CN104745485A

CN104745485A - 一种金龟子绿僵菌菌株在制备杀稻水象甲的药剂中的应用

Info

Publication number: CN104745485A
Application number: CN201510084191.9A
Authority: CN
Inventors: 夏玉先; 彭国雄
Original assignee: Chongqing Ju Lixin Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Chongqing Ju Lixin Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2015-02-16
Filing date: 2015-02-16
Publication date: 2015-07-01

Abstract

金龟子绿僵菌CQMa421菌株在制备防治稻水象甲的药剂中的应用，该菌株生产的可湿性粉剂由硅藻土(30-40%)、纳米碳化硅（0.5-1%）、羧甲基纤维素钠（3-5%）、吐温-80（3-5%）、OP-10（3-5%）和绿僵菌CQMa421干孢子粉（44-60%）组成。具有良好的润湿性、贮存特性和抗紫外特性，能有效地控制了稻水象甲。

Description

一种金龟子绿僵菌菌株在制备杀稻水象甲的药剂中的应用

技术领域

本发明涉及一种金龟子绿僵菌菌株的新应用，具体涉及其在制备杀稻水象甲的金龟子绿僵菌药剂中的应用，属于生物农药领域。

技术背景

稻水象甲是水稻的毁灭性害虫，成虫取食水稻的细嫩部分，影响水稻的光合作用，幼虫危害根部，阻碍养分传输，使稻苗生长速度减缓，植株矮化，分蘖能力下降，最终导致水稻产量下降，一般造成减产10-30%，严重时达50%以上，甚至绝收。1986年，我国将其列为农业植物检疫对象。然而2011年为止，已扩散到20多个省份，严重威胁到我国农业生产、粮食安全。目前稻水象甲的防治主要以化学防治为主，虽然化学药剂可以在短时间内控制虫口数量，但长期大量的施用会产生害虫抗药性、次要害虫上升为主要害虫、污染环境和农药残留等一系列的生态问题。生物防治是基于生态平衡的原理，利用天敌的作用来调节有害生物种群密度，使之长期稳定在不危害的水平。稻水象甲的专一性强的天敌种类匮乏，真菌是当前稻水象甲主要的生物防治因子。

绿僵菌(Metarhizium)是最早用于防治害虫的昆虫病原真菌之一，能感染全世界约有200多种昆虫，利用它来防治害虫的研究与实践已愈百年。虽然以报道了多个能侵染稻水象甲的绿僵菌，但尚无防治稻水象甲的杀虫真菌产品登记和广泛应用。金龟子绿僵菌CQMa421是一株从自然感染的稻纵卷叶螟僵虫上分离筛选出的一株生产性状好、对稻纵卷叶螟具有高毒力杀虫真菌，已在中国专利CN102212483中公开，该菌株于2011年02月25日，在北京市朝阳区北辰西路1号院3号、中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏编号：CGMCC NO.4609，分类命名：金龟子绿僵菌小孢变种Metarhizium anisopliae var.anisopliae.该菌株及其制剂对稻水象甲的毒力与防治效果未见报道。

可湿性粉剂是一种最基本的农药剂型，可制成悬浊液，进行喷雾。杀虫真菌可湿性粉剂是由真菌孢子粉中加入一定量的表面活性剂和填充料，通过过筛制成。由于真菌孢子活性受润湿剂的影响，制剂中往往减少表面活性剂的用量，导致湿润分散效果差，同时产品贮存期仍较短，很少超过12个月。由于湿润分散特性、贮存稳定性的问题和田间防效受紫外照射影响大，杀虫真菌可湿性粉剂虽有登记注册，一直没有大量应用。因此，筛选驯化高毒力菌株和研制湿润分散特性良好的真菌杀虫剂可湿性粉剂，延长其贮存稳定性，从而促进真菌杀虫剂在防治稻水象甲中的应用，有利于减少水稻生产中化学农药的用量。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种金龟子绿僵菌菌株在防治稻水象甲中的应用。

