CN1723780A - 一种真菌孢子可湿性粉剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种生物学稳定的真菌孢子可湿性粉剂，其由杀虫真菌孢子粉和助剂组成，其中杀虫真菌孢子粉在可湿性粉剂中的重量百分比为50～75％；所述助剂包括载体、湿润分散剂和稳定保护剂；其中所述载体为白炭黑；所述湿润分散剂为选自月桂氮卓酮、脂肪醇与环氧乙烷缩合物、固体萘磺酸盐甲醛缩合物、甲基萘磺酸盐甲醛缩合物的一种或多种；所述稳定保护剂为选自羧甲基纤维素、变性淀粉、甲基纤维素、β－环糊精的一种或多种。本发明显著延长了产品的货架寿命，能够满足商业化生产的要求。

Description

一种真菌孢子可湿性粉剂

技术领域

本发明涉及一种真菌杀虫剂，具体地说涉及含杀虫真菌孢子的可湿性粉剂。

背景技术

由于化学农药的长期大量使用所造成的对环境和人类自身的危害日益突出，各国政府纷纷出台了限制或禁止使用化学农药的政策。生物农药由于具有高效、与环境友好和无污染等优点，因而是化学农药比较理想的替代产品。在自然界中昆虫病原微生物资源非常丰富，它是控制昆虫种群数量最重要的生物因子。在微生物导致的昆虫死亡中，病原真菌占60％以上。因此，研制和开发微生物杀虫剂特别是真菌杀虫剂受到国内外的广泛关注。

可湿性粉剂是一种最基本的农药剂型，可制成悬浊液，进行喷雾。它是用农药原粉加入一定量的润湿剂和填充料，通过机械碾磨、过筛制成。其规格要求99.5％的粉粒通过200号筛目，即粉粒直径应在7.4×10-5m以下。

中国专利CN02156519.8公开了一种真菌孢子可湿性粉剂。所述可湿性粉剂由乌洛托品0.3％-1.0％、木质素5％-15％、尿素0.3％-1.0％、碳酸钙3.0％-10％、拉开粉0.4％-0.8％和真菌孢子粉组成。所述粉剂能够在生产、储存、应用中保证孢子的生物活性和防治效果。但在该专利申请中并未提及所述粉剂的贮存期。

可湿性粉剂由于在加工、运输、贮藏、使用方便等诸多优点，因此在农药剂型中一直占有很大比例。但杀虫真菌可湿性粉剂研究方面进展缓慢。主要原因在于：杀虫真菌的有效成分是活体的真菌繁殖体孢子或营养体菌丝，在贮存过程中容易失去活力。因此在制剂加工中，不仅要提高其使用的便利性，更重要的是如何通过制剂保持孢子或菌丝的活力，延长产品的货架寿命。近年来，尽管国外已经有相应的产品注册，但产品的货架寿命仍不理想，国内外已报道的杀虫真菌可湿性粉剂在低温下的贮存期不超过12个月。

我国虽然在上个世纪90年代就进行过球孢白僵菌可湿性粉剂的研究，但也因贮存稳定性的问题，一直没有见到其产品登记注册。因此，研制生物学稳定的真菌杀虫剂制剂，延长其贮存稳定性和货架寿命，满足商品化生产的要求，是促进真菌杀虫剂产品产业化的瓶颈。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明人通过筛选与杀虫真菌生物学相容的助剂，即制剂中使用的载体、湿润剂、分散剂、稳定保护剂和紫外线吸收剂，优化制剂配方，最终研制出能够显著延长贮藏期和货架寿命的真菌孢子可湿性粉剂。

因此，本发明的目的在于提供一种真菌孢子可湿性粉剂，其生物稳定性较佳、贮存稳定性好、且含孢量较高。

根据本发明的一个目的，本发明提供一种生物学稳定的真菌孢子可湿性粉剂，其由杀虫真菌孢子粉和助剂组成，所述杀虫真菌孢子粉在可湿性粉剂中的重量百分比为50～75％；

所述助剂包括载体、湿润分散剂和稳定保护剂；

所述载体为白炭黑；

所述湿润分散剂为选自月桂氮卓酮、脂肪醇与环氧乙烷缩合物、固体萘磺酸盐甲醛缩合物、甲基萘磺酸盐甲醛缩合物的一种或多种；

所述稳定保护剂为选自羧甲基纤维素、变性淀粉、甲基纤维素、β-环糊精的一种或多种。

进一步的，在整个制剂中，载体的含量为10～15％重量，湿润分散剂的含量为5～20％重量、稳定保护剂的含量为3～15％重量。

所述载体可以为选自本领域常规的较稳定且惰性的生物农药载体，如白炭黑、高岭土、硅藻土以及腐植酸等。

在本发明中，所述载体优选为白炭黑，其可与本发明所用的真菌孢子生物相容。

本发明中所用的杀虫真菌孢子粉可以为任何可杀灭有害昆虫的真菌的孢子粉。

所述真菌通常可为丝孢类昆虫病原真菌。

更优选的，所述杀虫真菌孢子粉为选自白僵菌(Beauveria)、绿僵菌(Metarhizium)、拟青霉(Paecilomyces)、轮枝菌(Verticillium)、野村菌(Nomuraea)和被毛孢(Hirsutella)等的一种或多种丝孢类真菌的孢子粉。

最优选的，所述杀虫真菌孢子粉为白僵菌孢子粉。

在本发明的一个具体实施方式中，所用的孢子粉为球孢白僵菌孢子粉，然而本领域技术人员可以理解，上述种类的杀虫真菌具有相似的生物学性质，因此，本发明的可湿性粉剂的配方也适用于其它种类的杀虫真菌孢子。

