CN117736877A

CN117736877A - 一种绿僵菌菌株及其应用

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Publication number: CN117736877A
Application number: CN202311224397.8A
Authority: CN
Inventors: 陈娟; 李书萌; 黄盼盼; 王琳; 蒋先芝
Original assignee: Moon Guangzhou Biotech Co ltd
Current assignee: Moon Guangzhou Biotech Co ltd
Priority date: 2022-09-20
Filing date: 2023-09-20
Publication date: 2024-03-22
Anticipated expiration: 2043-09-20
Also published as: CN117736877B

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体而言，涉及一种绿僵菌(Metarhizium sp.)菌株及其应用。绿僵菌菌株MN115074保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:61331，保藏日期为2020年12月1日。所述的绿僵菌菌株MN115074具有生防和促生的功效。

Description

一种绿僵菌菌株及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体而言，涉及一种绿僵菌菌株及其应用。

背景技术

绿僵菌(Metarhizium)是一类重要的虫生真菌，约有200多种害虫能被这种真菌感染致死。绿僵菌的孢子可以附着在害虫表皮，穿透表皮入侵到害虫体内，利用害虫营养生长繁殖并分泌毒素直至害虫死亡。害虫死亡后的尸体又可以产生并释放新的孢子，经传播感染其他害虫。绿僵菌属目前在全世界范围内拥有约30个物种，不同的绿僵菌属物种能侵染致死的害虫的范围不同，毒性也有差异。目前研究最多并且已经在多个地方注册的绿僵菌产品大多为金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae。此外也有报道黄绿绿僵菌Metarhizium flavoviride杀烟粉虱，蝗绿僵菌Metarhizium acridum杀蝗虫的报道；现有技术中报道的绿僵菌多数用于林间害虫防治，如金针虫。已经报道的通过室内分离得到的具有毒力的绿僵菌菌株很多，但是在田间实际应用的防治效果很差，致使能通过登记的绿僵菌商品制剂屈指可数，对于绿僵菌产品，市面上常见的是聚立信的金龟子绿僵菌，对于其他绿僵菌，能够真正大面积推广的，且应用于田间害虫并且具有良好防效且能够促进作物生长的绿僵菌商品制剂更为罕见。

目前，防治病虫害以及植物促生剂大多数为化学农药，化学农药多存在药效逐年降低、药物残留、环境污染等问题，东亚飞蝗(Locusta migratoria manilensis(Meyen))直翅目，蝗科，迁飞性杂食性害虫，是导致我国蝗灾发生的首要害虫。目前，我国蝗虫的主要控制手段是化学防治，化学农药大量长期施用已经造成蝗区严重的环境污染，使蝗区生态平衡受到破坏,蝗虫灾害的发生与治理进入恶性循环。因此，使用环境友好的生物农药替代化学农药将成为今后控制蝗虫的重要发展方向。杀虫真菌具有资源丰富、安全、不杀伤非目标生物、可持续控制、害虫不易产生抗药性等优点。杀蝗绿僵菌生物农药作为国际蝗虫防治中最重要的可持续的生物防治手段，已被联合国粮农组织(FAO)推荐为环保产品推广应用，但我国目前仅有金龟子绿僵菌一种生物药剂，本研究将为杀虫真菌的应用提供新的绿僵菌菌株资源。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的一个方面，绿僵菌(Metarhizium sp.)菌株MN115074或其变体或其后代，所述绿僵菌菌株MN115074保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:61331，保藏日期为2020年12月1日。

绿僵菌菌株MN115074，在SDAY培养基25℃培养，10天菌落直径为3.3cm，15天菌落直径为4.5cm。菌落呈绒毛状，早期产生白色菌丝，逐渐变成黄色，成熟时产生暗绿或墨绿色的分生孢子。最适生长温度为20～28℃。

