CN1319460C - 一种中草药杀菌剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种中草药杀菌剂。本发明所提供的中草药杀菌剂，含有如下重量份的原料制成的药剂：苍耳子50-70，黄柏20-40，蛇床子20-40，苦参20-40，白矾50-70，露蜂房10-20，金银花10-20，银杏叶10-20，白头翁15-25，细辛10-20。本发明杀菌剂由于其具有广谱抑菌活性，再加上其各个组分均为中医药方中的常用药，所以对人和植物高度安全，经过进一步应用试验和配方调整，应用范围将进一步扩大到更多作物的更多病害，在AA级绿色食品生产中发挥更大作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种中草药杀菌剂。
背景技术
目前，农业生产上使用的杀菌剂主要有化学杀菌剂和生物杀菌剂两大类。
使用化学杀菌剂进行有害生物防治所带来的主要问题就是环境污染、农药残留和有害生物抗药性增加。尤其是农药在食品中的残留对人类的健康造成了极大的危害，这一问题在蔬菜病害的防治上表现得尤为突出。
生物杀菌剂是利用生物活体或由生物产生的活性成分，以及化学合成的具天然化合物结构的物质，制备出的可防治植物病害的制剂。主要分为微生物活体杀菌剂、抗生素(主要指微生物代谢产物或其仿生合成物)和植物源杀菌剂。狭义上的生物杀菌剂即指微生物活体杀菌剂和由微生物产生的抗生素。
微生物活体杀菌剂是以活体微生物来防治有害病原物，因此任何能影响产品数量及其活力的因素均影响其防治效果，如发酵条件、发酵过程中的污染现象、菌株在保存过程中发生变异、贮运环境及贮存时间长短等，这些均能够导致其产品防治效果不稳定。另外，大量施入活体微生物杀菌剂后打破了自然环境中原有的微生态平衡，再加上对新环境的不适应，从而影响其生长繁殖而不能很好地发挥作用，而这种影响是人类难以控制和解决的，这严重阻碍了微生物杀菌剂的直接应用。因此，目前应用微生物活体来防治病害，绝大多数停留在试验阶段。
抗生素类杀菌剂是一类应用较好的杀菌剂，但由于抗生素是由微生物发酵而得，获得一个高效菌株很难，而且也存在与微生物发酵类似的问题，因而目前只有少数种类得到大面积应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种农用中草药杀菌剂。
本发明所提供的中草药杀菌剂，含有如下重量份的原料制成的药剂：
苍耳子50-70，黄柏20-40，蛇床子20-40，苦参20-40，白矾50-70，
露蜂房10-20，金银花10-20，银杏叶10-20，白头翁15-25，细辛10-20。
其中，原料的重量份优选为
苍耳子60， 黄柏30， 蛇床子30， 苦参30， 白矾60，
露蜂房15， 金银花15， 银杏叶15， 白头翁20， 细辛15。
在本发明杀菌剂中，为了提高杀菌剂在植物上的附着、乳化、以及提高渗透性，提高杀菌剂的杀菌效果，还可以含有0.05-0.1％杀菌剂重量的吐温，10-20％杀菌剂重量的豆油和1-2％杀菌剂重量的黄腐酸。
本发明杀菌剂可以采用传统中药熬制方法熬制：加水多次熬制，合并提取液继续熬制浓缩即可得到水剂，然后，可以加入表面活性剂、助剂等。
本发明杀菌剂具有广谱抑菌效果，对参试的10种重要植物病原真菌大豆疫霉(Phytophthora sojae)、南瓜疫霉(Phytophthora capsici)、辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、番茄枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、烟草赤星病菌(Alternaria alternata)、玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminicola)和稻瘟病菌(Pyriculariaoryzae)抑菌率均在70％以上，对其中的大豆疫霉、南瓜疫霉、辣椒疫霉和禾谷镰刀菌抑制率高达100％，对其中的烟草赤星病菌和番茄早疫病菌菌丝生长抑制率在90％以上；对病原菌菌丝生长、孢子形成和孢子萌发均具抑制作用；对植物种子萌发和幼苗生长无不良影响，具有壮芽作用；生产贮运方便；强光和高、低温度下药效稳定；具诱导抗病作用，加上其具有的直接杀菌能力，在田间能更好地发挥防病治病作用；对番茄叶霉病兼具预防和治疗双重作用。