本发明更优选的湿润分散剂为IW(脂肪醇与环氧乙烷缩合物)和月桂氮卓酮，二者比例为1∶1或1∶2，其与杀虫真菌孢子的生物学相容性更好。

本发明更优选的稳定保护剂为羧甲基纤维素和变性淀粉，两者的重量比为1∶1～10。

进一步的，所述真菌孢子可湿性粉剂中还可包含紫外线吸收剂，例如二氧化钛、尿素、叶酸、活性炭等，所使用的浓度通常为1％。

优选的紫外线吸收剂为二氧化钛。

本发明的制剂中还可以添加与真菌孢子生物学相容的其它助剂或增效剂，如本领域常用的增稠剂、防冻剂、渗透剂等。

优选的，所述真菌孢子可湿性粉剂中，各组分的重量百分比为：真菌孢子粉62～75％，白炭黑10～15％，月桂氮卓酮5～8％，IW(脂肪醇与环氧乙烷缩合物)3～5％，变性淀粉3～5％，羧甲基纤维素0.5～5％，二氧化钛1％。

最优选的，所述真菌孢子可湿性粉剂中，各组分的重量百分比为：真菌孢子粉73.5％，白炭黑10％，脂肪醇与环氧乙烷缩合物3.3％，月桂氮卓酮6.7％，羧甲基纤维素0.5％，变性淀粉5％，二氧化钛1％。

本发明的可湿性粉剂可参照本领域的常规制备方法制备得到。在本发明的一个具体实施方式中，先用载体对湿润分散剂按比例进行充分的吸附吸收，然后依次添加稳定保护剂，充分分散。将分散均匀的混合物再与真菌孢子粉充分混合，真空干燥使制剂含水量≤5％。

本发明所用的杀虫真菌孢子粉可通过市售购买得到，也可通过平板培养或固体发酵生产杀虫真菌孢子，分离孢子粉，干燥(含水量≤5％)，含孢量≥1.0×10¹¹个/克)。

本发明所述可湿性粉剂的使用方法是将所述粉剂兑水喷雾，在田地中进行施用，具体使用量可根据实际情况进行调整，通常为5-20克/亩。

本发明对5种不同的湿润剂和分散剂月桂氮卓酮(1-十二烷基-六氢-2H-氮杂卓-2-酮)、IW(脂肪醇与环氧乙烷缩合物)、固体NNO(萘磺酸盐甲醛缩合物)、SDS(十二烷基磺酸钠)和MF(甲基萘磺酸盐甲醛缩合物)进行了筛选。在本发明的一个具体实施方案中，IW(脂肪醇与环氧乙烷缩合物)和月桂氮卓酮(1-十二烷基-六氢-2H-氮杂卓-2-酮)对球孢白僵菌孢子的萌发和菌丝生长都没有明显影响，具有良好的生物学相容性。

杀虫真菌孢子在贮藏过程中会有一定程度的代谢活动并积累一定量的代谢产物，通过选择合适的保护剂来吸附或吸收这些对孢子可能有害的代谢产物，对孢子起一定的保护作用。本发明选择了4种不同的稳定保护剂：羧甲基纤维素，变性淀粉，甲基纤维素和β-环糊精。在一个具体实施方案中，4种稳定保护剂对球孢白僵菌孢子萌发和菌丝生长都有不同程度的促进作用；在5.5％的比例水平上，变性淀粉与羧甲基纤维素对球孢白僵菌孢子的贮藏稳定性具有显著的保护作用，能够显著提高孢子的活力。

以活体微生物为主要有效成分的生物杀虫剂施用于田间后，日光中的紫外线是影响其活力的重要因素。一般情况下在几十个小时内就完全失去活力。在制剂中加入一定量的抗紫外线吸收剂是必要的。本发明选择了3种紫外线吸收剂：抗坏血酸、二氧化钛和氧化锌。在其中一个实施方案中，3种紫外线吸收剂在1％浓度水平上对球孢白僵菌孢子的萌发有不同程度的促进作用；在对球孢白僵菌菌丝生长的影响方面，氧化锌能促进菌丝的生长，二氧化钛与抗坏血酸有一定的抑制作用；在1～0.1％范围内，二氧化钛对球孢白僵菌孢子的抗紫外线保护能力要显著优于氧化锌和抗坏血酸。

通过上述筛选得到与杀虫真菌生物学相容的载体为白炭黑，湿润分散剂为月桂氮卓酮和IW，稳定保护剂为变性淀粉和羧甲基纤维素，抗紫外线吸收剂为二氧化钛。通过制剂配方的优化和15℃贮藏试验，得到一个稳定性较好的配方：以重量百分比计，真菌孢子粉73.5％；白炭黑(TB-2型)10％；IW(脂肪醇与环氧乙烷缩合物)3.3％；月桂氮卓酮(1-十二烷基-六氢-2H-氮杂卓-2-酮)6.7％；羧甲基纤维素0.5％；变性淀粉5％；二氧化钛1％。

本发明的优点在于：

1、制剂含孢量高，大于50％，而国内外已报道的杀虫真菌可湿性粉剂的含孢量小于50％；

2、贮存稳定性好，在15℃下稳定贮存18个月，活孢率仍在70％以上。

为了更好地理解本发明的本质，下面结合附图，通过对本发明较佳实施方式的描述，详细说明但不限制本发明。

发明的具体实施方式

本发明所用的试验材料如无特别说明均为市售购买产品。

本发明所用真菌孢子粉可通过市售购买得到，或者通过平板培养或固体发酵，经过产孢、收集、干燥(含水量≤5％，含孢量≥1.0×10¹¹个/克)后备用。市售孢子粉包括国内真菌高孢粉生产厂家(如湖北当阳白僵菌厂生产的白僵菌高孢粉)，高孢粉标准是含水量＜10％，含孢量＞1000亿/克。