优选地，所述变体或后代与所述绿僵菌菌株MN115074具有相似或相同的功能。

优选地，所述绿僵菌菌株MN115074的变体或后代与所述绿僵菌菌株MN115074具有相似或相同的生理生化特性。

优选地，所述绿僵菌菌株MN115074具有选自下列的一项或多项功能：

(1)防治植物虫害；

(2)促进植物生长。

优选地，所述植物虫害为鳞翅目害虫、半翅目害虫、双翅目害虫、直翅目害虫、鞘翅目害虫或蛛形纲害虫中的至少一种引起的植物虫害。

优选地，所述植物虫害为草地贪夜蛾、二化螟、小菜蛾、蛴螬、褐飞虱、白背飞虱、蚜虫、柑橘木虱、柑橘小实蝇、甜菜夜蛾、三化螟、茶尺蠖、玉米螟、灰飞虱、烟粉虱、叶蝉、东亚飞蝗或柑橘全爪螨中的至少一种引起的植物虫害。

本发明的另一个方面，还涉及组合物，包括所述的绿僵菌菌株MN115074或其变体或其后代。

优选地，所述组合物还包含一种或多种另外的生物防治剂，一种或多种化学药物，或其任意组合。

优选地，所述组合物还包含农业上或园艺上可接受的稀释剂，填充剂、溶剂、自发性促进剂、载体、乳化剂、分散剂、防腐剂、防冻剂、增稠剂、佐剂，或其任意组合。

优选地，所述另外的生物防治剂选自细菌、真菌、病毒、昆虫或线虫中的至少一种。

优选地，所述化学药物选自除草剂、杀虫剂、抗菌剂、抗病毒剂、植物生长调节剂、抗生素或肥料中的至少一种；

优选地，每毫升所述组合物中绿僵菌菌株MN115074的孢子数为10⁵～10¹²个；更优选地，每毫升所述组合物中绿僵菌菌株MN115074的孢子数为10⁶～10⁹个。

本发明的另一个方面，还涉及微生物菌剂，包括所述的绿僵菌菌株MN115074或其变体或其后代，所述绿僵菌菌株MN115074或其变体或其后代的孢子，和/或绿僵菌菌株MN115074或其变体或其后代的代谢产物。

本发明的另一个方面，还涉及杀虫剂，包括所述的绿僵菌菌株MN115074或其变体或其后代，或所述的组合物，或所述的微生物菌剂。

优选地，所述绿僵菌菌株MN115074 15天产孢量可达到1×10⁸孢子/cm²。

优选地，所述杀虫剂还包括农药上可接受的农药助剂。

优选地，所述杀虫剂被配制成可润湿的粉末、喷雾干燥的配制物或稳定的配制物。

优选地，所述杀虫剂防治害虫的种类包括鳞翅目害虫、半翅目害虫、双翅目害虫、直翅目害虫、鞘翅目害虫或蛛形纲害虫中的至少一种。

优选地，所述杀虫剂防治害虫的种类包括草地贪夜蛾、二化螟、小菜蛾、蛴螬、褐飞虱、白背飞虱、蚜虫、柑橘木虱、柑橘小实蝇、甜菜夜蛾、三化螟、茶尺蠖、玉米螟、灰飞虱、烟粉虱、叶蝉、东亚飞蝗或柑橘全爪螨中的至少一种。

