CN115053916A - 一种可提高球孢白僵菌稳定性的微生物菌剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物农药和农用肥料技术领域，具体涉及一种可提高球孢白僵菌稳定性的微生物菌剂及其制备方法。包括以下重量份的原料：白僵菌孢子粉5～15份，啤酒糟45～55份，载体20～25份，溶剂油5～10份，糊精9～10份，纳米氧化钛0.5～1份，促活剂5～8份，羟甲基淀粉钠剂0.2～0.5份。以白僵菌孢子粉、溶剂油、载体、抗紫外剂、分散剂和促活剂组成的生态菌剂，其有效成分抗逆能力加强，可以促进植物显著生长。选用甜菜粉作为载体，豆油作为助剂油，海藻糖、酪氨酸作为促活剂，大幅提高产品的抗逆性和稳定性，实现微生物在土壤中快速定殖和高效存活。

Description

一种可提高球孢白僵菌稳定性的微生物菌剂及其制备方法
技术领域
本发明属于微生物农药和农用肥料技术领域，具体涉及一种可提高球孢白僵菌稳定性的微生物菌剂及其制备方法。
背景技术
随着人类可持续发展战略的提出，虫生真菌在害虫的持续控制及维护生物多样性方面发挥显著的作用，受到人们的普遍关注。球孢白僵菌，属半知菌亚门，白僵菌属，白僵菌是一种广谱性的昆虫病原真菌，杀虫谱广，杀虫力强，易于培养和大量生产，因此，成为国内外应用最广泛的虫生真菌。
白僵菌孢子可以通过液态发酵、半固态发酵、固体发酵生产。由于固态发酵法成本低,产品毒性高，固态发酵法在白僵菌孢子生产中成为了首选方法。目前对固态发酵法生产白僵菌孢子的研究主要集中于发酵原料优化，培养配方优化等。并利用在固态发酵培养基中添加营养物质的策略提高白僵菌孢子的产量。
目前球孢白僵菌的培养方法主要是利用米糠,麦麸等作为生产原料，菌剂配方以碳源氮源的提供物为主，再加入一些载体和溶剂油，有些培养配方还加入促活剂和抗紫外剂等。白僵菌菌株抗逆性的强弱在很大程度上决定着菌剂本身的生态适应性和田间应用效果，而且同一菌株在不同寄主上也表现出不同的毒力，因此如何得到高毒力和抗逆性强的菌种制剂仍是需要解决的问题，另外现阶段白僵菌孢子的萌发率低，菌剂稳定性差的问题也是制约球孢白僵菌发展的问题之一。
发明内容
针对现阶段球孢白僵菌微生物制剂存在的问题，本发明提供了以白僵菌孢子粉、溶剂油、载体、抗紫外剂、分散剂和促活剂组成的生态菌剂，其有效成分抗逆能力加强，可以促进植物显著生长。选用甜菜粉作为载体，豆油作为助剂油，海藻糖、酪氨酸作为促活剂，大幅提高产品的抗逆性和稳定性，实现微生物在土壤中快速定殖和高效存活。
本发明的技术方案如下：
一种可提高球孢白僵菌稳定性的微生物菌剂，包括以下重量份的原料：白僵菌孢子粉5～15 份，啤酒糟45～55 份，载体20～25 份，溶剂油5～10 份，粘合剂9～10 份，抗紫外剂0.5～1 份，促活剂5～8 份，崩解剂0.2～0.5 份；增效剂0.5～1份；分散剂0.5～1份。
优选地，所述的载体为甜菜粉、滑石粉、膨润土或高岭土；所述的抗紫外剂为纳米氧化钛。
优选地，所述的增效剂为灭幼脲三号、甲壳素和黄腐酸；所述的崩解剂为羟甲基淀粉钠。
优选地，所述的粘合剂为可溶性淀粉或/和糊精；所述的分散剂为木质素磺酸钠或木质素磺酸钙。
优选地，所述的溶剂油为豆油、玉米油或色拉油。
优选地，所述的促活剂为：海藻糖2～3 份，酪氨酸3～5 份。
优选地，所述的载体为甜菜粉。