本发明杀菌剂对番茄叶霉病的接种防治效果为79.36％，田间防治效果为88.29％，与生产上使用的常规化学农药相当；能够诱导番茄植株对叶霉病产生抗病性，加上其具有的直接杀菌能力，使得本发明杀菌剂在田间能够更好地发挥防病治病作用；田间实验表明，本发明杀菌剂对番茄叶霉病的平均防效为77％，基本能够替代生产上使用的常规化学农药。由于其具有广谱抑菌活性，再加上配方的各个组分均为中医药方中的常用药，所以对人和植物高度安全，经过进一步应用试验和配方调整，应用范围将进一步扩大到更多作物的更多病害，在AA级绿色食品生产中发挥更大作用。
本发明杀菌剂使用结果表明，具有如下优点：
(1)在防治效果上优于活体微生物类杀菌剂：该中草药杀菌剂为纯中草药成分，活性成分为纯化学成分，加上助剂的作用，施用后立即发挥作用，不存在环境适应性问题，也不受环境条件的影响，因而在田间应用见效快，效果好，这一点优于活体微生物杀菌剂；
(2)在抑菌谱和防治效果方面优于已报道的中草药单剂：试验结果表明，与中草药单剂相比，混剂的抑菌谱大大拓宽，抑菌效果大大提高，两种助剂的加盟更起到了增效作用，使得田间防治效果更好；已报道的中草药单剂由于活性成分单一，又不加助剂，所以防治谱窄，防效低；
(3)所具有的诱导抗病作用使其更具应用价值：研制的中草药农用杀菌剂对番茄叶霉病具有诱导抗病作用，这也是该制剂在田间表现高效防病治病作用的重要原因之一和理论依据所在，这一点是其他生物杀菌剂所不能比拟的；
(4)无毒无残留使其可应用于AA级绿色食品生产：配方中的各个组分均为中医药方中的常用药和对人体无害的成分，对人和植物高度安全，无毒无残留，应用该制剂后番茄果实在食用时口感好，无药味，这一点优于常规化学农药。
附图说明
图1为杀菌剂LS-1对9种植物病原真菌菌丝生长抑制率的变化图；
图2为杀菌剂LS-1对4种植物病原真菌孢子(囊)萌发抑制率的变化；
图3为温室条件保存对杀菌剂LS-1药效的影响；
图4为杀菌剂LS-1对三种蔬菜种子发芽率的影响；
图5为经杀菌剂LS-1处理后植株幼苗株高的变化；
图6为杀菌剂LS-1诱导对番茄叶片中PAL活性的影响；
图7为杀菌剂LS-1诱导对番茄叶片中PAL活性变化率的影响；
图8为杀菌剂LS-1诱导对番茄叶片中POD活性的影响；
图9为杀菌剂LS-1诱导对番茄叶片中POD活性变化率的影响；
图10为杀菌剂LS-1诱导对番茄叶片中PPO活性的影响；
图11为杀菌剂LS-1诱导对番茄叶片中PPO活性变化率的影响。
具体实施方式
实施例1、杀菌剂的配制
取苍耳子60克，黄柏30克，蛇床子30克，苦参30克，白矾60克，露蜂房15克，金银花15克，银杏叶15克，白头翁20克和细辛15克，按传统中药熬制方法熬制：混合后依次加水2000ml、1000ml和1000ml，熬3遍，每遍熬制到200～300ml，3遍滤液合并加热浓缩至500ml制成水剂，经多层纱布过滤后再经细菌滤器过滤除菌，即得到杀菌剂LS-1。
实施例2、杀菌剂的毒力测定
1、材料
1.1、供试材料
供试菌株 大豆疫霉(Phytophthora sojae)、南瓜疫霉(Phytophthora capsici)、辣椒疫霉(Phytophthora capsici)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、番茄枯萎病菌(Fusarium oxysporum Schlecht.)、烟草赤星病菌(Alternaria alternata)、玉米大斑病(Exserohilum turcicum)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminicola)和稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)均为常见商业菌株。
1.2、供试药剂
30％枯萎灵可湿性粉剂 深圳市瑞德丰农药有限公司
50％多菌灵可湿性粉剂 河南省孟州市平原农药有限责任公司
58％瑞毒霉可湿性粉剂 英国诺普倍集团深圳市诺普倍农化有限公司
