CN106993631A - 一种刀孢轮枝菌可湿性粉剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及害虫生物防治技术领域，提供了一种刀孢轮枝菌可湿性粉剂，包括刀孢轮枝菌分生孢子纯孢粉10%，润湿剂1%；分散剂1%，紫外保护剂0.3%；孢子萌发促进剂0.1%；粘着剂0.05%；载体87.55%。本发明主要用于防治柑橘木虱和蚜虫，在室内条件下，分生孢子浓度为10⁸个/mL的可湿性粉剂用药后5 d，对柑橘木虱的校正死亡率为92.50%，对蚜虫的校正死亡率达100%。在温室条件下，分生孢子浓度为10⁸个/mL的可湿性粉剂用药后7 d，对柑橘木虱的校正死亡率达100%。本发明可湿性粉剂克服了化学农药所带来的环境污染、农药残留和害虫抗药性等问题，是一种环境友好型防治柑橘木虱和蚜虫的固体菌剂。

Description

一种刀孢轮枝菌可湿性粉剂及其应用

技术领域

本发明涉及害虫生物防治技术领域，更具体的，涉及一种刀孢轮枝菌可湿性粉剂及其应用。

背景技术

柑橘木虱、蚜虫等是柑橘上的重要害虫。这些害虫通常聚集在柑橘的枝梢、叶片或果实上通过吸食汁液危害，造成柑橘枝梢枯死、落叶和落果，并可产生分泌物而诱发煤烟病。此外，蚜虫还是柑橘衰退病毒、柑橘脉突病毒等病原物的自然传播媒介。而柑橘木虱则是当前柑橘生产上防治最难、威胁最大的毁灭性病害—柑橘黄龙病的唯一自然传播媒介。目前对于柑橘黄龙病、柑橘衰退病等病害缺乏理想的防治药剂，“治虫防病”通常是防控这些病害所采取的关键技术措施。目前对于这些害虫的防治仍以吡虫啉、毒死蜱等化学农药为主，然而化学农药的频繁使用带来的3R（抗性（Resistance）、再增猖獗（Resurgence）和残留（Residue））问题日趋严重。随着人们对生态环境、食品安全等问题的关注，研制安全高效的防治药剂并建立新的病虫害防控措施成为当前农业生产中一项紧迫的任务，也是涉及柑橘业可持续发展的重要课题。而生物农药因具有无残留、特异性强、不易产生抗药性、环境相容性好、生产工艺简单等特点越来越引起人们的重视。

在利用生防菌防治柑橘木虱、蚜虫等害虫的研究方面，国内外学者相继开展了一些有益的探索。其中已报道的对柑橘木虱具致病力的真菌有玫烟色拟青霉、柑橘霉炱菌等。已报道的对橘蚜等柑橘蚜虫有致病力的真菌有砖红镰孢菌等。但现有研究多集中在实验室探索阶段，市场上鲜见商品化的微生物农药产品可供使用。而我国对柑橘害虫生防菌的研究较少，特别是在柑橘木虱生防菌方面，我国除在上世纪80年代有零星报道外，近年来鲜有研究。

刀孢轮枝菌ZJLP09为本实验室从浙江台州地区的柑橘木虱虫体上分离的一株真菌，经致病性测定，确定该菌株较蜡蚧轮枝菌等对柑橘木虱具有更强的致病力，且对柑橘蚜虫具有强的侵染活性。通过对其生物学特性分析，确定该菌株对高温、低温、低湿和紫外线等具有更高的抗逆性，且其产孢量、孢子萌发率和产酶活性等均高于渐狭轮枝菌等菌株。以上研究结果表明，刀孢轮枝菌ZJLP09作为用于防治柑橘木虱、蚜虫等害虫的生防菌株，具有良好的开发和应用前景。

目前，国内外尚未有关于利用刀孢轮枝菌可湿性粉剂防治柑橘木虱和蚜虫的报道。为此，通过剂型的比较、辅料的筛选等制备出一种质量稳定、应用方便的刀孢轮枝菌可湿性粉剂，可为柑橘木虱和蚜虫等害虫的生物防治提供一种新的材料。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是弥补当前柑橘木虱和蚜虫等害虫防治中缺乏真菌生物制剂的不足，提供一种刀孢轮枝菌可湿性粉剂。