                  真菌孢子可湿性粉剂的配方筛选

【实施例1】生物学相容的载体筛选

本发明中选择性能比较稳定的惰性载体一白炭黑(TB-2型)作为制剂的载体。白炭黑质地很轻，具有很强的吸附性能，而且自身有较好的水溶性，被国内外视为比较理想的生物农药载体。本实施例中对白炭黑(TB-2型)与球孢白僵菌生物相容性进行检测。

一、试验方法

(一)白炭黑对球孢白僵菌孢子萌发的影响

将孢子粉与白炭黑(TB-2型)按一定比例配成孢子悬浮液，浓度为1.0％(重量体积比)，孢子浓度为1.0×10⁶个/mL。取100μL孢子悬浮液均匀涂布于1/4SDAY(以重量体积比计，葡萄糖1％，酵母膏0.25％，蛋白胨0.25％，琼脂粉1.2％)平板上，26℃暗培养24hr后显微镜下检测孢子的萌发率。孢子形成芽管的长度大于孢子直径为孢子萌发的标准。采用随机视野观察100个孢子计数萌发的孢子，重复3次。以纯孢子粉的萌发率为对照。用EXCEL和SPSS软件对数据进行处理分析。相对萌发率计算方法如下：

注：萌发率A为孢子在一定浓度的被检测物质中的萌发率。

(二)白炭黑对球孢白僵菌菌丝生长的影响

将白炭黑(TB-2型)按1％(重量体积比)的比例加入1/4 SDAY(以重量体积比计，葡萄糖1％，酵母膏0.25％，蛋白胨0.25％，琼脂粉1.2％)培养基中制成平板。用0.05％的Tween-80配成浓度为1.0×10⁷个/mL的悬浮液。取100μL孢子悬浮液均匀涂布于1/4 SDAY平板上，26℃暗培养。48hr后，用直径为1.0cm的打孔器打取菌苔连同琼脂块倒置接种于含有1％白炭黑的1/4SDAY平板上，26℃暗培养。每天采用十字交叉法测量菌落直径，共测量5次。以不含白炭黑的平板为对照。每个处理设3个重复。用EXCEL和SPSS软件对数据进行处理分析。相对生长速率计算方法如下：

注：生长速率A为菌丝在含有被检测物质的培养基上的生长速率。

二、试验结果

结果见表1。结果表明：白炭黑在1％浓度下对球孢白僵菌孢子萌发和菌丝生长均没显著的影响，与球孢白僵菌具有良好的生物学相容性。

表1白炭黑载体对球孢白僵菌孢子萌发和菌丝生长的影响

载体	孢子相对萌发率	菌丝相对生长速率
			对照	1.00±0.00	1.00±0.00
白炭黑	0.99±0.03	1.02±0.01
			F test	F＝16.78，P＞0.05	F＝0.21，P＞0.05

【实施例2】生物学相容的湿润剂和分散剂筛选

在湿润分散剂的筛选过程中，除了要求对孢子具有良好的湿润分散性能外，由于湿润剂与分散剂在使用过程中与孢子直接接触，会破坏孢子表面的疏水结构，对孢子可能造成一定的损伤。所以制剂中所使用的湿润剂与分散剂不但要有很好的湿润分散性，而且必须与孢子具有很好的生物相容性(不抑制孢子的萌发和菌丝的生长)，尽量减少对孢子的损伤和避免在使用过程中影响制剂的杀虫效果。本步骤中对5种不同的湿润分散剂月桂氮卓酮(1-十二烷基-六氢-2H-氮杂卓-2-酮)、IW(脂肪醇与环氧乙烷缩合物)、固体NNO(萘磺酸盐甲醛缩合物)、SDS(十二烷基磺酸钠)和MF(甲基萘磺酸盐甲醛缩合物)进行了筛选。

一、生物相容性测定

(一)试验方法

1、湿润分散剂对孢子萌发的影响

将球孢白僵菌孢子粉与湿润分散剂按一定比例配成孢子悬浮液，各湿润分散剂的浓度均为1.0％(重量体积比)，孢子浓度为1.0×10⁶个/mL。取100μL孢子悬浮液均匀涂布于1/4 SDAY(以重量体积比计，葡萄糖1％，酵母膏0.25％，蛋白胨0.25％，琼脂粉1.2％)平板上，26℃暗培养24hr后显微镜下检测孢子的萌发率。孢子形成芽管的长度大于孢子直径为孢子萌发的标准。采用随机视野观察100个孢子计数萌发的孢子。以不含湿润分散剂的平板检测设为对照。每个处理重复3次。用EXCEL和SPSS软件对数据进行处理分析。相对萌发率计算方法如下：

注：萌发率A为孢子在一定浓度的被检测物质中的萌发率。

2、湿润分散剂对菌丝生长的影响

将湿润分散剂按1％(重量体积比)的比例加入1/4 SDAY(以重量体积比计，葡萄糖1％，酵母膏0.25％，蛋白胨0.25％，琼脂粉1.2％)培养基中制成含有待检测湿润分散剂的平板。用0.05％的Tween-80配成浓度为1.0×10⁷个/mL的悬浮液。取100μL孢子悬浮液均匀涂布于1/4 SDAY平板上，26℃暗培养。48hr后，用直径为1.0cm的打孔器打取菌苔连同琼脂块倒置接种于含有待检测湿润分散剂的平板上，26℃暗培养，每天采用十字交叉法测量菌落直径，共测量5次。每个处理设3个重复。用EXCEL和SPSS软件对数据进行处理分析。相对生长速率计算方法如下：

