CN109971658A - 一种曲霉属真菌菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种曲霉属真菌菌株及其应用，所述的曲霉属真菌菌株分类命名为Aspergillus nomius，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏日：2018年12月28日，保藏编号：CGMCC No.17066，所述曲霉属真菌属于菌物界，真菌门，丝孢纲，丝孢目，淡色孢科，曲霉属。应用为所述的曲霉属真菌菌株在制备生物防治红火蚁生物制剂中的应用。

Description

一种曲霉属真菌菌株及其应用

技术领域

本发明属于微生物分离培养技术领域，具体涉及一种曲霉属真菌菌株及其应用。

背景技术

2004年9月23日，吴川市植物检疫站报告了当地红火蚁严重发生危害的情况。2005年1月17日，我国将红火蚁增列为进境植物检验性有害生物和全国植物检疫性有害生物和全国林业检疫性有害生物、全国林业危险性有害生物。

红火蚁快速入侵得益于繁殖力强和攻击能力强，种群增长快速，导致蚁巢高密度发生。红火蚁源自南美洲，成虫食性杂，红火蚁取食昆虫和节肢动物，有时也取食小型哺乳动物，蜥蜴，鸟类和鸟类的卵，也会取食多种作物的种子、幼芽、果实等影响农作物的生长。红火蚁常常损坏公共设施电子仪器设备，造成设施故障。红火蚁有毒囊和螫针，并且会连续叮蜇，体质敏感的人会因为毒蛋白产生过敏性反应，严重者能够造成死亡。未来被红火蚁入侵的地区还将快速增加，必带来化学药剂使用量的增加，但传统的化学防治将会导致严重的3R问题。

生物防治是红火蚁防治的较理想、环保的方法。虫生真菌作为害虫的一类重要致病菌，在害虫的生物防治中占有重要的地位。昆虫病原真菌经开发可调制成微生物制剂，使用方便，对人畜生物安全性高，无环境污染及残留量的顾虑。

国内华南农业大学刘晓燕等从红红火蚁上分离出红火蚁自然存在致病菌淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus）菌株，结果显示最高致病力的菌株淡紫拟青霉PL04，对红火蚁工15d的致死率最高为70.60 %。因此，有必要找到红火蚁病原真菌，筛选出对红火蚁致死毒力强的菌株，进而能够对红火蚁这种有害生物进行综合防控。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种曲霉属真菌菌株；第二目的在于提供所述的曲霉属真菌菌株的应用。

除非另有说明外，本发明中所采用的百分数均为体积百分数。

本发明的第一目的是这样实现的，曲霉属真菌菌株（Aspergillus nomius），命名为ANHHYSFJ01,经鉴定为集峰曲霉（Aspergillus nomius），是从自然病死红火蚁身上分离得到，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏日：2018年12月28日，保藏编号：CGMCC No.17066，所述曲霉属真菌属于菌物界，真菌门，丝孢纲，丝孢目，淡色孢科，曲霉属。

本发明所述的曲霉属真菌菌株（Aspergillus nomius），命名为ANHHYSFJ01,是从自然得病红火蚁上分离得到，已于2018年12月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心(China General Microbiological Culture CollectionCenter,简称 CGMCC。地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100080)。其保藏编号为CGMCC No：17066。

所述菌株对红火蚁的致病效果好，在短时间内即可穿透红火蚁体节处，并寄生红火蚁并繁殖。

所述菌株在接触到红火蚁之后能快速繁殖。

所述菌株在红火蚁体表产孢，产孢之后在红火蚁体表收集分生孢子，回接到红火蚁。通过柯赫氏法则验证，回接菌株分生孢子侵染其他健康实验用红火蚁具备同样毒力致死效果。

所述菌株是通过下述具体步骤获得的：

A、红火蚁采集：采集红火蚁活虫体及自然病死虫体，寻找到红火蚁蚁巢，采集和室内饲养。

B、菌株分离与筛选：高压高温灭菌所有需要的实验材料，并在无菌操作台中操作所有步骤。

将配比浓度为75%的乙醇溶液清洗自然病死红火蚁5秒，然后将配比为0.1%的升汞溶液对虫体表面消毒2-3分钟，无菌水缓慢冲淋3次，用灭菌的镊子将红火蚁虫体按头、胸、腹不同部位分开，并且将分开后的红火蚁不同的身体部位小心放置到培养基中。