本发明的第二个目的是提供上述可湿性粉剂的制备方法。

本发明的第三个目的是提供上述可湿性粉剂在防治害虫方面的应用，具体地，提供上述可湿性粉剂在防治柑橘木虱和蚜虫中的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：

一种刀孢轮枝菌可湿性粉剂，包括以下各质量百分数的组分：刀孢轮枝菌分生孢子纯孢粉10%，润湿剂1%；分散剂1%，紫外保护剂0.3%；孢子萌发促进剂0.1%；粘着剂0.05%；载体87.55%。

本发明所述的刀孢轮枝菌为刀孢轮枝菌（Lecanicillium psalliotae）菌株ZJLP09（201310167685.4中已公开），于2013年4月26日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No. 7551。

优选地，本发明所述刀孢轮枝菌分生孢子纯孢粉含孢量为4~4.5×10¹¹个/g，活孢率为98.12~98.88%，含水量为4~4.3%。

优选地，本发明所述的润湿剂为W-2002，所述的分散剂为Dispwet WP-410，所述的紫外保护剂为抗坏血酸，所述的孢子萌发促进剂为氯化钙，所述的粘着剂为黄原胶，所述的载体为凹凸棒土。

所述可湿性粉剂的制备方法：上述优选的载体、润湿剂、分散剂、紫外保护剂、孢子萌发促进剂和粘着剂等按比例混合，再加入10%刀孢轮枝菌分生孢子粉，搅拌均匀，过325目标准筛，充分搅拌混匀即制得刀孢轮枝菌可湿性粉剂。

提供所述刀孢轮枝菌可湿性粉剂在柑橘木虱和蚜虫防治中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明的刀孢轮枝菌可湿性粉剂产品性能指标优良，含孢量为4.05×10¹⁰个/g，活孢率为93.65%，含水量为1.62%，润湿时间为78.50s，孢子悬浮率为86.78%，细度为98.56%，pH为6.80。

本发明的刀孢轮枝菌可湿性粉剂可用于防治柑橘木虱和蚜虫，在室内条件下，分生孢子浓度为10⁸个/mL的可湿性粉剂在用药后5 d，对柑橘木虱的校正死亡率为92.50%，对蚜虫的校正死亡率可达100%。在温室条件下，分生孢子浓度为10⁸个/mL的可湿性粉剂在用药后7 d，对柑橘木虱的校正死亡率可达100%。

本发明的刀孢轮枝菌可湿性粉剂克服了化学农药产生的环境污染、农药残留和害虫抗药性等问题，是一种高效、安全、环境友好的生防菌制剂，为柑橘木虱和蚜虫的生物防治提供了一种新的材料。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步具体描述。下述所使用的实验方法若无特殊说明，均为本技术领域现有的常规方法。所使用的的配料、试剂或材料，如无特殊说明，均为可通过商业途径得到的配料、试剂或材料。本发明不应限制于实施例范围。

实施例1：刀孢轮枝菌ZJLP09分生孢子纯孢粉的制备与质量测定

1. 一级固体培养

在超净工作台中以无菌接种针挑取冰箱保存的刀孢轮枝菌ZJLP09菌块，接种至马铃薯葡萄糖培养基（PDA，配方为：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL，自然pH）平板中，之后置于微生物培养箱中28 ℃恒温培养7 d。

2. 二级液体培养

以直径5mm的无菌打孔器在上述培养的刀孢轮枝菌ZJLP09菌落周围打取菌饼，接种到含沙氏葡萄糖酵母培养液（SDY，配方为：酵母浸出粉10 g，葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，蒸馏水1000 mL，pH 6.0）的三角瓶中（SDY培养液装液量为40%，每瓶接种3个菌饼），在28 ℃恒温摇床下以转速180 rpm/min震荡培养3 d。吸取上述培养的分生孢子悬浮液，以5%的接种量分别加入到各含沙氏葡萄糖酵母培养液的三角瓶中（SDY培养液装液量为40%），在28 ℃恒温摇床下以转速180 rpm/min震荡培养5 d。