优选地，所述绿僵菌菌株MN115074在1×10⁸孢子/mL浓度下，对蝗虫的致死中时LT50为1.33天。

优选地，所述绿僵菌菌株MN115074在1×10⁸孢子/mL浓度下，10天时对蝗虫的累计校正致死率为100％。

优选地，所述杀虫剂防治的对象植物包括玉米、大豆、稻子、小麦中的至少一种。

本发明的另一个方面，还涉及促生剂，包括所述的绿僵菌菌株MN115074或其变体或其后代，或所述的组合物，或所述的微生物菌剂。

本发明的另一个方面，还涉及一种防治植物虫害的方法，将所述的杀虫剂施用于植物、植物组织或植物器官。

本发明的另一个方面，还涉及一种植物促生方法，使用所述的促生剂对植物进行促生。

本发明的另一个方面，还涉及所述的绿僵菌菌株MN115074或其变体或其后代，或所述的组合物，或所述的微生物菌剂在害虫防治中的应用。

本发明的另一个方面，还涉及所述的绿僵菌菌株MN115074或其变体或其后代，或所述的组合物，或所述的微生物菌剂在植物促生中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供的绿僵菌菌株MN115074，尤其对防治蝗虫类害虫有效。绿僵菌菌株MN115074营养的要求简单、产孢能力强，对东亚飞蝗3龄蝗蝻杀虫毒力强，室内毒力测定发现，在1×10⁸孢子/mL浓度下，第一天对蝗虫的校正致死率达到66.67％，致死中时LT50为1.33天，死亡蝗虫回接僵虫率为100％，相对于金龟子绿僵菌具有更好的防治效果。利用该菌株能有效地控制蝗虫的种群数量。

(2)本发明提供的绿僵菌菌株MN115074，是一株具有高毒力同时具有杀虫功能的新绿僵菌菌株，该菌株培养方法简单，生长迅速，产孢量大；侵染蝗虫致死率可达100.00％，且无毒无污染，不会破坏生态、不易产生抗药性、对非靶标生物无害，可广泛用于蝗虫的防治中。

(3)本发明提供的绿僵菌菌株MN115074，能够促进植物生长，可作为植物促生剂中的主要促生物质。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为绿僵菌菌株MN115074菌落形态图(正面)；

图2为绿僵菌菌株MN115074菌落形态图(背面)；

图3为绿僵菌菌株MN115074菌丝；

图4为绿僵菌菌株MN115074分生孢子；

图5为培养基上的僵虫；

图6为温度对绿僵菌菌株MN115074生长的影响；

图7为基于多基因建立的绿僵菌菌株MN115074系统发育树。

具体实施方式

下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明涉及的绿僵菌菌株MN115074(Metarhizium sp.)，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:61331，保藏日期为2020年12月1日。

本发明提供了一株新的绿僵菌菌株MN115074，尤其对防治蝗虫类害虫有效。绿僵菌菌株MN115074对营养的要求简单、产孢能力强，对东亚飞蝗3龄蝗蝻杀虫毒力强，致死中时LT50为1.33天。利用该菌株能有效地控制蝗虫的种群数量。

本发明提供的绿僵菌菌株MN115074，是一株具有高毒力同时具有杀虫功能的绿僵菌，该菌株培养方法简单，生长迅速，产孢量大；侵染蝗虫致死率可达100.00％，且无毒无污染，不会破坏生态、不易产生抗药性、对非靶标生物无害，可广泛用于蝗虫的防治中。

本发明提供的绿僵菌菌株MN115074，能够促进植物生长，可作为植物促生剂中的主要促生物质。

实施例1菌株的分离、纯化与鉴定

1.实验方法

1.1分离、纯化

称土：采集广西的农业土壤，晾干后，将土壤样品过筛去除杂质，称取干土10g装入过滤装置中。

洗土：用自来水洗土10min，使土壤颗粒通过1mm黄铜网和两个聚丙烯过滤器向下流动。收集最底层的土壤微粒，将其放入无菌的50mL离心管中，加入50mL无菌水，涡旋混合器使其悬浮。离心机10000rpm离心6min，倒掉上清，用无菌水清洗，再次离心，反复离心清洗3次。

稀释沉淀：按水/颗粒的20:1(v/v)的比例加入无菌的羧甲基纤维素钠溶液。

涂布：用无菌水稀释10倍的上述沉淀悬浮液，用移液器吸取100μL至PDA(含有氯霉素和盐酸四环素)平板上涂布均匀，平板置于28℃黑暗培养2-7d。

真菌纯化：当培养基上长出单个白色絮状的菌落，用无菌牙签挑取少量菌丝至SDAY平板中继续培养得到纯化菌株。绿僵菌菌株MN115074菌落的形态图见图1和图2所示。

1.2形态学鉴定

将分离到的绿僵菌接种在SDAY培养基平板上28℃培养15天观察菌落形态特征、产孢结构和孢子形态大小。在4-5天后挑取白色菌丝做成制片，在显微镜下观察菌丝及分生孢子梗形态；10-12天挑取分生孢子做成制片观察分生孢子的大小及形态。15天观察记录菌落形态特征。绿僵菌菌株MN115074的菌丝及分生孢子的形态见图3和图4。