甲基托布津可湿性粉剂 海利贵溪化工农药有限公司出品
克露可湿性粉剂 E.1.DUPONT DE NEMOURS AND COMPANY
大蒜素乳油 山东济南化工厂
杀菌剂LS-1
2、试验方法
抑菌测定——生长速率法 将杀菌剂LS-1作为母液，加入盛有定量培养基的三角瓶中(事先已融化好)，使浓度达到规定浓度，倒平板。用打孔器取待测植物病原菌菌丝圆片置平板中央，每皿1片，每处理3次重复，以无菌水为空白对照。72h观察并测量记录菌落直径，计算菌丝生长抑制率。
3、结果与分析
结果见表1和图1。由表1和图1可以看出，当LS-1浓度为0.03g/ml时，对所有供试菌菌丝生长抑制率均达到70％以上，其中对大豆疫霉、南瓜疫霉、辣椒疫霉、禾谷镰刀菌的抑制率达到了100％；当LS-1浓度为0.05g/ml时，对番茄灰霉病菌、烟草赤星病菌、番茄枯萎病菌和番茄早疫病菌菌丝生长抑制率分别为86.24％、90.96％、75.04％和97.94％。从室内抑菌效果看，LS-1杀菌谱较广。特别是对疫霉属(Phytophthora)真菌具有极好的抑菌效果。
表1 不同浓度的杀菌剂LS-1对9种植物病原真菌菌丝生长的影响
| 植物病原真菌 | 药剂浓度(g/ml) | 菌落直径(cm) | 抑制率(％) |
| 大豆疫霉 | CK | 2.16 | - |
| 0.010.020.030.05 | 0.45000 | 79.14100100100 | |
| 南瓜疫霉Phytophthoracapsici | CK0.010.020.030.05 | 4.243.581.6100 | -15.6262.08100100 |
| 辣椒疫霉Phytophthoracapsici | CK0.010.020.030.05 | 4.854.341.9400 | -10.560.02100100 |
| 番茄早疫病菌Alternaria solani | CK0.010.020.030.05 | 3.901.880.630.260.08 | -51.7983.7693.2497.94 |
| 番茄枯萎病菌FusariumoxysporumSchlecht. | CK0.010.020.030.05 | 4.032.631.451.101.00 | -34.7163.9672.5675.04 |
| 烟草赤星病菌Alternariaalternata | CK0.010.020.030.05 | 3.542.741.150.680.32 | 22.567.4280.690.96 |
| 玉米大斑病菌Exserohilumturcicum | CK0.010.020.030.05 | 5.353.912.721.471.64 | -26.8549.1572.3969.28 |
| 番茄灰霉病菌 | CK | 6.61 | - |
| 0.010.020.030.05 | 1.781.761.220.91 | 73.0973.3981.5786.24 | |
| 禾谷镰刀菌Fusariumgraminicola | CK0.010.020.030.05 | 2.400.950.3700 | -60.4784.32100100 |
注：菌落直径为3次重复的平均值
实施例3、杀菌剂对植物病原菌孢子(囊)形成和萌发的影响
1、供试材料
黄瓜霜霉病菌(Pseudoperonospora cubensis)、辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)、番茄枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、烟草赤星病菌(Alternariaalternata)、稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)，均为商业菌株。
2、试验方法
供试药剂对孢子(囊)萌发的影响：将待测植物病原菌孢子或孢子囊配成每10倍视野中50～60个孢子，再用孢悬液对化学药剂进行稀释，稀释前将供试化学药剂配成150的母液，然后按计算好的2ml中需加入的药剂量，用孢子悬浮液稀释至2ml并加入24孔细胞培养板板孔中，以不加药剂的菌悬液为对照，盖上盖放入恒温培养箱中培养24h或48h后调查并计算孢子萌发率。