3. 分生孢子粉的干燥制备

收集上述各三角瓶中刀孢轮枝菌ZJLP09震荡培养产物，以4层无菌纱布过滤除去菌丝体，将收集的滤液分装于各无菌的 50 mL离心管中，置于冷冻离心机中以转速12000 rpm/min 离心20 min，弃去上清液，收集分生孢子沉淀。以20%的脱脂奶粉溶液悬浮沉淀后，将分生孢子悬浮液置于超低温冰箱中预冷过夜，然后取出置于冷冻干燥机中冷冻24 h。在超净工作台中，将冷冻干燥产物置于高压灭菌后的研磨中，研磨粉碎，制备获得菌株ZJLP09的冻干孢子粉，将其分装于各无菌玻璃瓶中，置于冰箱保存备用。

4. 分生孢子粉质量指标测定

（1）含孢量测定：取 0.01 g 孢子粉于 1 mL 含 0.5% Tween-80 的无菌水试管中，涡旋振荡 5 min使孢子分散成均匀的悬液，将孢子悬液稀释后用血球计数板在显微镜下计数，重复 3 次，计算平均值。本实验中所用血球计数板规格为25格×16格，计数时只需计算双线计数区内四角的四个中格和中央一中格的孢子总数。含孢量计算方法见下列公式：含孢量（个/g）=5个中方格孢子总数/5×25×10×10³×稀释倍数×100。结果见表1。

（2）活孢率测定：吸取50 μL分生孢子悬浮液，与等量的孢子萌发液（配方为：20 g蔗糖，5 g蛋白胨，1mL吐温80，蒸馏水1000 mL）混匀，滴加到无菌玻片中央，然后将玻片置于培养皿中的U型玻璃棒上，培养皿底部铺有无菌滤纸，滴加2 mL无菌水至滤纸上保湿，然后将培养皿置于微生物培养箱中28 ℃恒温培养，每处理做3个重复。培养一段时间后，取出玻片，置于显微镜下随机计数200~300个孢子，以形成芽管或菌丝视为萌发，按照下列公式计算孢子萌发率：孢子萌发率（%）=计数区萌发的孢子数/计数区孢子总数×100。结果见表1。

（3）含水量测定：准确称取 0.1 g 孢子粉于已恒重的 9 cm 培养皿中，于 100℃的数显鼓风干燥箱中干燥至恒重，将孢子粉与器皿一起称重，计算孢子含水量。试验做 3个平行，取平均值。含水量计算方法见公式：含水量（%）=（恒重前皿孢总质量-恒重后皿孢总质量）/孢子总质量×100。结果见表1。

表1 刀孢轮枝菌ZJLP09分生孢子粉的质量指标

实施例2：刀孢轮枝菌ZJLP09可湿性粉剂载体和助剂的筛选

1. 载体的筛选

用于筛选的载体有高岭土、碳酸钙、滑石粉、膨润土、硅酸、硅藻土、白炭黑和凹凸棒土，均购自上海世泽生物科技有限公司。

（1）载体对孢子萌发的影响：将上述载体粉末按以5%（w/v）的比例与融化的PDA培养基混合，灭菌后制成平板。取0.1 mL 孢子浓度约为 10³个/mL 的菌株ZJLP09分生孢子悬浮液，涂布在含不同载体的各平板上。以不含载体的 PDA 平板为对照。每处理设置 3 个重复。将所有处理的平板置于 28 ℃下培养2-3 d。观察各平板长出的刀孢轮枝菌菌落形成单位数并计算孢子萌发率。

（2）载体对菌丝生长的影响：按上述方法制备含各种载体的平板。用直径5mm打孔器取培养7 d的刀孢轮枝菌边缘生长旺盛的菌丝块，接种到各培养基上，每处理设置3个重复，然后置于28 ℃恒温培养下培养，于培养不同时间测量各菌落的直径。