注：生长速率A为菌丝在含有被检测物质的培养基上的生长速率。

(二)试验结果

结果见表2。从试验结果可以看出，各湿润分散剂之间对球孢白僵菌孢子的萌发和菌丝生长的影响都有显著的差异(F_5，12＝2926.80，P＜0.05和F_5，12＝558.09，P＜0.05)。1％浓度下的SDS(十二烷基磺酸钠)和MF(甲基萘磺酸盐甲醛缩合物)对球孢白僵菌孢子的萌发和菌丝生长都有显著的抑制作用，其中SDS(十二烷基磺酸钠)几乎完全抑制了孢子的萌发和菌丝的生长；在相同浓度下IW(脂肪醇与环氧乙烷缩合物)和月桂氮卓酮(1-十二烷基-六氢-2H-氮杂卓-2-酮)与对照没有显著差异，说明二者与孢子具有相对较好的生物学相容性。

表2湿润分散剂对球孢白僵菌孢子萌发和菌丝生长的影响

湿润分散剂	相对萌发率±标准差	相对生长速率±标准差
			对照	1.00±0.00  c	1.00±0.00  c
IW	1.00±0.01  c	0.99±0.02  c
			SDS	0.05±0.02  a	0           a
MF	0.95±0.01  b	0.57±0.05  b
			固体NNO	0.98±0.02  bc	0.69±0.04  b
月桂氮卓酮	1.00±0.02  bc	0.96±0.02  c
			F test	F5，12＝2926.80 p＜0.05	F5，12＝558.09 p＜0.05

注：IW为脂肪醇与环氧乙烷缩合物；SDS为十二烷基磺酸钠；MF为甲基萘磺酸盐甲醛缩合物；固体NNO为萘磺酸盐甲醛缩合物；月桂氮卓酮为1-十二烷基-六氢-2H-氮杂卓-2-酮；数值后的小写字母表示差异显著性分析，同一列内含有相同字母表示差异不显著(Dunnett C，p＜0.05)

二、湿润分散剂对孢子湿润分散能力的测定

由于白僵菌孢子的表面是极度疏水，应该形成O/W型悬浮液，本发明选择步骤2.1中筛选的2种与白僵菌生物学相容的湿润分散剂IW(脂肪醇与环氧乙烷缩合物)与月桂氮卓酮(1-十二烷基-六氢-2H-氮杂卓-2-酮)进行不同配比优化，测定湿润性和分散性。IW(脂肪醇与环氧乙烷缩合物)与月桂氮卓酮(1-十二烷基-六氢-2H-氮杂卓-2-酮)之间的配比设定为1∶1，1∶2，2∶1三个水平。将孢子粉、白炭黑载体与湿润分散剂按照8∶1∶1的比例分散均匀，为待测样品，以不加湿润分散剂的样品为对照。

(一)试验方法

湿润分散剂的湿润性测定方法如下：向烧杯(250mL，内径为6.5±0.5cm)中加入100±1mL标准水。将待测样品准确称取0.5g，从杯口位置一次倒入水中，同时启动秒表计时，直至完全湿润，记录完全湿润时间。重复3次，取3次平均值作为各样品的湿润时间。

分散性测定方法如下：将待测样品准确称取0.25g倒入装有一定量的标准水的烧杯中，用玻棒搅拌均匀后，转移到具塞量筒中，水浴至30±1℃，并用同样温度的标准水补充到250mL，插上塞子。将量筒在1min内颠倒30次(上下颠倒180度再回到原位置为1次)。将量筒垂直放在水浴中，不能有振动，无直射日光。打开塞子取出100μL悬浮液，用血球计数板检测悬浮液的孢子浓度。30min后，用注射器在10-15s内吸出225mL悬浮液，测定剩余的悬浮液中的孢子浓度。重复3次。悬浮率的计算方法如下：

注：a为制剂所配悬浮液的初始孢子数；b为抽去225mL后量筒中所剩余的制剂悬浮液的孢子数。

(二)试验结果

结果见表3。检测结果表明：IW(脂肪醇与环氧乙烷缩合物)与月桂氮卓酮(1-十二烷基-六氢-2H-氮杂卓-2-酮)的不同配比对球孢白僵菌孢子的湿润性有显著差异，其中质量配比为1∶2的配方湿润时间最短，质量配比为1∶1次之，质量配比为2∶1所用湿润时间最长；在悬浮率方面，3个配方没有显著差异，都在90％以上。

        表3湿润分散剂对球孢白僵菌孢子的湿润与分散性

编号	湿润时间(秒)	悬浮率(％)
			1	342±7.00   b	91.47±4.97  a
2	248±17.24  a	94.68±4.13  a
			3	937±22.55  c	92.88±0.89  a
F test	F＝1470.60，P＜0.05	F＝0.57，P＞0.05

注：编号1，2，3分别指IW(脂肪醇与环氧乙烷缩合物)与月桂氮卓酮(1-十二烷基-六氢-2H-氮杂卓-2-酮)之间质量配比的1∶1，1∶2，2∶1三个水平数值后的小写字母表示差异显著性分析，同一列内含有相同字母表示差异不显著(Duccan，p＜0.05)