培养基为普通PDA培养基。

一起移送至25℃±恒温培养箱中培养5d。重复纯化两次。

C、菌种保存：及时在实验室进行红火蚁致病菌株保存，挑取繁殖培养基中生长旺盛菌株接种至保存培养基中，在25℃±黑暗中静置培养7d，于4℃冰箱中冻存；保存培养基为PDA培养基；

最后需要保藏，在无菌操作箱中将菌株接种进普通PDA试管斜面，25℃±培养7d后放进4℃冰箱中保存。

PDA固态培养基成分以g/L计为：马铃薯160～240g、葡萄糖10～20g、琼脂15～20g、PH自然。

PDA固态培养基成分以g/L计优选为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、PH自然。

步骤A所述的标本采集自昆明市盘龙区、呈贡区、东川区、德宏傣族景颇族自治州芒市。

步骤A所述的标本采集是在道路边，草地内，花木丛土壤中，桉树林内。

步骤A所述的标本采集是在干燥，光照充足的环境下。

步骤A所述的室内饲养为带有红火蚁蚁后的完整巢穴饲养。

步骤B所述无菌操作台中步骤为，酒精灯下操作，并在酒精灯火焰上灼烧接种针，接种环，在酒精灯周围操作所有分离步骤。

步骤B所述的灭菌，是将接种针、接种环、无菌水、镊子、空培养基等试验所需材料置于高压蒸汽式灭菌器中，在121℃下灭菌处理30分钟以上。

步骤B所述无菌操作台中步骤为，接种至培养基，美国进口封口膜密封所有繁殖培养基。

步骤B所述的使用后升汞溶液回收至不透光回收瓶子中，集中处理。

步骤B所述的繁殖培养条件的优选；25℃±黑暗中静置培养9d。

步骤C所述的保存培养的条件优选；26℃黑暗静置培养9d。

一株曲霉属真菌及其在生物防治红火蚁的方法，包括菌株的活化与扩繁、孢子悬浮液制作、致红火蚁死亡毒力检测、具体包括以下步骤：

A、菌株活化与扩繁：将曲霉属真菌菌株（Aspergillus nomius）ANHHYSFJ01接种到活化与扩繁培养基上，在25℃±下培养15d至生长旺盛的产孢菌落形成，得活化与扩繁产孢菌株。

B、孢子悬浮液的配制：将菌株接种于PDA培养基上，在25℃±培养箱中恒温培养15d。

用添加0.05%Tween-80的无菌水溶液冲洗培养皿中的孢子。

将培养皿中的菌液和孢子都倒入杯中并且不停震荡30min,用擦镜纸过滤,最终得到未计数的孢子悬浮液。

拿出血球计数板，放置在显微镜下，记录内部400小格中的所有孢子数。

最终计算出所制作的孢子悬浮液的总孢子数量，稀释配置成1.0×10⁷个·mL⁻¹孢子悬浮液。

所述的制备方法，还可以包括制作成其他浓度的孢子悬浮液。

步骤B所述的血球计数板品牌为上海求精，16格×25格的血球计数板。

步骤B所述Tween-80做真菌分生孢子分散剂，Tween-80 聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯。

本发明的第二目的是这样实现的，所述的曲霉属真菌菌株在制备生物防治红火蚁生物制剂中的应用。

生防效果测定：在塑料杯的杯口均匀涂抹防虫逃逸粉，用小型喷壶向塑料杯中的红火蚁均匀喷洒1.0×10⁷个·mL⁻¹孢子悬浮液。

移送至培养箱中恒温培养10d,每24小时开箱拿出塑料杯，记录死亡的工蚁数量。

并将死亡的工蚁挑出保湿培养，查看是否有真菌长出，对比出导致红火蚁工蚁死亡的原因。仔细计算工蚁累计死亡率。试验重复三次。

本发明的生防效果包括以下几个方面。

1、本发明所述菌株对红火蚁的致病效果好，在短时间内即可穿透红火蚁体节处，并寄生于红火蚁体内并繁殖。

2、本发明所述菌株生长迅速，产孢量大，有利于大规模生产和推广应用。

3、本发明所述红火蚁生防菌来源于自然环境条件下红火蚁自然感病死亡分离获得，因此，加以利用，能够做为红火蚁生物防治的方法，并且操作流程简单，防治效果好。

附图说明

图1为实施例1中曲霉属真菌菌株集峰曲霉（Aspergillus nomius）ANHHYSFJ01在普通PDA培养基上，培养7d时的菌株菌落形态；A为正面，B为反面；