刀孢轮枝菌ZJLP09与各载体的生物相容性测定结果如表2所示。由表2可知，其中硅酸和凹凸棒土可促进菌株ZJLP09孢子萌发，培养2 d后菌落数分别可达117.33个和108.67个。二氧化硅和凹凸棒土可明显促进菌株ZJLP09的菌丝生长。综合考虑，选用凹凸棒土作为载体用于刀孢轮枝菌ZJLP09的可湿性粉剂制备。

表2 各载体与刀孢轮枝菌ZJLP09的生物相容性

注：同列中数字后面标注不同小写字母表示在P<0.05水平差异显著

2. 润湿剂筛选

用于筛选的润湿剂有：十二烷基硫酸钠SDS，为Amersco公司产品；十二烷基苯磺酸钠SDBS，为天津博迪化工股份有限公司产品；Morwet EFW、Morwet I、Petro AA和Berol 790A购自南京捷润科技有限公司；净洗剂LS和拉开粉BX，购自青岛优索化学科技有限公司；W-2001、W-2002和W-2005，为北京汉莫克化学技术有限公司产品。

（1）润湿力测定：将各润湿剂按1%、3%和 5% (w/w)的比例及刀孢轮枝菌分生孢子粉10%的比例加入凹凸棒土中，混合均匀，制成润湿剂含量不同但孢子含量相同的样品。准确称取样品0.1 g，从烧杯口齐平位置一次均匀倒进盛有100 mL 标准硬水的150 mL 烧杯液面上，加样品时立即用秒表记时，直至样品全部润湿为止，记下润湿时间，如此重复5 次，取平均值作为各样品的润湿时间。以不加润湿剂的样品作为对照。

（2）生物相容性测定：将各润湿剂粉末按 125 μg/mL、500 μg/mL 和 2000 μg/mL四种浓度的比例与融化的PDA培养基混合，高压灭菌后制成平板。取0.1 mL 浓度为10³个/mL的刀孢轮枝菌孢子悬浮液，涂布在含不同载体的各平板上。以不含润湿剂的 PDA 平板为对照。每处理设置 3个重复。将所有处理的平板置于 28 ℃下培养2-3 d。观察各平板长出的刀孢轮枝菌菌落形成单位数并计算孢子萌发率。按上述方法制备含各种载体的平板。用直径5 mm打孔器取培养7 d的刀孢轮枝菌边缘生长旺盛的菌丝块，接种到各培养基上，每处理设置3个重复，然后置于28 ℃恒温培养下培养，于培养不同时间测量各菌落的直径。

各润湿剂对菌株ZJLP09分生孢子的润湿效果如表3所示，与菌株ZJLP09的生物相容性如表4所示。由表3可知，在各润湿剂含量为1%时， W2002润湿力最强，润湿时间仅为8.47 s。由表4可知，在浓度为125 μg/mL时，添加润湿剂W-2002的平板上生长的菌落数可达135.67个，明显高于对照123.67个。添加润湿剂W-2002平板上的菌落直径为3.76 cm，高于对照的3.68 cm。综合考虑各润湿剂的润湿力及其生物相容性，选用在各方面表现都较为突出的W-2002作为润湿剂用于刀孢轮枝菌ZJLP09的可湿性粉剂制备。