上述可提高球孢白僵菌稳定性的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将白僵菌孢子粉与啤酒糟、载体、抗紫外剂、促活剂、增效剂和崩解剂均匀混合，得到白僵菌混合粉体；
(2)将粘合剂溶解成水溶液，与溶剂油、分散剂，均匀混合得到粘合剂混合液；
(3)将粘合剂混合液与白僵菌混合粉体均匀混合，挤压造粒，干燥得到白僵菌颗粒制剂。
上述制备方法制备得到的微生物菌剂。
甜菜粉：一是利用甜菜粉本身的理化性能，可以作为载体；二是甜菜粉具有较高的甜香味，可以作为引诱剂来吸引诱杀蛴螬，进而在一定程度上减少了原料的成本；三是利用甜菜本身带有的深紫色，相对浅颜色来说，深紫色光波较长，在一定程度上能够吸收日光中的紫外线，减小紫外线对产品的辐射损害程度，抗紫外剂可有效反射紫外线，共同配合使菌剂有效成分保持较高的活力。海藻糖可以降低造粒过程中对白僵菌孢子的热损伤。酪氨酸可以显著提高白僵菌孢子的萌发率。
选用甜菜粉、海藻糖、酪氨酸等，大幅度提高了产品抗逆性和稳定性，共同促进作物生长，同时实现微生物在土壤中快速定殖和高效存活，解决了生态菌剂稳定性差、孢子萌发率低的问题；颗粒剂型不仅便于投撒，还为球孢白僵菌提供易于定殖的微环境，从而提高对环境的抗逆性和对害虫的防治效果，是生态菌剂的理想剂型。
本发明具有以下有益效果:
1.培养基配方和制作方法简单，材料易得，成本低廉，分生孢子产量高。
2. 提高菌株对环境的抗逆性，显著提高白僵菌孢子的萌发率，解决了生态菌剂稳定性差的问题。
3.明显减小紫外线对产品的损坏程度，并降低造粒过程中对白僵菌孢子的机械损伤，使有效成分保持较高的活力。
4.能有效改善土壤微生态环境；有效促进植株和种子生长，提高作物产量和品质。
附图说明
图1为白僵菌颗粒制剂在不同温度下的贮存活力分析图。
具体实施方式
实施例中所用的增效剂为灭幼脲三号、甲壳素和黄腐酸按照质量比1:1:2混合所得。
实施例1
一种可提高球孢白僵菌稳定性的微生物菌剂，其特征在于，包括以下重量百分比的原料：白僵菌孢子粉50g，啤酒糟550g，滑石粉250g，玉米油50g，可溶性淀粉90g，纳米氧化钛5g，海藻糖20g，酪氨酸50g， 崩解剂羟甲基淀粉钠5g；增效剂5g；分散剂木质素磺酸钠5g。
上述可提高球孢白僵菌稳定性的微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将白僵菌孢子粉与啤酒糟、载体、抗紫外剂、促活剂、增效剂和崩解剂均匀混合，得到白僵菌混合粉体；
(2)将粘合剂溶解成水溶液，与溶剂油、分散剂，均匀混合得到粘合剂混合液；
(3)将粘合剂混合液与白僵菌混合粉体均匀混合，挤压造粒，干燥得到白僵菌颗粒制剂。
实施例2
一种可提高球孢白僵菌稳定性的微生物菌剂，其特征在于，包括以下重量百分比的原料：白僵菌孢子粉150g，啤酒糟450g，膨润土200g，色拉油100g，可溶性淀粉60g，糊精40g，纳米氧化钛10g，海藻糖30g，酪氨酸30g， 崩解剂羟甲基淀粉钠剂2g，增效剂10g，分散剂木质素磺酸钙10g。
制备方法同实施例1。
实施例3
一种可提高球孢白僵菌稳定性的微生物菌剂，其特征在于，包括以下重量百分比的原料：白僵菌孢子粉100g，啤酒糟500g，甜菜粉220g，豆油80g，糊精95g，纳米氧化钛8g，海藻糖25g，酪氨酸40g，崩解剂羟甲基淀粉钠剂4g，增效剂8g；分散剂木质素磺酸钠7g。