1.3分子生物学鉴定

利用菌株的菌丝体提取基因组DNA，作为基因扩增的模板，对菌株进行多基因扩增及测序。需扩增的基因及引物为：

ITS:ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)

BenA:Bt1F(5’-GGTCCCTTCGGTCAGCTCTTCC-3’)和Bt1R(5’-CAGCCATCATGTTCTTAGGGTC-3’)

EF:983F(5’-GCYCCYGGHCAYCGTGAYTTYAT-3’)和2218R(5’-ATGACACCRACRGCRACRGTYTG-3’)

RPB2:5F(5’-GAYGAYMGWGATCAYTTYGG-3’)和7CR(5’-CCCATRGCTTGYTTRCCCAT-3’)

以上引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

模板DNA提取：根据Biospin Fungus Genomic DNA Extraction Kit(BioFlux,Bioer Technology Co.,Ltd.)进行基因组DNA提取。

基因扩增反应体系：在PCR管配制反应体系2XTaq PCR Master Mix 12μL，DMSO 1μL，引物1引物2(10μmol/L)各0.6μL，ddH₂O 10.8μL，模板DNA 2μL。

基因扩增条件：预变性94℃4min；变性94℃40s，退火55℃40s，延伸72℃1min，变性至延伸进行35个循环；延伸72℃10min，10℃保温5min。PCR后的样品送金唯智测序。

ITS测序结果见序列1，BenA测序结果见序列2，EF测序结果见序列3，RPB2测序结果见序列4。

序列1如下：

CATTACCGAGTTATCCAACTCCCAACCCCTGTGAATTATACCTTTCATTGTTGCTTCGGCGGGACTTCGCGCCCGCCGGGGACCCAAACCTTCTGAATTTTTTAATAAGTATCTTCTGAGTGGTTAAAAAAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGTCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACGCCCCTCAAGTCCCCTGTGGACTTGGTGTTGGGGATCGGCGAGGCTGGTTTTCCAGCACAGCCGTCCCTTAAATTGATTGGCGGTCTCGCCGTGGCCCTCCTCTGCGCAGTAGTAAAACACTCGCAACAGGAGCCCGGCGCGGTCCACTGCCGTAAAAACCCCCAACTTTTTATAGTTGACCTCGAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAGGC。

序列2如下：

GGCCAGCTCTTCCGCGGCATCATTCGCAGAATGAATACGGAATTGTCCAATTATTTGCGAAGATGCGTTGAAGGTAACCGGCATTTCAACTTGGCAGTTGGTATCAAACCTGGAACACTTTCCAACGGTTTGAAATATTCCCTTGCCACTGGCAACTGGGGAGATCAGAAGAAGGCCATGAGTTCGACTGCCGGCGTGTCTCAAGTGTTGAATAGGTATACTTTTGCTTCGACACTCTCTCACTTGCGACGAACCAACACACCGATTGGTAGAGATGGTAAGCTCGCTAAACCGCGTCAGCTGCACAACACACACTGGGGCTTGGTCTGTCCTGCCGAGACGCCAGAAGGTCAGGCTTGCGGCCTGGTCAAGAACCTGTCATTGATGTGTTATGTCAGTGTGGGTTCACCGGCCGAGCCATTGATTGAATTCATGATCAACCGTGGCATGGAAGTGGTAGAAGAGTACGAGCCGCTGAGATATCCCCATGCCACCAAGATCTTTGTCAATGGTGTTTGGGTTGGTGTACACCAAGATCCTAAGCACCTGGTCAGTCAAGTCTTGGATACTAGACGAAAGTCGTATCTGCAGTACGAGGTGTCTCTCGTCCGAGAAATCAGGGATCAAGAGTTCAAGATTTTCTCCGACGCTGGCCGAGTTATGAGACCAGTTTTTACTGTGCAGCAAGAAGATGATCCCGAGACTGGCATTGAAAAAGGCCATCTCGTCCTGACCAAAGAGTTGGTTAACAAGCTTGCTAAAGAACAAGCTGAACCACCCGAAGACCCAAGCGAGAAAATTGGCTGGGAAGGACTGATTCGTGCCGGCGCCGTCGAGTACCTCGATGCCGAAGAAGAAGAGACATCAATGATCTGCATGACGCCAGAAGATCTTGAGCTGTATCGTCTGCAGAAAGCCGGTGTTGCTCTTGATGACGATATTGGAGATGACCTGAATAAGCGTCTCAAGACCAAGACCAACCCCACAACGCACATGTATACGCATTGTGAAATTCACCCCAGTATGATTCTTGGTATTTGCGCTAGTATTATTCCGTTCCCCGATCACAATCAGGTAAGCAGCCTTTGTCAAGAATTGTCTCTTGCTCTACTGACAG。