表3 各润湿剂对刀孢轮枝菌ZJLP09分子孢子的润湿效果

注：同行中数字后面标注不同大写字母表示在P<0.05水平差异显著，同列中数字后面标注不同小写字母表示在P<0.05水平差异显著

表4 各润湿剂与刀孢轮枝菌ZJLP09的生物相容性

注：同行中数字后面标注不同大写字母表示在P<0.05水平差异显著，同列中数字后面标注不同小写字母表示在P<0.05水平差异显著

3. 分散剂筛选

用于筛选的分散剂为：萘磺酸盐分散剂D-1002、聚羧酸盐分散剂D-1003、可湿粉分散剂D-1005和改性烷基萘缩合物分散剂D-1006，购自北京汉莫克化学技术有限公司；甲基萘磺酸盐甲醛缩合物MF和亚甲基二萘磺酸钠NNO，购自青岛优索化学科技有限公司；脂肪醇与环氧乙烷缩合物IW，购自江苏省海安石油化工厂；木质素磺酸钙CL和木质素磺酸钠SL，购自上海世泽生物科技有限公司；Morwet D-425、Morwet D-500、Morwet D-110、Agrilan 700、Borresperse CA-SA、Borresperse NA、Ufoxane 3A、Ulerazine NA、Borresperse CA和Dispwet WP-410，均购自南京捷润科技有限公司。

（1）分散力测定：分散剂粗筛：将载体、润湿剂、孢子粉混合后，添加5%待选分散剂加工成样品，然后称0.05 g含1%的润湿剂的样品倒入盛有50 mL标准硬水的80 mL小烧杯中，目测样品的分散情况。粗筛分散情况分三个等级：优：在水中呈云雾状自动分散。无可见颗粒下沉。用“＋”表示。良：在水中自动分散，有颗粒下沉。下沉颗粒可慢慢分散或轻摇后分散。用“＋－”表示。劣：在水中不能自动分散，呈颗粒状下沉或絮凝状下沉，经强烈摇动后才能分散。用“－”表示。分散剂细筛：细筛以制剂有效成分的悬浮率为指标，操作步骤按 GB/T14825-2006 进行。以上操作每处理设置3个重复，孢子悬浮率计算方法见公式：孢子悬浮率（%）=（母液中孢子含量-下悬液中孢子含量）/母液中孢子含量×10/9×100。

（2）生物相容性测定：将各分散剂粉末按125 μg/mL、500 μg/mL和2000 μg/mL浓度的比例与融化的PDA培养基混合，灭菌后制成平板。取0.1 mL 浓度为 10³个/mL的刀孢轮枝菌孢子悬浮液，涂布在含不同载体的平板上。以不含分散剂的 PDA 平板为对照。每处理设3个重复。将处理的平板置于 28 ℃下培养2-3 d，观察各平板长出的刀孢轮枝菌菌落形成单位数并计算孢子萌发率。按上述方法制备含各种载体的平板，用直径5 mm的打孔器取培养7d的刀孢轮枝菌边缘生长旺盛的菌丝块，接种到各培养基上，每处理设置3个重复，然后置于28 ℃恒温培养下培养，于培养不同时间测量各菌落的直径。

各分散剂粗筛时的分散效果如表5所示，细筛时的分散效果如表6所示，各分散剂与菌株ZJLP09的生物相容性如表7所示。由表5可知，不同分散剂对对菌株ZJLP09分生孢子的分散效果存在明显差异。其中Dispwet WP-410的分散效果最好，样品在水中呈云雾状自动分散，无可见颗粒下沉。由表6可知，加入分散剂后可显著提高菌株ZJLP09分生孢子悬浮率。其中Dispwet WP-410的效果最佳，其孢子悬浮率可达88.85%。由表7可知，在添加量为125 μg/mL时，分散剂Dispwet WP-410、改性烷基萘缩合物D-1006和木质素磺酸钠SL对菌株的孢子萌发不产生影响。当浓度达到500 μg/mL时，Dispwet WP-410和改性烷基萘缩合物D-1006仍具有与对照相当的孢子萌发率。在浓度为125 μg/mL时，Dispwet WP-410、木质素磺酸钠SL和Ufoxane 3A对菌丝生长不产生抑制，其中当浓度达到500 μg/mL时，添加DispwetWP-410和Ufoxane 3A的平板上的菌落大小仍与对照相当。综合考虑各分散剂的分散效果及其与菌株ZJLP09的生物相容性，选用在各方面表现都较为突出的Dispwet WP-410作为分散剂用于刀孢轮枝菌ZJLP09的可湿性粉剂制备。