【实施例3】生物学相容的稳定保护剂筛选

孢子在贮藏过程中会有一定程度的代谢活动并积累一定量的代谢产物，在制剂中加入合适的稳定保护剂来吸附或吸收这些对孢子可能有害的代谢产物，对孢子起一定的保护作用。本实施方案中，对4种不同的稳定保护剂：羧甲基纤维素，变性淀粉，甲基纤维素，β-环糊精，筛选了对球孢白僵菌生物相容性好和对孢子贮藏活力保护作用明显的高分子材料。

一、稳定保护剂与球孢白僵菌的生物相容性测定

(一)试验方法

1、稳定保护剂对孢子萌发的影响

将孢子粉与稳定保护剂按一定比例配成孢子悬浮液，各稳定保护剂的浓度均为1.0％(重量体积比)，孢子浓度为1.0×10⁶个/mL。取100μL孢子悬浮液均匀涂布于1/4 SDAY(以重量体积比计，葡萄糖1％，酵母膏0.25％，蛋白胨0.25％，琼脂粉1.2％)平板上，26℃暗培养，24hr后显微镜下检测孢子的萌发率。以不含保护剂的孢子悬液为对照。孢子形成芽管的长度大于孢子直径为孢子萌发的标准。采用随机视野观察100个孢子计数萌发的孢子，重复3次。用EXCEL和SPSS软件对数据进行处理分析。相对萌发率计算方法如下：

注：萌发率A为孢子在一定浓度的被检测物质中的萌发率。

2、稳定保护剂对菌丝生长的影响

将稳定保护剂按1％(重量体积比)的比例加入1/4 SDAY(以重量体积比计，葡萄糖1％，酵母膏0.25％，蛋白胨0.25％，琼脂粉1.2％)培养基中制成含有待检测稳定保护剂的平板。用0.05％的Tween-80配成浓度为1.0×10⁷个/mL的悬浮液。取100μL孢子悬浮液均匀涂布于1/4 SDAY平板上，26℃暗培养。48hr后，用直径为1.0cm的打孔器打取菌苔连同琼脂块倒置接种于含有待检测稳定保护剂的平板上，26℃暗培养，每天采用十字交叉法测量菌落直径，共测量5次。每个处理设3个重复。用EXCEL和SPSS软件对数据进行处理分析。相对生长速率计算方法如下：

注：生长速率A为菌丝在含有被检测物质的培养基上的生长速率。

(二)试验结果

试验结果见表4。结果表明，所筛选的4种稳定保护剂对球孢白僵菌孢子萌发和菌丝生长都有不同程度的促进作用，表现出良好的生物学相容性。

表4稳定保护剂对球孢白僵菌孢子萌发和菌丝生长的影响

稳定保护剂	相对萌发率±标准差	相对生长速率±标准差
			对照	1.00±0.00  a	1.00±0.00  a
甲基纤维素	1.01±0.05  a	1.07±0.02  c
			羧甲基纤维素	1.08±0.03  b	1.04±0.02  b
变性淀粉	1.08±0.02  b	1.05±0.01  b
			β-环糊精	1.11±0.02  b	1.23±0.01  d
F test	F10，4＝8.34p＜0.05	F10，4＝125.68p＜0.05

注：数值后的小写字母表示差异显著性分析，同一列内含有相同字母表示差异不显著(Duccan，p＜0.05)

二、稳定保护剂对孢子贮藏活力的保护作用

(一)试验方法

稳定保护剂与载体白炭黑和孢子粉按一定比例混合均匀后，装入离心管中密封保存于25℃下，以不加稳定保护剂的处理为对照，6个月后取样进行孢子活力测定。贮藏保护效能指数计算方法如下：

(二)试验结果

贮藏试验结果见表5。结果表明：不同的稳定保护剂以及同一种稳定保护剂的不同浓度之间对球孢白僵菌孢子的贮藏稳定性有不同的影响。其中，在比例为5.5％水平上，变性淀粉与羧甲基纤维素对球孢白僵菌孢子的贮藏稳定性具有显著的保护作用，并且优于其它2种保护剂。

                表5稳定保护剂对孢子贮藏活力的保护作用

稳定剂	保护效能指数			F test
					11.1％	8.8％	5.5％
	甲基纤维素	0.06±0.04b	0.01±0.03b					0.05±0.07a	F＝0.07，p＞0.05

羧甲基纤维素	-0.35±0.08a	0.01±0.03b	0.29±0.05b	F＝88.55，p＜0.05
					变性淀粉	-0.13±0.05c	-0.16±0.03a	0.22±0.08b	F＝35.44，p＜0.05
β-环糊精	-0.15±0.06b	-0.22±0.06a	0.05±0.03a	F＝20.76，p＜0.05
					F test	F3，8＝22.60p＜0.05	F3，8＝23.15p＜0.05	F3，8＝11.21p＜0.05

注：数值后的小写字母表示差异显著性分析，同一列内含有相同字母表示差异不显著(Duccan，p＜0.05)；保护效能指数为负值表示没有保护作用。

【实施例4】紫外线吸收剂的筛选

以活体微生物为主要有效成分的生物杀虫剂施用于田间后，日光中的紫外线是影响其活力的重要因素，一般情况下在几十个小时内就完全失去活力。因此，在制剂中加入一定量的抗紫外线吸收剂是必要的。本实施方案中，对紫外线吸收剂抗坏血酸、二氧化钛和氧化锌进行筛选。

