CN104738097A - 一种球孢白僵菌桶混剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种球孢白僵菌桶混剂及其制备方法。该球孢白僵菌桶混剂包含10.0-20.0g粉剂、50.0ml助剂和10000-20000ml水；粉剂包含球孢白僵菌高孢粉90.0-100.0g、填料0-10.0g、高温保护剂0-2.0g、营养增稠剂0-3.0g、稳定保护剂0-0.5g、抗氧化剂0-0.2g、生物保护剂0-0.5g、紫外保护剂A0-1.0g和生物调节剂0-0.5g；助剂包含分散剂10.0g、乳化分散剂A15.0-25.0g、乳化分散剂B15.0-25.0g、紫外保护剂B5.0g和30ml水。本发明保证了药效，实现了货架期长和高效率施药作业，可推进球孢白僵菌的商业化和产业化。

Description

一种球孢白僵菌桶混剂及其制备方法

技术领域

本发明属于微生物农药技术领域，特别涉及一种球孢白僵菌桶混剂及其制备方法。

背景技术

玉米是我国第二大粮食作物，年产3000亿斤以上，可用来食用，也可以作为饲料和工业原料生产工业酒精和烧酒等。而玉米螟(Ostrinia nubilalis)是玉米生产中的主要害虫，不仅取食玉米叶片、蛀入玉米主茎或果穗内，降低光合作用，影响养分运输，还产生各种次级病害，致使玉米减产降质，常年造成玉米的产量损失在7％-15％，严重年份减产50％以上，甚至绝产，给我国粮食生产造成巨大的经济损失。

化学农药在玉米螟的防治中一直起着主要的作用，保证了粮食增产和安全问题，但是随着大量、连续的化学农药使用，农药残留对食用安全和环境经安全的危害越来越严重，环境兼容性好的高效农药已成为农药发展的方向。球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是一种微生物农药，是目前国内应用最广泛的昆虫病原真菌，可侵染鳞翅目螟蛾科、金花虫科、金龟子科、蚜虫科800余种害虫具有致病性强，杀虫范围广，环境友好等优点，已经在各个地区被广泛应用，但在防治中仍存在剂型单一、劳动效率低、杀虫速度慢、杀虫效率低等缺点。目前，白僵菌在我国最成功的推广典范是玉米螟和松毛虫的防治，但均为政府推广，使用最多的是白僵菌粉剂，以春天封玉米垛和飞机喷粉为主；白僵菌颗粒剂也有使用，但劳动效率低，已经逐渐消失。造成白僵菌在我国推广和商业化困难的主要原因是菌种毒力退化、剂型单一、剂型不易保存、作业效率低等原因。一直以来，白僵菌新剂型开发就是难点，主要因为：白僵菌是活体微生物发挥药效，研制剂型的过程中很容易导致菌种失活，致使研制出的新剂型药效低，没有推广价值；开发出的白僵菌新剂型一直以粉剂为主，施用劳动效率低，急需开发出药效高、利于施用的新剂型；即使开发出有效的剂型，剂型保存和田间使用方法难度大也限制了推广使用，因此白僵菌推广和商业化困难。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术中存在的缺点与不足，提供一种球孢白僵菌桶混剂。

本发明的再一目的在于提供所述的球孢白僵菌桶混剂的制备方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种球孢白僵菌桶混剂，包含如下组分：10.0-20.0g粉剂、50.0ml助剂和10000-20000ml水。

所述的粉剂包含如下组分：球孢白僵菌高孢粉90.0-100.0g、填料0-10.0g、高温保护剂0-2.0g、营养增稠剂0-3.0g、稳定保护剂0-0.5g、抗氧化剂0-0.2g、生物保护剂0-0.5g、紫外保护剂A 0-1.0g和生物调节剂0-0.5g；

