染节肢动物或线虫，使节肢动物或线虫致病或死亡的真菌。
8、如权利要求5所述的致病力相对稳定的杀虫真菌选育方法，其中杀虫真菌指可以自然侵染节肢动物或线虫，使节肢动物或线虫致病或死亡的真菌。
9、如权利要求6-8之一所述的致病力相对稳定的杀虫真菌选育方法，其中杀虫真菌是具有准性生殖过程的虫生真菌。
10、如权利要求9所述的致病力相对稳定的杀虫真菌选育方法，其中杀虫真菌包括白僵菌属、绿僵菌属、被毛孢属、拟青霉属或轮枝霉属。
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