本发明第二目的在于提供一种金龟子绿僵菌制剂，该制剂耐紫外照射、保存期长、防效好。

本发明第三目的在于提供一种增强金龟子绿僵菌毒力，而不影响其产孢、耐热特性的方法。

本发明目的是通过如下技术方案实现的：

金龟子绿僵菌CQMa421菌株在制备防治稻水象甲金龟子的药剂中的应用，该菌株对稻水象甲金龟子具有侵染作用，致死率可达到57.1%。

不同的绿僵菌菌株具有特定的寄主，如公开报道：金龟子绿僵菌FI-1045菌株能侵染甘蔗蛴螬（Anoplophora glabripennis），金龟子绿僵菌A ESALQ818菌株能侵染埃及斑蚊(Aedes aegypti)，金龟子绿僵菌EAMb 09/01-Su菌株能侵染地中海果实蝇，金龟子绿僵菌PDRL526菌株能侵染萝卜蚜（Lipaphis erysimi），金龟子绿僵菌M2 菌株能侵染螺旋粉虱（Aleurodicus dispersus Russell），金龟子绿僵菌ICIPE-30菌株能侵染冈比亚按蚊（anopheles gambiae），金龟子绿僵菌ESC 1菌株能侵染白蚁，金龟子绿僵菌ATCC62176能侵染甜菜根蛆（sugarbeet root maggot），金龟子绿僵菌M105菌株能侵染蝗虫，金龟子绿僵菌广谱菌株F-52能侵染蛴螬（Anoplophora glabripennis）、核桃象甲、光滑足距小蠹（Xylosandrus germanus），金龟子绿僵菌广谱菌株549能侵染烟草天蛾(Manduca sexta)、埃及斑蚊（Aedes aegypti），罗伯茨绿僵菌广谱菌株ARSEF 23能侵染蝗虫、鳞翅目幼虫、甲虫等。

优选地，上述防治稻水象甲金龟子的药剂由绿僵菌CQMa421干孢子粉44-60%、硅藻土30-40%、纳米碳化硅0.5-1%、羧甲基纤维素钠 3-5%、吐温-80 3-5%和OP-10 3-5%组成，均以重量百分比。

一种金龟子绿僵菌制剂，其特征在于：它是由硅藻土30-40%、纳米碳化硅0.5-1%、羧甲基纤维素钠 3-5%、吐温-80 3-5%、OP-10 3-5%和绿僵菌CQMa421干孢子粉44-60%组成，均以重量百分比。

上述各组分均为本领域明确的组分，吐温-80为聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯、简称聚山梨酯-80，OP-10为烷基酚聚氧乙烯醚，绿僵菌CQMa421在中国专利CN102212483中公开、该菌株于2011年02月25日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏、保藏编号：CGMCC NO.4609；纳米碳化硅为粒径为纳米级的碳化硅。

上述吐温-80和OP-10优选纯度>95%的吐温-80和OP-10；上述羧甲基纤维素钠（CMC）优选纯度大于95%；上述硅藻土优选为白色至浅褐色疏松粉末，纯度大于85%，含水量小于1%；上述纳米碳化硅优选为粒径小于50nm。上述绿僵菌CQMa421干孢子粉为纯孢子粉，含孢量≥150亿孢子/克，含水量≤5%；以上均以质量百分含量计。

上述金龟子绿僵菌制剂中纳米碳化硅包裹在真菌孢子表面，有效阻隔了制剂中高浓度（3-5wt%）吐温-80和OP-10的不良影响，有效保证了孢子的生物活性。

进一步优选地，本发明金龟子绿僵菌制剂，其特征在于：它是由硅藻土35-40%、纳米碳化硅0.5-0.8%、羧甲基纤维素钠 3-5%、吐温-80 3-5%、OP-10 3-5%和绿僵菌CQMa421干孢子粉45-55%组成，均以重量百分比。

上述绿僵菌CQMa421干孢子粉优选采用强毒力金龟子绿僵菌CQMa421孢子粉，所述强毒力金龟子绿僵菌CQMa421孢子粉由以下方法得到：将金龟子绿僵菌CQMa421接种稻水象甲成虫，接种后在28℃、湿度50-70%的条件下饲养，将最先感病死亡的稻水象甲，放入28℃、湿度为50-70%培养箱中保湿培养3-5天，使其昆虫表面生长出新鲜孢子，如上所述循环接种18次，得到驯化后的金龟子绿僵菌CQMa421新鲜孢子；在无菌条件下，用接种环挑取驯化后新鲜孢子在含有100微克/毫升氨苄青霉素的1/4SDA培养基平板上划线，将划线好的培养皿翻转放置于28℃恒温箱中培养；3—4日后挑选长出的典型而无杂菌的菌落，在菌落边缘用移菌针挑取带有菌丝的培养基一小块，转入试管斜面培养基中央，28℃恒温培养10-15天得到强毒力的金龟子绿僵菌CQMa421母种，将CQMa421菌株母种接种在1/4SDA平板上，28℃培养15天，收集成熟分生孢子制得绿僵菌CQMa421干孢子粉。