序列3如下：

ATGATCACTGGTACTTCCCAGCGCTGACTGCGCTATTCTCATTATCGCTGCCGGTACTGGTGAGTTCGAGGCTGGTATCTCCAAGGATGGCCAGACCCGTGAGCACGCTCTGCTCGCCTACACCCTGGGTGTCAAGCAGCTCATGTCGCCATCAACAAGATGGACACCACCAAGTGGTCCGAGGCCCGTTACCAGGAAATCATCAAGGAGACTTCCAACTTCATCAAGAAGGTCGGCTACAACCCCAAGACCGTCGCCTTCGTCCCCATCTCCGGTTTCCACGGTGACAACATGCTTCAGGCCTCCACCAACTGCCCCTGGTACAAGGGTTGGGAGAAGGAGACCAAGGCTGGCAAGTCCACCGGCAAGACCCTCCTCGAGGCCATTGACGCCATTGAGCCCCCCAAGCGTCCCACCGACAAGCCCCTCCGTCTTCCCCTCCAGGATGTGTACAAGATCGGCGGTATTGGAACTGTCCCTGTCGGCCGTATCGAGACTGGTGTCCTCAAGCCCGGTATGGTCGTTACCTTCGCTCCTTCCAACGTCACCACTGAAGTCAAGTCCGTGGAAATGCACCACGAGCAGCTTACCGAGGGTGTCCCCGGTGACAACGTTGGTTTCAACGTGAAGAACGTTTCCGTCAAGGAAATCCGCCGTGGTAACGTTGCTGGTGACTCCAAGAACGACCCCCCCTCTGGTGCCGCTTCCTTCGATGCCCAGGTCATCGTTCTCAACCACCCCGGCCAGGTGGGTGCTGGTTACGCTCCCGTCCTCGATTGCCACACCGCCCACATTGCCTGCAAGTTCTCTGAGATCAAGGAGAAGATTGACCGACGTACCGGTAAGGCTGTTGAGTCTGCCCCCAAGTTCATCAAGTCTGGTGACTCTGCCATCGTCAAGATGGTTCCCTCCAAGCCCATGTGCGTTGAGGCTTTCACCGACTACCCTCTC。

序列4如下：

2.结果

该菌株在SDAY培养基上初期为白色，而向淡黄色或黄色过度，形状为絮状或绒毛状突起，后期出现绿色的孢子。约在第4天开始产孢，菌丝有隔，分生孢子单细胞，柱状。分生孢子长椭圆形、链状排列，大小为(4.8～8.2)μm×(1.9～2.3)μm。