制备方法同实施例1。
实施效果例
一、抗逆性研究
本实验采用实施例1-3制备的微生物菌剂，做好编号进行区别。将做好的颗粒制剂，每样1 g， 随机取3 次，然后加到高压灭菌的装有玻璃珠和5 mL 0.1 %吐温-80的玻璃试管中，涡旋振荡混匀，使之充分悬浮。利用血球计数板进行计数，由光学显微镜进行观察数出的孢子数进行计算,将分生孢子悬浮液稀释至108 个/mL的浓度。利用浸蘸法，根据以上配制成的1×108 个/ml的菌悬液对三龄健康的蛴螬幼虫进行浸蘸，将其取出放置于经过高压灭菌的滤纸上，使其任意爬行2~3 min，待水分晾干，然后放入无菌的塑料饭盒中，并以碎木屑为食物。每组分为3 个重复区域，每区30 头，每只浸蘸10 s，接种后每2 d观察记录幼虫的死亡情况,连续观察50 天，并以含0.1%的吐温-80的蒸馏水作为对照。为了验证是否为白僵菌致死，将试验的僵虫取出置于培养平板中进行恒温保湿培养，并观察生长的菌丝和产孢数量，作进一步分析和确认，最后统计死亡率(%)，计算校正死亡率(%)、致死中时(LT50)。
表1 不同菌剂的之死中时（LD50）研究
Figure 939068DEST_PATH_IMAGE001
不同菌剂中，对LD50存在显著性差异，其中最低为实施例1，最高为实施例3。
二、萌发率研究
本试验选取了实施例1-3制成微生物菌剂。每种不同的菌剂制成的颗粒各取3个样，每个样1 g，然后加到高压灭菌的装有玻璃珠和5 mL 0.1%吐温80的玻璃试管中进行涡旋振荡混匀，使之充分悬浮。利用血球计数板进行计数，由光学显微镜进行观察数出的个数进行计算，将分生孢子悬浮液稀释至108 个/mL的浓度。在无菌的条件下，将制备好的不同菌剂的孢子悬浮液分别吸取100 uL，接种到含有蔗糖琼脂培养基的中心部。在恒温培养箱中进行25 ℃和12 D:12 L条件下连续培养24 h。每个处理 3 个重复。自第2 h起，用光学显微镜进行检测，每隔2 h定时计算孢子萌发率，最后计算出GT50。
萌发率公式
Figure DEST_PATH_IMAGE002
表2 不同菌剂孢子萌发率的研究
Figure DEST_PATH_IMAGE003
不同菌剂中，孢子的萌发率为51.53~64.31%，其中最低为实施例1，最高为实施例3，见表2。
三、稳定性考察
利用纳米ZnO作为稳定剂，制成的白僵菌颗粒制剂的GT50为5.98 h。LT50为28.76d，通过以上分析可得，纳米材料对白僵菌颗粒制剂中的孢子具有良好的生物相容性，能够更加广谱性地屏蔽紫外对白僵菌孢子的损伤。当GT50和LT50越小时，说明稳定剂对白僵菌孢子的防护效果越好，减弱了对于外界的紫外损伤程度，因此萌发中时间(GT50)较短，活孢率较高，进而诱杀蚜槽幼虫的杀虫效率较高。将多代培养的球孢白僵菌按照实施例1-3中方法制成微生物制剂，每个取样50 g与蛴螬进行共同培养，测定各组GT50与LT50，经数据分析可知，球孢白僵菌在实施例1-3中进行多代培养与原菌株的GT50与LT50无明显差异，均具有良好的稳定性。
表3 不同菌剂3代培养菌株GT50、LT50的研究
Figure 281974DEST_PATH_IMAGE004
四、活力考察