一、生物学相容性测定

(一)试验方法

1、紫外线吸收剂对球孢白僵菌孢子萌发的影响

将球孢白僵菌孢子用0.05％Tween-80配成孢子悬浮液，然后将各紫外线吸收剂分别加入孢子悬浮液中，并调整浓度，使各保护剂的浓度均为1％(重量体积比)，孢子浓度为1.0×10⁷个/mL。取100μL孢子悬浮液均匀涂布于1/4SDAY(以重量体积比计，葡萄糖1％，酵母膏0.25％，蛋白胨0.25％，琼脂粉1.2％)平板上，26℃暗培养24hr后显微镜下检测孢子的萌发率。以不加紫外线吸收剂的孢子悬液为对照。孢子形成芽管的长度大于孢子直径为孢子萌发的标准。采用随机视野观察100个孢子计数萌发的孢子。重复3次。用SPSS软件对数据进行处理分析。相对萌发率的计算方法如下：

注：萌发率A为孢子在一定浓度的被检测物质中的萌发率。

2、紫外线吸收剂对球孢白僵菌菌丝生长的影响

将紫外线吸收剂按1％(重量体积比)的比例加入1/4 SDAY(以重量体积比计，葡萄糖1％，酵母膏0.25％，蛋白胨0.25％，琼脂粉1.2％)培养基中制成含有待检测紫外线吸收剂的平板。用0.05％的Tween-80配成浓度为1.0×10⁷个/mL的悬浮液。取100μL孢子悬浮液均匀涂布于1/4 SDAY平板上，26℃暗培养。48hr后，用直径为1.0cm的打孔器打取菌苔连同琼脂块倒置接种于含有待检测湿润分散剂的平板上，26℃暗培养，每天采用十字交叉法测量菌落直径，共测量5次。每个处理设3个重复。用EXCEL和SPSS软件对数据进行处理分析。相对生长速率计算方法如下：

注：A为菌丝在含有被检测物质的培养基上的生长速率。

(二)试验结果

生物相容性试验结果见表6。结果表明：3种紫外线吸收剂在1％浓度水平上对球孢白僵菌孢子的萌发有不同程度的促进作用；在对球孢白僵菌菌丝生长的影响方面，氧化锌能促进菌丝的生长，二氧化钛与抗坏血酸有一定的抑制作用。

       表6紫外线吸收剂对球孢白僵菌孢子萌发和菌丝生的影响

紫外线吸收剂	相对萌发率±标准差	相对生长速率±标准差
			对照	1.00±0.00  a	1.00±0.00  c
二氧化钛	1.08±0.02  c	0.94±0.01  b
			氧化锌	1.05±0.04  bc	1.30±0.03  d
抗坏血酸	1.03±0.01  ab	0.86±0.02  a
			F test	F8，3＝8.60，P＜0.05	F8，3＝308.23，P＜0.05

注：数值后的小写字母表示差异显著性分析，同一列内含有相同字母表示差异不显著(Duccan，p＜0.05)

二、保护效能测定

(一)试验方法

将球孢白僵菌孢子用0.05％Tween-80配成孢子悬浮液，然后将各紫外线吸收剂分别加入孢子悬浮液中，并分别调整到浓度为1％，0.5％，0.1％(重量体积比)，孢子浓度为1.0×10⁷个/mL。取50μL涂布于无菌的盖玻片上，每处理设3个重复，置于净化工作台上自然风干后，用紫外灯(8W，30cm)照射10min。然后将照射后的盖玻片放入装有10mL液体SDY(葡萄糖4％，酵母膏1％，蛋白胨1％；重量体积比)培养基的三角瓶中摇床暗培养(180r/min，26℃)。24hr后，显微镜下检测孢子的萌发率。计算保护效能指数，计算方法如下：

(二)试验结果

试验结果见表7。结果表明，在0.1～1％水平上二氧化钛对球孢白僵菌孢子的抗紫外线保护能力要显著优于氧化锌和抗坏血酸。

                       表7不同紫外线吸收剂对孢子的保护作用

紫外线吸收剂	保护效能指数			F test
					1％	0.5％	0.1％
	二氧化钛	0.58±0.04a	0.45±0.08a					0.23±0.07a	22.0(＜0.05)
氧化锌				0.16±0.02b	0.13±0.05b	0.08±0.07bc	2.3(＞0.05)
	抗坏血酸	0.21±0.23c	0.10±0.06b					0.09±0.02ab	4.5(＞0.05)
F test				F2，2＝55.1P＜0.05	F2，2＝29.6P＜0.05	F2，2＝7.4P＜0.05

注：数值后的小写字母表示差异显著性分析，同一列内含有相同字母表示差异不显著(Duccan，p＜0.05)

根据实施例1，选择白炭黑作为载体，在制剂中的比例为10～15％；根据实施例2，选择IW(脂肪醇与环氧乙烷缩合物)与月桂氮卓酮(1-十二烷基-六氢-2H-氮杂卓-2-酮)作为制剂的湿润剂和分散剂，二者比例为1∶1或1∶2，在制剂中的总比例为10％左右；根据实施例3，选择羧甲基纤维素和变性淀粉作为制剂的稳定保护剂，在制剂中的比例为5％左右；根据实施例4，选择二氧化钛作为紫外线吸收剂，在制剂中的比例为1％。

                   真菌孢子可湿性粉剂的制备

【实施例5】球孢白僵菌孢子可湿性粉剂的制备

一、配方

组分                           含量(重量％)