将测序的获得的序列与NCBI基因数据库的绿僵菌菌株序列进行比对。经鉴定，该菌株为绿僵菌菌株(Metarhizium sp.)，命名为MN115074。

基于多基因(ITS、BenA、EF、RPB1和RPB2)建立的系统发育树如图7所述，显示菌株GDMCC No:61331为Metarhizium sp.。

实施例2绿僵菌的生物学测定

1实验方法

1.1温度对菌株生长的影响

将培养好的绿僵菌孢子用0.1％Tween80洗下，吸取10μL接种到新的SDAY培养基上，在20℃、25℃、28℃、30℃、37℃五个不同温度下恒温培养，每天测量菌落直径，每组3个重复。

1.2菌落生长速率测定

将培养好的绿僵菌孢子用0.1％Tween80洗下，吸取10μL接种到新的SDAY培养基上，做3个重复，每天定时测定其直径并记录数据，直到菌落长满培养基为止。

1.3产孢量测定

将100μL孢子悬浮液涂布于SDAY上，在28℃条件下培养10～15d后，用打孔器从平板上截取直径8mm的菌片，在超声波破碎仪上将菌片上的分生孢子振动洗入10mL0.1％Tween80中，用血球计数板计数测定孢子浓度，再换算为每cm²平板上的产孢量。每个平板打3个孔进行孢子含量测定取其平均值，作为1个重复的孢子数。各菌株重复测定3次。

1.4孢子萌发率测定

将培养10～15d的绿僵菌平板，用打孔器取直径4mm的菌片，在超声波破碎仪上将菌片上的分生孢子振动洗入2mL 0.1％Tween80中，各取20μL孢子悬浮液加到带有凹槽的载玻片上，把载玻片放在含有湿润滤纸的平皿中，置于相同条件的培养箱内培养24h，用400倍的倒置生物显微镜随机观察载玻片3个视野，以孢子的芽管长度大于或等于孢子短轴直径为标准，统计孢子萌发率。

2.结果

温度对菌株生长的影响：从图6可以看出，温度在20～30℃时菌株都能生长，在28℃时生长速率比其他温度都高；在低温(20℃)时的生长速率低于25℃和30℃时的生长速率；在高温(37℃)时，菌株生长受到严重抑制，表现为菌株不能生长。由此可知菌株生长的最适温度为25～30℃。

菌落生长速率：由表1可以看出，第1d时，菌株生长缓慢，未能形成肉眼可见的形态，从第2d开始，菌株开始快速生长并在第四天达到最快；第4d时，由于菌株开始产孢，菌落的生长速度也相应下降。

表1生长速率表

产孢量和孢子萌发率：在SDAY培养基上培养至第15天产孢量就可达1×10⁸孢子/cm²。产孢量较高。24小时孢子的萌发率可达70％以上。上述均说明该菌株营养要求简单、生长繁殖较快、产孢快，生物学特性良好。

实施例3对蝗虫的致病力测定

1.实验方法

将供筛选菌株从-80℃取出，在SDAY平板上活化，25℃培养7～15d，直到产孢。用0.1％Tween80将绿僵菌孢子洗下，用血球计数板计数，获得具体浓度的孢子悬浮液，再经过稀释或浓缩配制成1×10⁵孢子/mL、1×10⁶孢子/mL、1×10⁷孢子/mL、1×10⁸孢子/mL、1×10⁹孢子/mL的悬浮液。

挑选好的大小、活性一致的3龄蝗蝻。用移液器取10μL的孢子悬浮液点在蝗虫的前胸背板上。每个处理3个重复，每个重复15只蝗蝻。以无菌的0.1％Tween80水作为空白对照。每日喂新鲜小麦苗。置于28℃～30℃，RH 55％±5％，16L∶8D条件下培养，连续观察10d，记录死亡情况。蝗虫死亡判断，以镊子轻轻触碰蝗虫，不动则为死亡。

死亡蝗虫回接：此步骤验证蝗虫是否由绿僵菌侵染致死。对死亡蝗虫进行表面消毒，具体方法为75％酒精15s，0.05％次氯酸钠1min，无菌水1min清洗两次，然后在灭菌滤纸上晾干，最后把蝗虫放入SDAY培养基(含氯霉素和盐酸四环素)上，观察蝗虫表面是否长出绿僵菌。结果见图5。