为了评价球孢白僵菌颗粒制剂贮存后的活性指标,需要定期地对白僵菌孢子活性进行检测。由于不同的贮存温度条件，对颗粒药剂中所含有的孢子活性影响较大。在检测时，将制备好的球孢白僵菌颗粒制剂封装于15 ml的离心管中，分别在温度为5℃、15℃和25℃的条件下进行避光保藏。在每种不同梯度的温度条件下贮存的颗粒各取5个样，每个样为1 g，然后加入到已灭菌处理的试管中，加入5 ml的0.1%的吐温-80，利用涡旋振荡仪使之振荡均匀、充分悬浮，稀释至适宜的浓度。利用移液枪吸取100 ul溶液至平板的中央位置，利用涂布器分散均匀，在25℃条件进行保温培养。在显微镜下，定期每隔一个月对球孢白僵菌颗粒剂的活孢率进行检测。
由图1可得，通过以上的贮存试验，温度对白僵菌颗粒制剂的贮存活力具有显著的影响，在不同的温度条件下保存，在颗粒药剂的贮存活力存在着明显的差异性。在贮存3个月内，不同温度处理条件的活孢率都在90%以上，保持比较稳定的水平。而在贮存5个月后，25℃下贮存的活孢率急速下降，在第8个月，其仅在50%左右。而在贮存14个月后，在5℃下贮存的活孢率下降了15.93%，在15℃下贮存的活孢率下降了37.16%，在25℃下贮存的活孢率下降了85.34%。通过方差分析(F=190.1，df=2，P<0.01)，白僵菌颗粒剂的活孢率在不同的温度条件下差异极显著，表明中低温条件下将有助于颗粒制剂的保存，特别是在低温条件下，更能表现出更加优良的贮存效果。

Claims (9)

1.一种可提高球孢白僵菌稳定性的微生物菌剂，其特征在于，包括以下重量份的原料：白僵菌孢子粉5～15 份，啤酒糟45～55 份，载体20～25 份，溶剂油5～10 份，粘合剂9～10份，抗紫外剂0.5～1 份，促活剂5～8 份，崩解剂0.2～0.5 份；增效剂0.5～1份；分散剂0.5～1份。
2.根据权利要求1所述的可提高球孢白僵菌稳定性的微生物菌剂，其特征在于，所述的载体为甜菜粉、滑石粉、膨润土或高岭土；所述的抗紫外剂为纳米氧化钛。
3.根据权利要求1所述的可提高球孢白僵菌稳定性的微生物菌剂，其特征在于，所述的增效剂为灭幼脲三号、甲壳素和黄腐酸；所述的崩解剂为羟甲基淀粉钠。
4.根据权利要求1所述的可提高球孢白僵菌稳定性的微生物菌剂，其特征在于，所述的粘合剂为可溶性淀粉和糊精；所述的分散剂为木质素磺酸钠或木质素磺酸钙。
5.根据权利要求1所述的可提高球孢白僵菌稳定性的微生物菌剂，其特征在于，所述的溶剂油为豆油、玉米油或色拉油。
6.根据权利要求1所述的可提高球孢白僵菌稳定性的微生物菌剂，其特征在于，所述的促活剂为：海藻糖2～3 份，酪氨酸3～5 份。
7.根据权利要求1或2所述的可提高球孢白僵菌稳定性的微生物菌剂，其特征在于，所述的载体为甜菜粉。
8.权利要求1-7任一所述的可提高球孢白僵菌稳定性的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将白僵菌孢子粉与啤酒糟、载体、抗紫外剂、促活剂、增效剂和崩解剂均匀混合，得到白僵菌混合粉体；
(2)将粘合剂溶解成水溶液，与溶剂油、分散剂，均匀混合得到粘合剂混合液；
(3)将粘合剂混合液与白僵菌混合粉体均匀混合，挤压造粒，干燥得到白僵菌颗粒制剂。
9.采用权利要求8的制备方法制备得到的微生物菌剂。
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