球孢白僵菌孢子粉                  73.5％

白炭黑                            10％

IW                                3.3％

月桂氮卓酮                        6.7％

羧甲基纤维素                      0.5％

变性淀粉                          5％

二氧化钛                          1％

二、制备方法

先用载体白炭黑对湿润分散剂按比例进行充分的吸附吸收，然后依次添加稳定保护剂，充分分散。将分散均匀的混合物再与孢子粉充分混合，真空干燥使制剂含水量≤5％。

所用球孢白僵菌孢子粉可由市售购买得到，也可由球孢白僵菌通过行平板培养或固体发酵，经过产孢、收集、干燥(含水量≤5％，含孢量≥1.0×10¹¹个/克)后备用。

【实施例6】球孢白僵菌孢子可湿性粉剂的制备

一、配方

组分                        含量(重量％)

球孢白僵菌孢子粉                65％

白炭黑                          15％

IW                              4.5％

月桂氮卓酮                      7.7％

羧甲基纤维素                    4.5％

变性淀粉                        3％

二氧化钛                        1％

二、制备方法

参见实施例5。

【实施例7】球孢白僵菌孢子可湿性粉剂的制备

一、配方

组分                        含量(重量％)

球孢白僵菌孢子粉                70％

白炭黑                          12％

IW                              4％

月桂氮卓酮                      6％

羧甲基纤维素                    3％

变性淀粉                        4％

二氧化钛                        1％

二、制备方法

参见实施例5。

【实施例8】球孢白僵菌孢子可湿性粉剂的制备

组分                        含量(重量％)

球孢白僵菌孢子粉                55％

白炭黑                          22％

IW                              5％

月桂氮卓酮                      8％

羧甲基纤维素                    3％

变性淀粉                        5％

二氧化钛                        2％

二、制备方法

参见实施例5。

【实施例9】金龟子绿僵菌孢子可湿性粉剂的制备

组分                        含量(重量％)

金龟子绿僵菌孢子粉              70％

白炭黑                          15％

IW                              4％

月桂氮卓酮                      6％

羧甲基纤维素                    1％

变性淀粉                        3％

二氧化钛                          1％

二、制备方法

先用载体白炭黑对湿润分散剂按比例进行充分的吸附吸收，然后依次添加稳定保护剂，充分分散。将分散均匀的混合物再与孢子粉充分混合，真空干燥使制剂含水量≤5％。

所用金龟子绿僵菌孢子粉可由金龟子绿僵菌通过行平板培养或固体发酵，经过产孢、收集、干燥(含水量≤5％，含孢量≥5.0×10⁹个/克)后备用。

【实施例10】蜡蚧轮枝菌孢子可湿性粉剂的制备

组分                          含量(重量％)

蜡蚧轮枝菌孢子粉                  65％

白炭黑                            15％

IW                                5％

月桂氮卓酮                        8％

羧甲基纤维素                      1％

变性淀粉                          5％

二氧化钛                          1％

二、制备方法

先用载体白炭黑对湿润分散剂按比例进行充分的吸附吸收，然后依次添加稳定保护剂，充分分散。将分散均匀的混合物再与孢子粉充分混合，真空干燥使制剂含水量≤5％。

所用蜡蚧轮枝菌孢子粉可由蜡蚧轮枝菌通过行平板培养或固体发酵，经过产孢、收集、干燥(含水量≤5％，含孢量≥2.0×10⁹个/克)后备用。

【实施例11】粉拟青霉孢子可湿性粉剂的制备

组分                          含量(重量％)

粉拟青霉孢子粉                    68％

白炭黑                            12％

IW                                5％

月桂氮卓酮                        8％

羧甲基纤维素                      2％

变性淀粉                          4％

二氧化钛                          1％

二、制备方法

先用载体白炭黑对湿润分散剂按比例进行充分的吸附吸收，然后依次添加稳定保护剂，充分分散。将分散均匀的混合物再与孢子粉充分混合，真空干燥使制剂含水量≤5％。

所用粉拟青霉孢子粉可由粉拟青霉通过行平板培养或固体发酵，经过产孢、收集、干燥(含水量≤5％，含孢量≥2.0×10⁹个/克)后备用。

【实施例12】汤普森被毛孢孢子可湿性粉剂的制备

组分                          含量(重量％)

汤普森被毛孢孢子粉                75％

白炭黑                            11％

IW                                3％

月桂氮卓酮                        6％

羧甲基纤维素                      1％

变性淀粉                          3％

二氧化钛                          1％

二、制备方法

先用载体白炭黑对湿润分散剂按比例进行充分的吸附吸收，然后依次添加稳定保护剂，充分分散。将分散均匀的混合物再与孢子粉充分混合，真空干燥使制剂含水量≤5％。

所用汤普森被毛孢孢子粉可由汤普森被毛孢通过行平板培养或固体发酵，经过产孢、收集、干燥(含水量≤5％，含孢量≥1.0×10⁵个/克)后备用。

           本发明真菌孢子可湿性粉剂的贮藏稳定性

【实施例13】

1、孢子粉制备

球孢白僵菌通过平板培养或固体发酵，经过产孢、收集、干燥(含水量≤5％，含孢量≥1.0×10¹¹个/克)后备用。

2、制剂加工

根据实施例1，选择白炭黑(TB-2)作为载体，在制剂中的比例为10～15％；根据实施例2，选择IW(脂肪醇与环氧乙烷缩合物)与月桂氮卓酮(1-十二烷基-六氢-2H-氮杂卓-2-酮)作为制剂的湿润剂和分散剂，二者比例为1∶1或1∶2，在制剂中的总比例为10％左右；根据实施例3，选择羧甲基纤维素和变性淀粉作为制剂的稳定保护剂，在制剂中的比例为5％左右；根据实施例4，选择二氧化钛作为紫外线吸收剂，在制剂中的比例为1％。