与市售产品的毒力比较：选取常用杀虫剂溴氰菊酯(拜耳)和金龟子绿僵菌CQMa421(聚立信)进行对照。溴氰菊酯稀释1000倍，金龟子绿僵菌CQMa421和绿僵菌菌株MN115074稀释为1×10⁸孢子/mL，移液枪取10μL的孢子悬浮液点在蝗虫的前胸背板上。每个处理3个重复，每个重复15只蝗蝻。

数据计算：

防效(％)＝[1-(处理区药后活虫数×对照区药前活虫数)/(处理区药前活虫数×对照区药后活虫数)]×100％。

2.结果

实验结果见表2～6，实验结果表明，绿僵菌菌株MN115074对蝗虫有显著的致病效果。在不同浓度绿僵菌菌株MN115074孢子悬浮液处理下，10d时致死中浓度(LC50)为2.23×10⁶孢子/mL；在1×10⁸孢子/mL浓度下，10d时绿僵菌菌株MN115074对蝗虫的累计校正致死率为100％，致死中时(LT50)为1.33天，死亡蝗虫回接僵虫率为100％。上述结果表明，绿僵菌菌株MN115074具有开发为防治蝗虫的微生物农药的潜力。

表2绿僵菌菌株MN115074用于蝗虫的校正死亡率(％)

注：同列数字后英文字母相同者表示在0.05水平上差异不显著(DMRT法)，下表同。

表3绿僵菌菌株MN115074用于蝗虫的LC50回归方程及LC50

表4绿僵菌菌株MN115074用于蝗虫的LT50回归方程及LT50

表5绿僵菌菌株MN115074对蝗虫的室内毒力测试结果(1×10⁸孢子/mL)

表6绿僵菌菌株MN115074和市售产品的室内毒力测试结果(1×10⁸孢子/mL)

实施例4对害虫的防治效果

将绿僵菌菌株MN115074从-80℃取出，在SDAY平板上活化，28℃培养7～15d，直到产孢。用0.1％Tween80将绿僵菌孢子洗下，用血球计数板计数，获得具体浓度的孢子悬浮液。选取1*10⁸孢子/mL的绿僵菌菌株MN115074孢子悬浮液进行单次或多次室内杀虫实验，选取最优次结果计算出下表防治效果。具体试验方法参照行业标准《农药室内生物测定试验准则》。结果见表7，结果显示绿僵菌菌株MN115074对多种害虫具有防治效果。

表7绿僵菌菌株MN115074对害虫的防治效果

害虫种类	防效(％)	害虫种类	防效(％)
				草地贪夜蛾	39.33	甜菜夜蛾	85.67
二化螟	79.63	三化螟	80.24
				小菜蛾	89.32	茶尺蠖	93.22
蛴螬	70.33	玉米螟	60.33
				褐飞虱	87.73	灰飞虱	78.74
白背飞虱	80.35	烟粉虱	89.97
				蚜虫	93.33	叶蝉	60.74
柑橘木虱	91.33	东亚飞蝗	100
				柑橘小实蝇	90.58	柑橘全爪螨	65.67

实施例5绿僵菌对植物促生作用测定

选取健康且大小一致的玉米种子(郑单958)进行表面消毒后，将种子于1×10⁷孢子/mL的绿僵菌菌株MN115074孢子悬液中浸泡半小时后播种，每盆播种5颗种子，共3盆，播种后向每颗种子浇灌1mL处理液。以无菌水为对照组，置于25℃温室，以12L:12D的光周期进行培育，实验期间定期往育苗盆及底盘补充水，保证水分充足。盆栽培育20天后，收获植株洗净后放入70℃烘箱烘至恒重后测量植物干重。结果见表8。

表8各生长指标

结果显示相比于对照组，绿僵菌菌株MN115074处理组的玉米植株干重提高了8.61％，说明该菌株对植物生长具有一定的促生作用。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；本领域的普通技术人员应当理解：在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围；因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些替换和修改。