图2为实施例1中曲霉属真菌菌株集峰曲霉（Aspergillus nomius）ANHHYSFJ01 产孢结构显微图；

图3为实施例5中曲霉属真菌菌株集峰曲霉（Aspergillus nomius）ANHHYSFJ01 菌株侵染红火蚁导致红火蚁死亡并且发育出大量产孢结构和分生孢子；

图4为实施例6中曲霉属真菌菌株集峰曲霉（Aspergillus nomius）ANHHYSFJ01菌株在蚁巢中侵染红火蚁，在红火蚁身上生长发育的显微镜下观察的形态特征；

图5为实施例6中曲霉属真菌菌株集峰曲霉（Aspergillus nomius）ANHHYSFJ01菌株在蚁巢中大量侵染红火蚁导致红火蚁死亡。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明所述的曲霉属真菌菌株分类命名为Aspergillus nomius，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏日：2018年12月28日，保藏编号：CGMCC No.17066，所述曲霉属真菌属于菌物界， 真菌门，丝孢纲，丝孢目，淡色孢科，曲霉属。

本发明所述的曲霉属真菌菌株的应用为所述的曲霉属真菌菌株在制备生物防治红火蚁生物制剂中的应用。

所述的曲霉属真菌菌株制备生物防治红火蚁生物制剂包括菌株活化与扩繁、孢子悬浮液的配制和生防效果测定步骤，具体包括：

A、菌株活化与扩繁：将所述的曲霉属真菌菌株接种到活化及扩繁培养基上，于20~30℃下培养10~20天至菌落产生无性分生孢子得到活化与扩繁产孢菌株；所述的活化及扩繁培养基为PDA培养基；

B、孢子悬浮液的配制：将活化与扩繁产孢菌株接种到PDA培养基上，在20~30℃下恒温培养10~20天，用添加0.05%Tween-80的无菌水溶液冲洗培养皿中的孢子，将培养皿中的菌液和孢子都倒入杯中并且不停震荡30min，用擦镜纸过滤,最终得到未计数的孢子悬浮液，放置在显微镜下，血球计数板计数，记录内部400小格中的所有孢子数，最终计算出所制作的孢子悬浮液的总孢子数量，稀释配置成不同浓度梯度孢子悬浮液；

C、生防效果测定：在塑料杯的杯口均匀涂抹防虫逃逸粉，用小型喷壶向塑料杯中的红红火蚁均匀喷洒不同浓度梯度包子悬浮液。

下面以具体实施案例对本发明做进一步说明：

实施例1

——曲霉属真菌菌株集峰曲霉（Aspergillus nomius）ANHHYSFJ01的获得、鉴定与保藏。

（1）曲霉属真菌菌株集峰曲霉（Aspergillus nomius）ANHHYSFJ01的获得、鉴定。

本发明所述的曲霉属真菌，自红火蚁分离，红火蚁采自云南省昆明市东三环路，盘龙区、呈贡区、东川区、德宏傣族景颇族自治州芒市。将带有红火蚁蚁后的完整巢穴进行实验室室内饲养。

将配比浓度为75%的乙醇溶液清洗红火蚁5秒，然后将配比为0.1%的升汞溶液对虫体表面消毒2-3分钟，无菌水缓慢冲淋3次，用灭菌的镊子将红火蚁虫体按头、胸、腹不同部位分开，并且将分开后的红火蚁不同的身体部位小心放置到培养基中进行分离培养。

接种至繁殖培养基中25℃±黑暗静置培养9d，至菌落长出。增殖培养基为PDA培养基。待菌落长出后，挑取长势旺盛者至保存培养基中，保存培养，保存培养基为PDA培养基。