表5 各分散剂粗筛时的分散效果

表6 各分散剂加入后的分生孢子悬浮率

注：同列中数字后面标注不同小写字母表示在P<0.05水平差异显著

表7 各分散剂与刀孢轮枝菌ZJLP09的生物相容性

注：同行中数字后面标注不同大写字母表示在P<0.05水平差异显著，同列中数字后面标注不同小写字母表示在P<0.05水平差异显著

4. 紫外保护剂筛选

用于筛选的紫外保护剂有：抗坏血酸，为Sigma公司产品；核黄素，为Amersco公司产品；腐殖酸和荧光素钠，购自上海世泽生物科技有限公司；糊精、海藻酸钠、羧甲基纤维素钠和黄原胶，均购自青岛优索化学科技有限公司。

（1）保护效能测定：以无菌水稀释分生孢子悬浮液配制成浓度为10⁴个/mL的孢子悬浮液，然后将各种供试的紫外保护剂按0.3%比例加入孢子悬浮液中，混合均匀。用移液器吸取 0.1mL上述孢子悬浮液于无菌玻片上。然后将各盖玻片置于紫外灯（30 w，120 Lux）下20 cm处照射30 min 后，将玻片平放在培养皿中的U型玻璃棒上，培养皿中用湿润的无菌滤纸保湿。之后置于28 ℃下培养，在显微镜下抽样计数萌发孢子数并计算出萌发率。每处理设置3个重复，以不加紫外保护剂的刀孢轮枝菌孢子悬液作照射和不照射的对照处理。

（2）生物相容性测定：以无菌水稀释配制成浓度为10⁴个/mL的孢子悬浮液，将各供试紫外保护剂按0.3%比例加入孢子悬浮液中，混合均匀。用移液器吸取0.1mL上述孢子悬浮液于无菌盖玻片上。将玻片平放在培养皿中的U型玻璃棒上，培养皿中用湿润的无菌滤纸保湿。之后置于28 ℃下培养，在显微镜下计数萌发孢子数并计算萌发率。每处理设置3个重复，以不加紫外保护剂的刀孢轮枝菌孢子悬液不进行紫外照射作为对照。

各紫外保护剂对菌株ZJLP09的保护效能及生物相容性如表8所示。由表8可知，对菌株ZJLP09分生孢子的保护效能最佳的为抗坏血酸和核黄素，分别添加此两种保护剂的情况下，菌株ZJLP09的分生孢子经紫外照射30 min后的萌发率仍可达90.6%和88.45%。从添加紫外保护剂不进行紫外照射测定的孢子萌发率结果可知，各紫外保护剂均不会对菌株ZJLP09的孢子萌发产生明显影响，均具有较好的生物相容性。因此，综合考虑各紫外保护剂的保护效能及其与菌株ZJLP09的生物相容性，选用各方面表现都较为突出的抗坏血酸作为紫外保护剂用于刀孢轮枝菌ZJLP09的可湿性粉剂制备。

表8 各紫外保护剂对刀孢轮枝菌ZJLP09的保护效能及生物相容性

注：同列中数字后面标注不同小写字母表示在P<0.05水平差异显著

5. 孢子萌发促进剂筛选

用于筛选的孢子萌发促进剂有：硼酸，购自上海世泽生物科技有限公司；硫酸锌、氯化钙和氯化钾，均为Amersco公司产品。

将供试的孢子萌发促进剂分别按 0.1%、0.2%和 0.5%的比例加入到浓度为10⁴个/mL 的菌株ZJLP09孢子悬浮液中。取0.1 mL的母液滴加到无菌玻片上，将玻片平放在培养皿中的U型玻璃棒上，培养皿中用湿润的无菌滤纸保湿。之后将置于 28 ℃下培养，在显微镜下抽样计数萌发孢子数并计算出萌发率。每处理设3个重复，设不加促进剂的处理为对照。

不同萌发促进剂对分生孢子萌发的影响如表9所示。由表9可知，氯化钙和氯化钾均可显著提高菌株ZJLP09的分生孢子萌发率，在0.1%浓度下，其孢子萌发率分别可达94.33%和90.44%，均显著高于未加促进剂的对照的萌发率86.25%。因此，选用氯化钙作为孢子萌发促进剂用于刀孢轮枝菌ZJLP09的可湿性粉剂制备。