上述金龟子绿僵菌制剂的制备方法，是先将绿僵菌CQMa421干孢子粉和纳米碳化硅在混合机中混匀，再依次加入硅藻土、羧甲基纤维素钠、吐温-80和OP-10，边加入边搅拌，直至各组分完全混合均匀制得。

一种增强金龟子绿僵菌毒力的方法，其特征在于：将金龟子绿僵菌CQMa421接种于稻水象甲成虫，接种后在28℃、湿度50-70%的条件下饲养，将最先感病死亡的稻水象甲，放入28℃、湿度为50-70%培养箱中保湿培养3-5天，使其昆虫表面生长出新鲜孢子，如上所述循环接种18次得到驯化后的金龟子绿僵菌CQMa421新鲜孢子；在无菌条件下，用接种环挑取驯化后新鲜孢子在含有100微克/毫升氨苄青霉素的1/4SDA培养基平板上划线，将划线好的培养皿翻转放置于28℃恒温箱中培养；3-4日后挑选长出的典型而无杂菌的菌落，在菌落边缘用移菌针挑取带有菌丝的培养基一小块，转入试管斜面培养基中央，28℃恒温培养10-15天得到强毒力的金龟子绿僵菌CQMa421母种。

采用本发明增强毒力的方法驯化后的强毒力金龟子绿僵菌CQMa421菌株，对稻水象甲的致死率可提高42.9%、达到100%；LT₅₀ 为3.2天，缩短55.6%，效果非常突出。

本发明具有如下的有益效果：

本发明金龟子绿僵菌CQMa421菌株能侵染稻水象甲，致死率可达到57.1%，采用本发明增强毒力的方法制得的金龟子绿僵菌CQMa421菌株，其致死率可达到100%，LT₅₀缩短55.6%，效果非常突出。本发明金龟子绿僵菌制剂中各成分的有效配合、起到了协同增效作用，采用本发明金龟子绿僵菌制剂兑水喷雾，对稻水象甲的田间防效达到80%以上，该制剂具有良好抗紫外和润湿分散特性、润湿时间＜60s，且保持了长期储存中的生物活性，贮存时间可达12个月，非常适于规模化生产和大面积推广使用。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1 CQMa421菌株及经接种稻水象甲毒力驯化后对稻水象甲的毒力

将CQMa421菌株接种在1/4SDA平板上，28℃培养15天，收集成熟分生孢子，用0.05%（W/V）吐温-80分散，配制成终浓度为1×10⁷个孢子/ml的悬浮液。自野外采集稻水象甲成虫，转入培养有水稻苗的500ml三角瓶中，50只/瓶。采用喷雾塔（POTTER，UK）喷雾，接种3瓶，每瓶接种1.0 ml。接种后在室温28℃，湿度50-70%的生测室中。选择最先感病死亡的稻水象甲，放入28℃培养箱中保湿培养3-5天，使其昆虫表面生长出新鲜孢子，收集孢子；如上述接种稻水象甲17-19次进行驯化。在无菌条件下，用接种环挑取驯化后新鲜孢子在含有100微克/毫升氨苄青霉素的1/4SDA培养基平板上划线；将划线好的培养皿翻转放置于28℃恒温箱中培养；3-4日后挑选长出的典型而无杂菌的菌落，在菌落边缘用移菌针挑取带有菌丝的培养基一小块，转入试管斜面培养基中央，28℃恒温培养10-15天。驯化后的菌株按上述方法培养分生孢子，测定其对稻水象甲毒力。重复3次，记录死虫数，计算累计死亡率，用SPSS软件进行统计分析。