所述的球孢白僵菌高孢粉优选为含水量为5-10％的球孢白僵菌高孢粉，细度为400目。

所述的填料优选为滑石粉。

所述的高温保护剂优选为蔗糖。

所述的营养增稠剂优选为蛋白粉。

所述的稳定保护剂优选为羧甲基纤维素钠。

所述的抗氧化剂优选为抗坏血酸。

所述的生物保护剂优选为乳酸链球菌素。

所述的紫外保护剂A优选为UV-P。

所述的生物调节剂优选为腐殖酸。

所述的助剂包含如下组分：分散剂10.0g、乳化分散剂A 15.0-25.0g、乳化分散剂B 15.0-25.0g、紫外保护剂B 5.0g和30ml水。

所述的分散剂优选为USY-TXC。

所述的乳化分散剂A优选为USY-FS7PG。

所述的乳化分散剂B优选为USY-FS3000。

所述的紫外保护剂B优选为对甲氧基肉桂酸辛酯。

所述的球孢白僵菌桶混剂的制备方法，包括如下步骤：将10.0-20.0g粉剂和50.0ml助剂混合均匀后，加入10000-20000ml水中，搅拌均匀，得到球孢白僵菌桶混剂。

所述的水为纯净水。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明通过对球孢白僵菌桶混剂的研制，筛选到货架期长，适合田间机械化施用的球孢白僵菌桶混剂作业模式，在保证药效的同时，实现了货架期长、施药作业效率高的目标，从而可推进生物农药球孢白僵菌的商业化和产业化发展。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例

(一)实验内容

球孢白僵菌桶混剂的制备方法，包括如下步骤：将10.0-20.0g粉剂和50.0ml助剂混合均匀后，加入10000-20000ml水中，搅拌均匀，得到球孢白僵菌桶混剂。水为纯净水。

表1各实施例的球孢白僵菌桶混剂的组成成分

粉剂1-7(见表2)按比例在4000rpm下砂磨混合10min，10％≥湿度≥5％，避光储存在-20℃、4℃和室温条件下，每月定期检测孢子萌发率，定期检测pr1蛋白酶活性和玉米螟幼虫毒力，筛选合适的粉剂组合。

表2各粉剂的组成成分

助剂1-3(见表3)采用Co 60射线照射灭菌，在室温避光条件下储存。

表3各助剂的组成成分

实施例1-9的球孢白僵菌桶混剂检测粘度、悬浮率、分散效果、孢子萌发率、玉米螟幼虫毒力和田间防效。

孢子萌发率检测方法：将0.1g粉剂加入到100mL含0.05％的吐温-80无菌水中，用玻璃珠打散、混匀，并将孢子浓度稀释至5×10⁷个/mL，取1mL加入9ml灭菌的含有抗生素的SDY液体培养液中，26℃、180rpm恒温振荡培养20h后显微镜镜检萌发孢子，并统计孢子萌发率。每个样品重复三次，取平均值。

pr1蛋白酶检测方法：取1ml孢子浓度为5×10⁷个/mL的菌悬液接种至100mlSDY培养液中，26℃、180rpm摇床培养72h后收集、洗涤菌丝。接种0.1g菌丝至50ml蝉蜕诱导培养液中，26℃、180rpm摇床培养24h后过滤除去菌体，过滤液即为酶液。酶液与用sigma专一显色底物28℃反应10min后，加入预冷的冰乙酸终止反应，酶标仪405nm处测量OD值，即为酶活性。对照为DMSO，无显色底物。每处理重复3次，取OD450平均值。

玉米螟幼虫毒力检测方法：将三龄玉米螟幼虫在孢子浓度为1×10⁷个/mL的孢子悬液中浸渍5-10s后放入底部含有1g饲料的24孔板中，每孔放入一虫，清水浸渍为对照。每个处理24头幼虫，重复3次，三天后开始统计幼虫死亡情况，连续统计9天，并计算僵死率。