PDA固态培养基成分以g/L计优选为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、PH自然。

对上述分离的菌株ANHHYSFJ01，通过生物学特性观察，进行进一步的形态学鉴定及分子鉴定，实验结果记录如下。

A、形态特征：在PDA培养基中于25℃±培养7d，菌落直径7厘米，生长速度较快，菌丝体白色，菌落淡黄色至淡黄褐色；菌落丝绒状，有放射状沟纹；培养基背面呈现黄褐色。孢子囊呈球状，直径20-40um；分生孢子球形，直径2.0—3.5um，壁稍粗糙。营养菌丝具有分隔；气生菌丝的一部分形成长而粗糙的分生孢子梗，顶端产生烧瓶形或近球形顶囊，表面产生许多双层小梗，小梗上着生成串的表面粗糙的球形分生孢子。分生孢子梗、顶囊、小梗和分生孢子合成孢子头，

B、培养特征：在PDA培养基上，于25℃±培养10d，菌落结构疏松，开始为白色，5d后转为绿色，数日后变为深绿色，呈粉末状。分生孢子头的顶囊烧瓶状，小梗单层，排列成木栅状，布满顶囊表面3/4，顶端有链形分生孢子，分生孢子球形。

C、菌株的稳定性：该菌生长温度范围在15～35℃，适宜生长温度为20℃～30℃，生长PH值在5.5～7.5，最适宜PH值为6.5～7。

D、5.8S r DNA序列分析：对该菌株进行DNA序列测定，该菌株ANHHYSFJ01的总DNA为模板，在引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG3'）和ITS4（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3'）的引导下PCR扩增该菌株的5.8S r DNA序列，PCR反应体系为：2 × Taq Master Mix 25μL，去离子水20μL，引物ITS1 1.5μL，引物ITS4 1.5μL，DNA 2μL，共50ul。PCR反应条件: a、94℃3 min；b、94℃30 s，56℃40s，72℃50s，35个循环；c、72℃10 min，4℃保存。

DNA序列分析：将PCR反应产物送到生物公司测序得ITS序列，经复检，在美国国家生物技术信息中心（NCBI）中比对，比对结果表明，菌株ANHHYSFJ01与曲霉属真菌（Aspergillus nomius）的5.8S r DNA序列的相似性达到了99%。通过序列比对和形态特征将菌株ANHHYSFJ01鉴定为曲霉属真菌的一种真菌，（Aspergillus nomius）。本发明所述的菌株ANHHYSFJ01其5.8S r DNA序列如下：

（2）曲霉属真菌集峰曲霉（Aspergillus nomius）ANHHYSFJ01的保藏。

通过上述鉴定结果，确认菌株ANHHYSFJ01为曲霉属真菌的一种，编号为ANHHYSFJ01，于2018年12月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心(China General Microbiological Culture Collection Center,简称 CGMCC。地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100080)。其保藏编号为CGMCC No：17066