表9 各孢子萌发促进剂对菌株ZJLP09分生孢子萌发的影响

注：同行中数字后面标注不同大写字母表示在P<0.05水平差异显著，同列中数字后面标注不同小写字母表示在P<0.05水平差异显著

6. 粘着剂筛选

用于筛选的粘着剂有：黄原胶，购自青岛优索化学科技有限公司；蔗糖，Amersco公司产品；可溶性淀粉，Sigma公司产品。

（1）粘着力测定：将供试粘着剂按0.05%比例分别加入到浓度为10⁵个/mL 的孢子悬浮液中，用喷壶对柑橘叶片进行喷雾，直至滴水为止。4 h后取同一高度的叶子（用打孔器打成小圆片）在30 mL无菌水中研磨，取0.1 mL液体均匀涂布在PDA培养基上，置于28℃下培养2-3 d，观察各平板长出的刀孢轮枝菌菌落形成单位数并计算孢子萌发率。设不加粘着剂的处理为对照，每处理重复4次。

（2）生物相容性测定：将供试粘着剂按0.05%比例分别加入到浓度为10⁴个/mL 的孢子悬浮液中，取适量与孢子萌发液混合，用移液器吸取 0.1mL上述孢子悬浮液于无菌盖玻片上。将玻片平放在培养皿中的U型玻璃棒上，培养皿中用湿润的无菌滤纸保湿。之后将所有处理的平板置于 28 ℃下培养，在显微镜下抽样计数萌发孢子数并计算出萌发率。每处理设置3个重复，以不加粘着剂的孢子悬浮液为对照。

各粘着剂的粘着力及其与菌株ZJLP09的生物相容性如表10所示。由表10可知， 添加黄原胶的菌株ZJLP09的分生孢子悬浮液喷洒于柑橘叶片上后，在PDA培养基上生成的菌落个数为124.67个，显著高于不加粘着剂的对照，说明黄原胶可提高菌株ZJLP09分生孢子在柑橘叶片上的粘附能力。此3种粘着剂对菌株ZJLP09的分生孢子萌发均无显著影响。因此，选用黄原胶作为粘着剂用于刀孢轮枝菌ZJLP09的可湿性粉剂制备。

表10 各粘着剂的粘着力及与菌株ZJLP09的生物相容性

注：同列中数字后面标注不同小写字母表示在P<0.05水平差异显著

实施例3：刀孢轮枝菌ZJLP09可湿性粉剂的配制及质量指标测定

1. 刀孢轮枝菌ZJLP09可湿性粉剂的配制：经以上试验筛选出的载体、润湿剂、分散剂、紫外保护剂等按比例混合，搅拌均匀，再加入10%刀孢轮枝菌分生孢子粉，过325目标准筛，充分搅拌混匀即成刀孢轮枝菌分生孢子可湿性粉剂。

所制得的刀孢轮枝菌ZJLP09的分生孢子可湿性粉剂的配方为：有效成分为刀孢轮枝菌ZJLP09分生孢子粉，含量10%；润湿剂为W-2002，含量1%；分散剂为Dispwet WP-410，含量1%；紫外保护剂为抗坏血酸，含量0.3%；孢子萌发促进剂为氯化钙，含量0.1%；粘着剂为黄原胶，含量0.05%；载体为凹凸棒土，含量87.55%。

2. 刀孢轮枝菌ZJLP09可湿性粉剂的质量指标测定：

（1）含孢量测定：方法同实施例1。

（2）活孢率测定：方法同实施例1。

（3）含水量测定：方法同实施例1。

（4）润湿时间测定：按GB/T 5451-2001进行。

（5）悬浮率测定：按GB/T 14825-2006 进行。

（6）细度的测定：按GB/T 16150-1995 中“湿筛法”进行。

（7）pH值测定：按GB/T 1601-1993进行。

刀孢轮枝菌ZJLP09可湿性粉剂的质量指标测定结果如表11所示。由表11可知，所制得的分生孢子可湿性粉剂含孢量为4.05×10¹⁰个/g，活孢率为93.65%，含水量仅为1.62%，润湿时间为78.50s，孢子悬浮率为86.78%，细度98.56%过325目筛。所配制的可湿性粉剂的性能指标符合农药制剂产品要求。