粘度检测方法：采用粘度计直接读数，单位为mPa·s。

悬浮率检测方法：参照GB/T14825-93执行，称取适量试样(悬浮液浓度为最高喷洒浓度)，精确至0.0001g，置于盛有50mL标准硬水(30±1℃)的200mL烧杯中，用手摇荡作圆周运动，约每分钟120次，进行2min，将悬浮液在同一温度的水浴锅中放置13min，然后用30±1℃的标准硬水将其全部洗入250mL量筒中，并稀释至刻度盖上盖子。以量筒底部为轴心，将量筒在1min内上下颠倒30次(将量筒倒置并恢复至原位为1次，约2s)。打开塞子，在垂直放入无振荡的恒温水浴锅中30min。用吸管在10～15s内将内容物的9/10即(225mL)悬浮液移出。不要摇动或搅起量筒内的沉降物，确保吸管的顶端总是在液面下几毫米处，之后烘干称取重量，并计算悬浮率，每组实验重复三次。悬浮率＝(试样质量-25ml悬浮液中有效成分质量)/试样质量×10/9×100％。

分散效果检测方法：取1mL桶混剂加入1000mL水中，记录样品在水中蘑菇云状的分散时间(S)及分散状态，每组桶混剂重复三次。

田间防效检测方法：在玉米大喇叭口期(7月初)进行桶混剂小区喷雾防治玉米螟，水和白僵菌颗粒剂为对照，每小区196m²(16m×16m)，机械化小区4800m²(200m×24m)。喷雾防治一周后、两个半月(9月末)后进行防效调查，每处理采用五点取样，每点10株，调查健株、折雄、虫孔数、僵虫数、活虫数和玉米产量等指标。

所述的有效成分为球孢白僵菌高孢粉，由吉林农院生物制剂厂生产，含孢量≥1000亿个孢子/克孢子粉，含水量控制在5-10％，发芽率≥95％，细度为400目。

所述的填料为滑石粉，海城市宽祥矿产品制造有限公司生产，含水量控制在5-10％，细度为400目。

所述的高温保护剂为蔗糖，购自生工生物工程(上海)有限公司。

所述的营养增稠剂为蛋白粉，购自生工生物工程(上海)有限公司。

所述的稳定保护剂为羧甲基纤维素钠，购自国药集团化学试剂有限公司。

所述的抗氧化剂为抗坏血酸，购自拓洋实业有限公司。

所述的生物保护剂为乳酸链球菌素，购自天津艾玛斯特生物科技有限公司。

所述的紫外保护剂A为UV-P，购自杭州帝盛进出口有限公司。

所述的生物调节剂为腐殖酸，购自太仓市农药厂有限公司。

所述的吐温-80、DMSO，均购自生工生物工程(上海)有限公司。

所述的专一显色底物为Suc-Ala-Ala-Pro-pPhe-PNA，购自sigma公司。

所述的分散剂为USY-TXC，购自杰世化工(上海)有限公司。

所述的乳化分散剂A为USY-FS7PG、乳化分散剂B为USY-FS3000，均购自杰世化工(上海)有限公司。

所述的紫外保护剂B是对甲氧基肉桂酸辛酯，购自天津市恩思生化科技有限公司。

所述的乳化机采用“众时(上海)机械有限公司”生产的ZLE-B300实验室匀质乳化机。所的述砂磨机采用“众时(上海)机械有限公司”生产的ZMD-550实验室分散砂磨机。所述的酶标仪为美国伯腾仪器有限公司生产的ELx 800型号酶标仪。所述的粘度计为上海天平仪器厂生产的NDJ-1型号粘度计。所述的显微镜采用重庆光电仪器有限公司生产的XSZ-HY2型生物显微镜。所述的喷雾器为新兴双管喷雾器，工作压力：0.2～0.3Mpa。所述16喷头高杆喷雾机械由吉林公主岭国家农业科技园区春丰农机有限公司制造，四轮后双驱动，发动机最大功率为20马力，药箱容量800公斤，喷杆五段、四折叠、11米宽，喷杆高度为0.4-3.2米，回水搅拌系统，喷雾压力0.2～0.4Mpa，液泵流量40公斤/分钟。