实施例2

——以曲霉属真菌集峰曲霉（Aspergillus nomius）ANHHYSFJ01制备生防菌剂。

（1）孢子悬浮液的配制。

首先，将曲霉属真菌集峰曲霉（Aspergillus nomius）ANHHYSFJ01菌株接种于普通PDA培养基上，在25℃±培养箱中恒温培养15d。

PDA固态培养基成分以g/L计优选为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、PH自然。

然后将灭菌的无菌水添加0.05%Tween-80。

无菌水溶液冲洗培养皿中的孢子。

将培养皿中的菌液和孢子都倒入杯中并且不停震荡30min,用擦镜纸过滤,最终得到未计数的孢子悬浮液。

拿出血球计数板，放置在显微镜下，记录内部400小格中的所有孢子数。

最终计算出所制作的孢子悬浮液的总孢子数量，稀释配置成1.0×10⁶个·mL⁻¹孢子悬浮液。

（2）结果核准检验。

载玻片滴加未稀释浓度的孢子悬浮液和稀释之后的孢子悬浮液。在显微镜下观察未稀释浓度的孢子悬浮液和稀释之后的孢子悬浮液载玻片上孢子数量，检测是否明显差异。

实施例3

——以曲霉属真菌集峰曲霉（Aspergillus nomius）ANHHYSFJ01制备生防菌剂。

（1）孢子悬浮液的配制。

首先，将曲霉属真菌集峰曲霉（Aspergillus nomius）ANHHYSFJ01菌株接种于普通PDA培养基上，在26℃培养箱中恒温培养15d。

PDA固态培养基成分以g/L计优选为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、PH自然。

然后将灭菌的无菌水添加0.05%Tween-80。

无菌水溶液冲洗培养皿中的孢子。

将培养皿中的菌液和孢子都倒入杯中并且不停震荡30min,用擦镜纸过滤,最终得到未计数的孢子悬浮液。

拿出血球计数板，放置在显微镜下，记录内部400小格中的所有孢子数。

最终计算出所制作的孢子悬浮液的总孢子数量，稀释配置成1.0×10⁷个·mL⁻¹孢子悬浮液。

（2）结果核准检验。

载玻片滴加未稀释浓度的孢子悬浮液和稀释之后的孢子悬浮液。在显微镜下观察未稀释浓度的孢子悬浮液和稀释之后的孢子悬浮液载玻片上孢子数量，检测是否明显差异。

实施例4

——以曲霉属真菌（Aspergillus nomius）ANHHYSFJ01进行生物防治效果测定。

首先，敲击红火蚁蚁巢，用灭菌棉花球吸引红火蚁攻击，将棉花球和爬上棉花球叮咬的红火蚁一同放置进底部为3厘米的塑料杯，挑选个体大小一致的红火蚁留在杯内并计数，每杯试虫为30只。

在杯口均匀涂抹防虫逃逸粉。防治红火蚁外逃。

用小型喷壶向塑料杯中的红火蚁均匀喷洒1.0×10⁶个·mL⁻¹孢子悬浮液，加入一个滴加 15％的无菌蜂蜜水的棉花球给红火蚁补充营养。给塑料杯中的棉花球注射一定量的无菌水达到保湿目的，并且把塑料杯盖封口并扎数个小孔通气。

用添加0.05%Tween-80的无菌水溶液做对照。

一同移送至培养箱中恒温培养10d，每24小时开箱拿出塑料杯，记录死亡的工蚁数量，并将死亡的工蚁挑出保湿培养，查看是否有真菌生长。

对比出导致红火蚁工蚁死亡的原因。仔细计算工蚁累计死亡率。试验重复三次。

实施例5

——以曲霉属真菌集峰曲霉（Aspergillus nomius）ANHHYSFJ01进行生物防治效果测定。

首先，敲击红火蚁蚁巢，用灭菌棉花球吸引红火蚁攻击，将棉花球和爬上棉花球叮咬的红火蚁一同放置进底部为3厘米的塑料杯，挑选个体大小一致的红火蚁留在杯内并计数，每杯试虫为30只。

在杯口均匀涂抹防虫逃逸粉。防治红火蚁外逃。

用小型喷壶向塑料杯中的红火蚁均匀喷洒1.0×10⁷个·mL⁻¹孢子悬浮液，加入一个滴加 15％的无菌蜂蜜水的棉花球给红火蚁补充营养。给塑料杯中的棉花球注射一定量的无菌水达到保湿目的，并且把塑料杯盖封口并扎数个小孔通气。

用添加0.05%Tween-80的无菌水溶液做对照。

一同移送至培养箱中恒温培养10d,每24小时开箱拿出塑料杯，记录死亡的工蚁数量，并将死亡的工蚁挑出保湿培养，查看是否有真菌生长。

对比出导致红火蚁工蚁死亡的原因。仔细计算工蚁累计死亡率。试验重复三次。

实施例6

——以曲霉属真菌集峰曲霉（Aspergillus nomius）ANHHYSFJ01进行真实土壤环境生物防治。

1、按照上述实施例2中步骤(1)制备分生孢子的方法，将曲霉属真菌集峰曲霉（Aspergillus nomius）ANHHYSFJ01分生孢子加入0 .05％的吐温-80溶液中，按以下浓度或方法设置实验组和对照组：

1.0×10⁶个·mL⁻¹孢子悬浮液、1.0×10⁷个·mL⁻¹孢子悬浮液、空白对照:清水。

每个处理2个蚁巢，敲击蚁巢，引诱大量红火蚁爬出蚁巢表面，分别喷洒不同浓度的曲霉属真菌（Aspergillus nomius）ANHHYSFJ01分生孢子悬浮液，目测蚁巢完全湿透，停止喷洒。