表11刀孢轮枝菌ZJLP09分生孢子可湿性粉剂质量指标

实施例4：刀孢轮枝菌ZJLP09可湿性粉剂的防效测定

1. 室内毒力测定：将刀孢轮枝菌ZJLP09可湿性粉剂用蒸馏水稀释，装入小型喷壶中，采集柑橘木虱或蚜虫置于培养皿中，对其均匀喷雾，将处理后的昆虫放于玻璃容器中的九里香叶片上或蚕豆苗上，然后置于温度为28℃、光照为L:D=14:10的人工气候箱中培养，48h后在观察并计算死亡率。同时设立以10%吡虫啉处理为阳性对照，以无菌水处理为阴性对照。校正死亡率（%）=（处理死亡率-对照死亡率）/（1-对照死亡率）ch×100。

2. 温室防效测定：将刀孢轮枝菌ZJLP09可湿性粉剂用蒸馏水稀释，装入小型喷壶中，对饲养于温室条件下九里香植株上的柑橘木虱进行喷雾处理，同时设立以10%吡虫啉处理为阳性对照，以无菌水处理为阴性对照。处理3 d后观察计数柑橘木虱死亡虫数和总虫数，计算死亡率。

刀孢轮枝菌ZJLP09可湿性粉剂的室内毒力和温室防效结果如表12所示。由表12可知，刀孢轮枝菌ZJLP09分生孢子可湿性粉剂对柑橘木虱和蚜虫均表现出强的致病性，且致死率高于分生孢子悬浮液。在人工气候箱条件下，用药后5 d，分生孢子浓度为10⁸个/mL的可湿性粉剂对柑橘木虱的校正死亡率达90%以上，而对蚜虫的校正死亡率可达100%。在温室条件下的防效略低于人工气候箱，但分生孢子浓度为10⁸个/mL的制剂在用药后7 d对柑橘木虱的校正死亡率也可达100%。由此可知，刀孢轮枝菌ZJLP09分生孢子的剂型化有助于分生孢子药效的充分发挥，提高菌株对柑橘木虱和蚜虫的毒力。

表12 刀孢轮枝菌ZJLP09孢子制剂对柑橘木虱和蚜虫的室内毒力和温室防效

注：同列中数字后面标注不同小写字母表示在P<0.05水平差异显著。

Claims (5)

1.一种刀孢轮枝菌可湿性粉剂，其特征在于，包括以下质量百分数的组分：刀孢轮枝菌分生孢子纯孢粉10%，润湿剂1%，分散剂1%，紫外保护剂0.3%；孢子萌发促进剂0.1%；粘着剂0.05%；载体87.55%。

2. 根据权利要求1所述的刀孢轮枝菌可湿性粉剂，其特征在于，所述刀孢轮枝菌为刀孢轮枝菌（Lecanicillium psalliotae）菌株ZJLP09，于2013年4月26日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No. 7551。

3.根据权利要求1所述的刀孢轮枝菌可湿性粉剂，其特征在于，所述的刀孢轮枝菌分生孢子纯孢粉含孢量为4~4.5×10¹¹个/g，活孢率为98.12~98.88%，含水量为4~4.3%。

4. 根据权利要求1所述的刀孢轮枝菌可湿性粉剂，其特征在于，所述的润湿剂为W-2002，所述的分散剂为Dispwet WP-410，所述的紫外保护剂为抗坏血酸，所述的孢子萌发促进剂为氯化钙，所述的粘着剂为黄原胶，所述的载体为凹凸棒土。

5.权利要求1-4任一项所述的刀孢轮枝菌可湿性粉剂在柑橘木虱和蚜虫防治中的应用。