(二)实验结果

(1)粉剂孢子萌发率结果

所述粉剂1-7在-20℃、4℃和室温条件下存储12个月，定期检测孢子萌发率，结果显示粉剂在室温储存时孢子萌发活力降低迅速，因此粉剂适宜低温储存，生产应用中建议采用-20℃和4℃避光储存。粉剂1-7的孢子萌发结果显示，粉剂配方中未添加严重损伤孢子萌发活力的助剂，其中粉剂1-4添加助剂对孢子萌发活力无抑制作用，粉剂2-3还具有明显的保护作用。具体结果如表4所示：

表4各粉剂孢子萌发率结果

(2)粉剂pr1蛋白酶活性结果

Pr1蛋白酶是球孢白僵菌侵染玉米螟幼虫表皮的一个重要蛋白酶，是衡量球孢白僵菌对玉米螟幼虫毒力强弱的一个指标。粉剂1-7在-20℃、4℃和室温条件下存储12个月，定期检测Pr1蛋白酶OD 450值，结果显示pr1蛋白酶活力在低温储存时降低缓慢，在室温存储时降低很快，此结果与孢子萌发率检测结果一致，因此建议生产应用中采用-20℃和4℃避光储存。粉剂1-5中的pr1蛋白酶活力高于粉剂7，粉剂1-4中的pr1蛋白酶活力明显高于粉剂7，说明粉剂配方中未添加严重损伤孢子酶活力的助剂，其中粉剂1-4添加助剂对孢子酶活力具有明显的保护作用。具体结果如表5所示：

表5各粉剂pr1蛋白酶活性结果

(3)粉剂对玉米螟幼虫毒力结果

所述粉剂1-7在-20℃、4℃和室温条件下存储12个月，定期检测玉米螟幼虫毒力，结果显示粉剂1-7均对玉米螟幼虫均有明显的触杀作用，但在室温时粉剂的毒力降低较快，与孢子萌发率和pr1蛋白酶活力数据一致，因此建议生产应用中采用-20℃和4℃避光储存。粉剂1-5的玉米螟幼虫毒力强于粉剂7，其中粉剂1-3的毒力明显高于粉剂7，说明添加的助剂对玉米螟幼虫毒力具有促进作用。具体结果如表6所示：

表6各粉剂对玉米螟幼虫毒力结果

(4)球孢白僵菌桶混剂粘度结果

对实施例1-9的球孢白僵菌桶混剂进行粘度检测，上述实施例1-9粘度在161-180mPa·s之间，均为喷雾剂合理粘度值，但越大越好，所以实施例3、6、9较好，其中实施例9最好。具体结果如表7所示：

表7实施例1-9的球孢白僵菌桶混剂的粘度结果

(5)球孢白僵菌桶混剂悬浮率结果

实施例1-9的球孢白僵菌桶混剂悬浮率检测结果在89.10％-98.40％之间，均为喷雾剂合理悬浮率，但越大越好，其中实施例4、7、8、9悬浮率达到95％以上。具体结果如表8所示：

表8实施例1-9的球孢白僵菌桶混剂的悬浮率结果

(6)球孢白僵菌桶混剂分散效果

实施例1-9的球孢白僵菌桶混剂分散时间在35S-71S之间，均能达到稀释时快速分散的效果，但实施例3和6分散时有颗粒沉降，其中实施例7、8、9分散效果较好。具体结果如表9所示：

表9实施例1-9的球孢白僵菌桶混剂的分散结果

(7)球孢白僵菌桶混剂孢子萌发率结果

实施例1-9的球孢白僵菌桶混剂中孢子萌发率均达到90％以上，说明助剂的添加并未抑制粉剂中孢子的萌发活力。具体结果如表10所示：

表10实施例1-9的球孢白僵菌桶混剂的孢子萌发率结果

(8)球孢白僵菌桶混剂的玉米螟幼虫生测结果

实施例1-9的球孢白僵菌桶混剂第八天时对玉米螟幼虫的僵死率在77-84％，说明助剂的添加并未抑制粉剂中孢子的毒力，其中实施例7、8、9的僵死率达到83％以上。具体结果如表11所示：