产孢量测定：取配制好CQMa421的孢子悬浮液100μl接种在1/4SDA平板上，在28℃温度的培养条件下培养15天，用直径为1cm 的打孔器随机打取5 个菌块，投入装有50ml 的0.05%（W/V）吐温-80的三角瓶中分散，利用血球计数板测定孢子浓度，计算单位面积上的产孢量（孢子数/ cm²）。以驯化前菌株为对照，设3次重复。用SPSS软件进行统计分析。

耐热特性测定：取配制好CQMa421的孢子悬浮液。分别在50℃下分别处理5小时，各取100μl 接种在1/4SDA平板上，在28℃温度下培养。设未热处理的分生孢子悬液为对照。每一处理设三个重复。24小时后，显微镜镜检，数200—300个孢子，记录萌发的孢子数，计算萌发率。以驯化前菌株为对照，设3次重复。用SPSS软件进行统计分析。

表1 CQMa421菌株经接种稻水象甲驯化后的毒力、产孢特性与耐热特性

注：p = 0.01水平上，相同字母表示差异不显著，不相同字母差异显著。

从可表1以看出，CQMa421能有效侵染稻水象甲，接种后8天， CQMa421菌株驯化前对稻水象甲的致死率为57.1%，LT₅₀（致死中时）为7.2天，CQMa421菌株驯化18次后对稻水象甲的杀虫活性显著增强，致死率达到100%，较驯化前提高42.9%，LT₅₀ 为3.2天，缩短55.6%。在1/4SDA平板上的产孢量、耐热性与驯化前无显著性差异，说明经稻水象甲驯化对菌株CQMa421产孢性与耐热性无影响。

实施例2 纳米碳化硅对绿僵菌保护作用

按表2将金龟子绿僵菌CQMa421纯孢子粉与纳米碳化硅先混合后，再加入40%硅藻土、5%CMC和不同含量的吐温-80、OP-10混匀。

紫外保护作用：将制剂试样用水分散配成浓度为1×10⁷孢子/mL的孢悬液后，取100μl孢子悬液涂布到1/4 SDA平板上，用玻璃推匀后在置于290-310nm紫外灯（978mW/m²）下垂直照射5小时，再置于28℃恒温箱中培养24h小时，测定萌发率（方法同上），重复3次。用SPSS软件对数据进行处理分析。

贮存实验：将制剂试样后在28℃下密封保存2个月，用水分散配成浓度为1×10⁷孢子/mL的孢悬液后，测定萌发率（方法同上）。重复3次，以4℃保存的绿僵菌纯孢子粉为对照，测定时用0.05%（W/V）的吐温-80溶液分散。用SPSS软件对数据进行处理分析。

表2 纳米碳化硅对绿僵菌保护作用

结果见表2，0.5-1%的纳米碳化硅对金龟子绿僵菌CQMa421孢子具有明显保护作用，在吐温-80和OP-10含量为3-5%时，贮存保存2个月后的孢子活性在90%以上，显著高于未加纳米碳化硅处理；也显著增加孢子抗紫外能力，为田间防效稳定性奠定基础。

实施例3 金龟子绿僵菌CQMa421可湿性粉剂配制及其润湿性、贮存期和防效。

按表3将金龟子绿僵菌CQMa421纯孢粉与纳米碳化硅先混合后，再加入不同含量硅藻土、CMC、吐温-80和OP-10。

湿润分散剂的湿润性测定：取标准水100mL注入250 mL烧杯。将此烧杯置于25℃±1℃的恒温水浴中，使其液面与水浴的水平面平齐。待硬水至25℃±1℃时，准确称取5.0g待测样品置于表面皿上，将全部试样从与烧杯口齐平的位置一次性均匀地倾倒在该烧杯的液面上，但不要过分地扰动液面。加试样时立即用秒表记时，直至试样全部润湿为止(留在液面上的细粉膜可忽略不计)。记下润湿时间(精确至秒)。如此重复5次，取其平均值，作为该样品的润湿时间。

贮存稳定性：将制剂在28℃下密封保存12个月。用水分散配成浓度为1×10⁷孢子/mL的孢悬液后按实施例2测定萌发百分率。

田间防效：选择稻水象甲发生水稻田块，在水稻移栽后5～7ｄ后，将制剂兑水分散成浓度为1×10⁷孢子/mL的孢悬液后叶面喷雾，施药量50L/亩。施药后15天，采用平行跳跃式取样，每小区调查10点20丛稻，统计虫口减退率和，重复3次，取其平均值，作为该样品的防效。