孢子粉与助剂在不同配方中的比例见下表：

                     表8用于贮藏稳定性试验的制剂配方表

配方	孢子粉	白炭黑(TB-2型)	IW	月桂氮卓酮	羧甲基纤维素	变性淀粉	二氧化钛
								A	74％	10％	3.3％	6.7％	2.5％	2.5％	1％
B	73.5％	10％	3.3％	6.7％	0.5％	5％	1％
								C	73％	10％	5％	5％	1％	5％	1％
D	73.5％	10％	5％	5％	0.5％	5％	1％

先用载体白炭黑(TB-2型)对IW(脂肪醇与环氧乙烷缩合物)和月桂氮卓酮(1-十二烷基-六氢-2H-氮杂卓-2-酮)按比例进行充分的吸附吸收，然后依次添加羧甲基纤维素、变性淀粉、二氧化钛。将分散均匀的混合物再与孢子粉充分混合，真空干燥使制剂含水量≤5％。

3、制剂贮藏与活力检测

用锡箔袋真空包装加工好的制剂，5g/袋，置于15℃、干燥的环境中，每2～3个月取样用平板法检测制剂中孢子萌发率。经过18个月15℃后，4个配方制剂与纯孢子粉之间的孢子活力出现了显著差异，4个配方制剂的孢子活力均显著高于对照(纯孢子粉)；4个配方制剂之间也有显著差异，其中配方C制剂的孢子活力仍保持在70％以上(见表8)。

                   表8不同配方制剂的贮藏试验(15℃)

制剂配方	孢子存活率(％)
					6个月	9个月	14个月	18个月
	孢子粉	96.0±1.7  a	94.3±1.5ab	85.0±4.6  a					6.0±2.7  a
A					95.74±1.5 a	97.7±1.5  b	89.0±1.0  a	58.7±3.2 c

B	98.7±1.5  a	93.3±1.5  a	88.0±2.9  a	72.3±4.5  d
					C	97.7±2.5  a	96.7±2.9ab	88.0±3.0  a	34.3±3.2  b
D	98.3±2.1  a	94.0±1.0  a	84.7±4.5  a	29.3±2.1  b
					F test	F＝1.5，P＞0.05	F＝3.2，P＞0.05	F＝1.0，P＞0.05	F＝193.2，P＜0.05

注：A、B、C和D指步骤2中的制剂配方。数值后的小写字母表示差异显著性分析，同一列内含有相同字母表示差异不显著(Duccan，p＜0.05)。

以上对本发明较佳实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (10)

1、一种真菌孢子可湿性粉剂，由杀虫真菌孢子粉和助剂组成，其特征在于，所述杀虫真菌孢子粉在可湿性粉剂中的重量百分比为50～75％；

所述助剂包括载体、湿润分散剂和稳定保护剂；

其中所述载体为白炭黑；

所述湿润分散剂为选自月桂氮卓酮、脂肪醇与环氧乙烷缩合物、固体萘磺酸盐甲醛缩合物、甲基萘磺酸盐甲醛缩合物的一种或多种；

所述稳定保护剂为选自羧甲基纤维素、变性淀粉、甲基纤维素、β-环糊精的一种或多种。

2、权利要求1所述的真菌孢子可湿性粉剂，其特征在于，在所述助剂中，所述载体在可湿性粉剂中的重量百分比为10～15％、所述湿润分散剂在可湿性粉剂中的重量百分比为5～20％、所述稳定保护剂在可湿性粉剂中的重量百分比为3～15％。

3、权利要求1所述的真菌孢子可湿性粉剂，其特征在于，所述真菌孢子粉为选自白僵菌、绿僵菌、拟青霉、轮枝菌、野村菌和被毛孢的一种或多种真菌的孢子粉。

4、权利要求3所述的真菌孢子可湿性粉剂，其特征在于，所述真菌孢子粉为白僵菌孢子粉。

5、权利要求1所述的真菌孢子可湿性粉剂，其特征在于，所述湿润分散剂为脂肪醇与环氧乙烷缩合物和月桂氮卓酮，两者的重量比为1∶1或1∶2。

6、权利要求1所述的真菌孢子可湿性粉剂，其特征在于，所述稳定保护剂为羧甲基纤维素和变性淀粉，两者的重量比为1∶1～10。

7、权利要求1所述的真菌孢子可湿性粉剂，其特征在于，所述真菌孢子可湿性粉剂进一步包含选自二氧化钛、尿素、叶酸、活性炭的一种或多种的紫外线吸收剂，所述紫外吸收剂在可湿性粉剂中的重量百分比为1～2％。

8、权利要求7所述的真菌孢子可湿性粉剂，其特征在于，所述紫外线吸收剂为二氧化钛。

9、权利要求8所述的真菌孢子可湿性粉剂，其特征在于，所述真菌孢子可湿性粉剂中，各组分重量百分比为：真菌孢子粉62～75％，白炭黑10～15％，月桂氮卓酮5～8％，脂肪醇与环氧乙烷缩合物3～5％，变性淀粉3～5％，羧甲基纤维素0.5～5％，二氧化钛1％。

10、权利要求9所述的真菌孢子可湿性粉剂，其特征在于，所述真菌孢子可湿性粉剂中，各组分重量百分比为：真菌孢子粉73.5％，白炭黑10％，月桂氮卓酮6.7％，脂肪醇与环氧乙烷缩合物3.3％，变性淀粉5％，羧甲基纤维素0.5％，二氧化钛1％。