表11实施例1-9的球孢白僵菌桶混剂的玉米螟幼虫生测结果

(9)球孢白僵菌桶混剂的田间应用结果

田间试验中仅对实施例7、8、9进行了实验。

实施例7-9田间防治一代玉米螟结果显示，健株率提高、折雄率为0、虫孔率下降，说明实施例7-9对一代玉米螟均具有明显的防治效果。具体结果如表12所示：

表12实施例7-9的球孢白僵菌桶混剂的田间应用结果

实施例7-9田间防治一代、二代玉米螟综合防效显示，健株率提高、折雄率降低、虫孔率下降、僵虫率提高、百株穗重增加、千粒重增加、增产明显，这说明球孢白僵菌桶混剂在田间对玉米螟具有明显的防治和增产效果，防效与传统的颗粒剂相金。具体结果如表13所示：

表13实施例7-9的球孢白僵菌桶混剂的一代、二代玉米螟综合防效结果

(10)球孢白僵菌桶混剂的田间作业效率结果

球孢白僵菌桶混剂通过人工喷雾器和16喷头高杆作业机械进行田间施药，通过比较单位面积的作业时间，16喷头比传统颗粒剂提高作业效率97.87％，比喷雾器提高作业效率90.45％，喷雾器比传统作业效率提高77.66％。比较结果如表14所示：

表14颗粒剂、喷雾器和16喷头机械作业效率比较结果

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种球孢白僵菌桶混剂，其特征在于，包含如下组分：10.0-20.0g粉剂、50.0ml助剂和10000-20000ml水。

2.根据权利要求1所述的球孢白僵菌桶混剂，其特征在于，所述的粉剂包含如下组分：球孢白僵菌高孢粉90.0-100.0g、填料0-10.0g、高温保护剂0-2.0g、营养增稠剂0-3.0g、稳定保护剂0-0.5g、抗氧化剂0-0.2g、生物保护剂0-0.5g、紫外保护剂A 0-1.0g和生物调节剂0-0.5g。

3.根据权利要求2所述的球孢白僵菌桶混剂，其特征在于，所述的球孢白僵菌高孢粉为含水量为5-10％的球孢白僵菌高孢粉，细度为400目。

4.根据权利要求2所述的球孢白僵菌桶混剂，其特征在于，所述的填料为滑石粉；所述的高温保护剂为蔗糖；所述的营养增稠剂为蛋白粉。

5.根据权利要求2所述的球孢白僵菌桶混剂，其特征在于，所述的稳定保护剂为羧甲基纤维素钠；所述的抗氧化剂为抗坏血酸；所述的生物保护剂为乳酸链球菌素；所述的紫外保护剂A为UV-P；所述的生物调节剂为腐殖酸。

6.根据权利要求1所述的球孢白僵菌桶混剂，其特征在于，所述的助剂包含如下组分：分散剂10.0g、乳化分散剂A 15.0-25.0g、乳化分散剂B 15.0-25.0g、紫外保护剂B 5.0g和30ml水。

7.根据权利要求6所述的球孢白僵菌桶混剂，其特征在于，所述的分散剂为USY-TXC；所述的乳化分散剂A为USY-FS7PG。

8.根据权利要求6所述的球孢白僵菌桶混剂，其特征在于，所述的乳化分散剂B为USY-FS3000；所述的紫外保护剂B为对甲氧基肉桂酸辛酯。

9.权利要求1-8任一项所述的球孢白僵菌桶混剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将10.0-20.0g粉剂和50.0ml助剂混合均匀后，加入10000-20000ml水中，搅拌均匀，得到球孢白僵菌桶混剂。