Claims

1.绿僵菌(Metarhizium sp.)菌株MN115074或其变体或其后代，所述绿僵菌菌株MN115074保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:61331，保藏日期为2020年12月1日。

2.根据权利要求1所述的绿僵菌菌株MN115074或其变体或其后代，其特征在于，其中，所述变体或后代与所述绿僵菌菌株MN115074具有相似或相同的功能；

优选地，所述绿僵菌菌株MN115074的变体或后代与所述绿僵菌菌株MN115074具有相似或相同的生理生化特性；

(1)防治植物虫害；

(2)促进植物生长；

优选地，所述植物虫害为鳞翅目害虫、半翅目害虫、双翅目害虫、直翅目害虫、鞘翅目害虫或蛛形纲害虫中的至少一种引起的植物虫害；

3.一种组合物，其包括权利要求1或2所述的绿僵菌菌株MN115074或其变体或其后代；

优选地，所述组合物还包含一种或多种另外的生物防治剂，一种或多种化学药物，或其任意组合；

优选地，所述组合物还包含农业上或园艺上可接受的稀释剂、填充剂、溶剂、自发性促进剂、载体、乳化剂、分散剂、防腐剂、防冻剂、增稠剂、佐剂，或其任意组合；

优选地，所述另外的生物防治剂选自细菌、真菌、病毒、昆虫或线虫中的至少一种；

4.微生物菌剂，其特征在于，包括权利要求1或2所述的绿僵菌菌株MN115074或其变体或其后代，所述绿僵菌菌株MN115074或其变体或其后代的孢子，和/或绿僵菌菌株MN115074或其变体或其后代的代谢产物。

5.杀虫剂，其特征在于，包括权利要求1或2所述的绿僵菌菌株MN115074或其变体或其后代，或权利要求3所述的组合物，或权利要求4所述的微生物菌剂；

优选地，所述绿僵菌菌株MN115074 15天产孢量可达到1×10⁸孢子/cm²；

优选地，所述杀虫剂还包括农药上可接受的农药助剂；

优选地，所述杀虫剂被配制成可润湿的粉末、喷雾干燥的配制物或稳定的配制物；

优选地，所述杀虫剂防治害虫的种类包括鳞翅目害虫、半翅目害虫、双翅目害虫、直翅目害虫、鞘翅目害虫或蛛形纲害虫中的至少一种；

优选地，所述杀虫剂防治害虫的种类包括草地贪夜蛾、二化螟、小菜蛾、蛴螬、褐飞虱、白背飞虱、蚜虫、柑橘木虱、柑橘小实蝇、甜菜夜蛾、三化螟、茶尺蠖、玉米螟、灰飞虱、烟粉虱、叶蝉、东亚飞蝗或柑橘全爪螨中的至少一种；

优选地，所述绿僵菌菌株MN115074在1×10⁸孢子/mL浓度下，对蝗虫的致死中时LT50为1.33天；

优选地，所述绿僵菌菌株MN115074在1×10⁸孢子/mL浓度下，10天时对蝗虫的累计校正致死率为100％；

6.促生剂，其特征在于，包括权利要求1或2所述的绿僵菌菌株MN115074或其变体或其后代，或权利要求3所述的组合物，或权利要求4所述的微生物菌剂。

7.一种防治植物虫害的方法，其特征在于，将权利要求5所述的杀虫剂施用于植物、植物组织或植物器官。

8.一种植物促生方法，其特征在于，使用权利要求6所述的促生剂对植物进行促生。

9.如权利要求1所述的绿僵菌菌株MN115074或其变体或其后代，或权利要求3所述的组合物，或权利要求4所述的微生物菌剂或权利要求5所述的杀虫剂在害虫防治中的应用。

10.如权利要求1所述的绿僵菌菌株MN115074或其变体或其后代，或权利要求3所述的组合物，或权利要求4所述的微生物菌剂或权利要求6所述的促生剂在植物促生中的应用。