生物防治处理10d后，挖开蚁巢，查看并统计死亡红火蚁数量。

实施例7

——以曲霉属真菌集峰曲霉（Aspergillus nomius）ANHHYSFJ01生物防治效果数据的分析。

在实验室内，将红火蚁在不同的浓度孢子悬浮液中进行喷雾法处理，连续10d记录红火蚁的死亡率；敲击蚁巢，引诱大量红火蚁爬出蚁巢表面，分别喷洒不同浓度的曲霉属真菌集峰曲霉（Aspergillus nomius）ANHHYSFJ01分生孢子悬浮液，用SPSS 22.0软件分析计算各浓度的致死率。采用SPSS 22.0软件处理试验数据,进行差异显著性分析。

计算公式如下：

死亡率(％)＝死亡虫数/处理前虫数×100％

校正死亡率(％)＝(处理死亡率-对照死亡率)/(1-对照死亡率)×100％

结果显示，喷雾法处理10d后，曲霉属真菌集峰曲霉（Aspergillus nomius）ANHHYSFJ01菌株分生孢子对红火蚁毒力效果：

1.0×10⁶个·mL⁻¹孢子悬浮液、1.0×10⁷个·mL⁻¹孢子悬浮液浓度分别对应校正死亡率为71.37%和74.08%。如表1显示。结果表明，曲霉属真菌（Aspergillus nomius）ANHHYSFJ01对红火蚁的致死效果非常迅速。

表1不同浓度的ANHHYSFJ01菌株孢子悬浮液对红火蚁的毒力测定

注:数据后不同字母表示在0.05 水平上差异显著

用SPSS 22.0软件对分生孢子浓度与红火蚁校正死亡率进行回归分析。回归方程为Y＝10.112X+6.328。

浓度X使用底数为10的对数来转换。

结果显示，喷雾法处理10d后，曲霉属真菌集峰曲霉（Aspergillus nomius）ANHHYSFJ01菌株分生孢子对红火蚁整体蚁巢毒力效果：

菌株对红火蚁的田间药效毒力，1.0×10⁶个·mL⁻¹孢子悬浮液、1.0×10⁷个·mL⁻¹孢子悬浮液浓度分别对应红火蚁死亡数为358和425只。结果表明，曲霉属真菌集峰曲霉（Aspergillus nomius）ANHHYSFJ01 能够对蚁巢中、土壤中的红火蚁造成集中大量死亡。致死速度快。

Claims (3)

1.一株曲霉属真菌菌株，其特征在于所述的曲霉属真菌菌株分类命名为Aspergillus nomius，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏日：2018年12月28日，保藏编号：CGMCC No.17066，所述曲霉属真菌属于菌物界，真菌门，丝孢纲，丝孢目，淡色孢科，曲霉属。

2.一种权利要求1所述的曲霉属真菌菌株的应用，其特征在于所述的曲霉属真菌菌株在制备生物防治红火蚁生物制剂中的应用。

3.根据权利要求2所述的曲霉属真菌菌株的应用，其特征在于所述的曲霉属真菌菌株制备生物防治红火蚁生物制剂包括菌株活化与扩繁、孢子悬浮液的配制和生防效果测定步骤，具体包括：

A、菌株活化与扩繁：将所述的曲霉属真菌菌株接种到活化及扩繁培养基上，于20~30℃下培养10~20天至菌落产生无性分生孢子得到活化与扩繁产孢菌株；所述的活化及扩繁培养基为PDA培养基；

B、孢子悬浮液的配制：将活化与扩繁产孢菌株接种到PDA培养基上，在20~30℃下恒温培养10~20天，用添加0.05%Tween-80的无菌水溶液冲洗培养皿中的孢子，将培养皿中的菌液和孢子都倒入杯中并且不停震荡30min，用擦镜纸过滤,最终得到未计数的孢子悬浮液，放置在显微镜下，血球计数板计数，记录内部400小格中的所有孢子数，最终计算出所制作的孢子悬浮液的总孢子数量，稀释配置成不同浓度梯度孢子悬浮液；

C、生防效果测定：在塑料杯的杯口均匀涂抹防虫逃逸粉，用小型喷壶向塑料杯中的红红火蚁均匀喷洒不同浓度梯度包子悬浮液。