表3 金龟子绿僵菌CQMa421可湿性粉剂湿润分散特性、贮存期及防效

结果见表3。试验配方的润湿性良好，润湿时间在30 -60s 之间；贮存稳定，28℃下贮存12个月的孢子活性≥80%；田间对稻水象甲防效稳定，防效达到80%以上，能作为化学农药的替代农药。

Claims

1.金龟子绿僵菌CQMa421菌株在制备防治稻水象甲金龟子的药剂中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述防治稻水象甲的药剂由绿僵菌CQMa421干孢子粉44-60%、硅藻土30-40%、纳米碳化硅0.5-1%、羧甲基纤维素钠 3-5%、吐温-80 3-5%、和OP-10 3-5%组成，均以重量百分比。

3.一种金龟子绿僵菌制剂，其特征在于：它是由硅藻土30-40%、纳米碳化硅0.5-1%、羧甲基纤维素钠 3-5%、吐温-80 3-5%、OP-10 3-5%和绿僵菌CQMa421干孢子粉44-60%组成，均以重量百分比。

4.如权利要求3所述的金龟子绿僵菌制剂，其特征在于：所述吐温-80和OP-10为纯度>95%的吐温-80和OP-10；所述羧甲基纤维素钠为纯度大于95%；所述硅藻土为白色至浅褐色疏松粉末，纯度大于85%、含水量小于1%；所述纳米碳化硅的粒径小于50nm；所述绿僵菌CQMa421干孢子粉为纯孢子粉，含孢量≥150亿孢子/克、含水量≤5%；以上均以质量百分含量计。

5.如权利要求3或4所述金龟子绿僵菌制剂，其特征在于：它是由硅藻土35-40%、纳米碳化硅0.5-0.8%、羧甲基纤维素钠 3-5%、吐温-80 3-5%、OP-10 3-5%和绿僵菌CQMa421干孢子粉45-55%组成，均以重量百分比。

6.如权利要求3、4或5所述金龟子绿僵菌制剂，其特征在于：所述绿僵菌CQMa421干孢子粉为强毒力金龟子绿僵菌CQMa421孢子粉，所述强毒力金龟子绿僵菌CQMa421孢子粉由以下方法得到：将金龟子绿僵菌CQMa421接种于稻水象甲成虫，接种后在28℃、湿度50-70%的条件下饲养，将最先感病死亡的稻水象甲，放入28℃、湿度为50-70%培养箱中保湿培养3-5天，使其昆虫表面生长出新鲜孢子，如上所述循环接种18次得到驯化后的金龟子绿僵菌CQMa421新鲜孢子；在无菌条件下，用接种环挑取驯化后新鲜孢子在含有100微克/毫升氨苄青霉素的1/4SDA培养基平板上划线，将划线好的培养皿翻转放置于28℃恒温箱中培养；3-4日后挑选长出的典型而无杂菌的菌落，在菌落边缘用移菌针挑取带有菌丝的培养基一小块，转入试管斜面培养基中央，28℃恒温培养10-15天得到强毒力的金龟子绿僵菌CQMa421母种，将CQMa421菌株母种接种在1/4SDA平板上，28℃培养15天，收集成熟分生孢子制得绿僵菌CQMa421干孢子粉。

7.一种增强金龟子绿僵菌毒力的方法，其特征在于：将金龟子绿僵菌CQMa421接种稻水象甲成虫，接种后在28℃、湿度50-70%的条件下饲养，将最先感病死亡的稻水象甲，放入28℃、湿度为50-70%培养箱中保湿培养3-5天，使其昆虫表面生长出新鲜孢子，如上所述循环接种18次得到驯化后的金龟子绿僵菌CQMa421新鲜孢子；在无菌条件下，用接种环挑取驯化后新鲜孢子在含有100微克/毫升氨苄青霉素的1/4SDA培养基平板上划线，将划线好的培养皿翻转放置于28℃恒温箱中培养；3—4日后挑选长出的典型而无杂菌的菌落，在菌落边缘用移菌针挑取带有菌丝的培养基一小块，转入试管斜面培养基中央，28℃恒温培养10-15天得到强毒力的金龟子绿僵菌CQMa421母种。