供试药剂对辣椒疫霉孢子囊形成的影响：将培养好的辣椒疫霉平板用打孔器打成菌片，放在CA平板中央，培养5d后以菌片为中心用打孔器打成菌片(主要为了菌龄一致)，分别放在含杀菌剂LS-1浓度为0.01g/ml、0.03g/ml、0.05g/ml药液的培养皿中，以化学药剂百菌清(0.00125g/ml)和瑞毒霉(0.00125g/ml)作对照，每皿加10ml药液，3片菌片，空白对照加10ml无菌水，重复3次，72h后调查孢子囊形成情况，计算抑制率，同时观察菌丝生长状态。
3、结果与分析
3.1杀菌剂LS-1对几种植物病原菌孢子(囊)萌发的影响
结果见表2和图2。由表2和图2可以看出，LS-1在浓度为0.01g/ml、0.03g/ml和0.05g/ml时，对番茄枯萎病菌孢子萌发抑制率均在90％以上，与枯萎灵(0.00125g/ml)差异不显著；LS-1在浓度达到0.05g/ml时，对烟草赤星病菌孢子萌发的抑制率达到90.00％，与多菌灵(0.001g/ml)差异不显著；LS-1在浓度为0.05g/ml时，对辣椒疫霉孢子囊萌发的抑制率达到89.26％，与瑞毒霉(0.00125g/ml)差异不显著；LS-1在浓度为0.05g/ml时，对稻瘟病菌孢子萌发的抑制率达到92.89％，与甲基托布津(0.00125g/ml)相比差异不显著。
由以上数据可见，当LS-1药剂浓度达到0.05g/ml时对4种供试植物病原真菌孢子(囊)的萌发抑制率均与常用化学药剂相当。
表2 杀菌剂LS-1对4种植物病原真菌孢子(囊)萌发的影响
| 植物病原真菌 | 药剂 | 浓度(g/ml) | 萌发率(％) | 抑制率(％) | 显著水平 | |
| 5％ | 1％ | |||||
| 番茄枯萎病菌FusariumoxysporumSchlecht. | CKLS-1LS-1LS-1枯萎灵 | -0.010.030.050.00125 | 63.334.332.331.331.33 | -93.1696.3297.9097.90 | abbbb | ABBBB |
| 烟草赤星病菌Alternariaalternata | CKLS-1LS-1LS-1多菌灵 | -0.010.030.050.001 | 66.6718.3313.336.675 | -72.5180.0190.0092.50 | abbcc | ABBCC |
| 辣椒疫霉Phytophthora capsici | CKLS-1LS-1LS-1瑞毒霉 | -0.010.030.050.00125 | 6818157.31 | -73.5377.9489.2698.53 | abbcd | ABBCC |
| 稻瘟病菌Pyriculariaoryzae | CKLS-1LS-1LS-1甲基托布津 | -0.010.030.050.00125 | 65.6711.675.334.671.33 | -82.2391.8892.8997.97 | abccc | ABBCBCC |
注：孢子的萌发率为3次重复的平均值
3.2、LS-1对辣椒疫霉孢子囊形成的影响
结果见表3。由表3可以看出，LS-1在浓度为0.01g/ml、0.03g/ml和0.05g/ml时，对辣椒疫霉孢子囊产生的抑制率均为100％，与百菌清(0.00125g/ml)、瑞毒霉(0.00125g/ml)无显著差异。
表3 杀菌剂LS-1对辣椒疫霉孢子囊形成的影响
| 药剂 | 浓度 | 萌发率(％) | 抑制率(％) |
| CKLS-1LS-1LS-1百菌清瑞毒霉 | -0.010.030.050.001250.00125 | 75.6600000 | -100100100100100 |
注：孢子囊萌发率为3次重复的平均值
实施例4、杀菌剂的稳定性测定
1、供试材料
立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kuhn.)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminicola)、辣椒疫病菌(Phytophthora capsici)、番茄枯萎病菌(Fusarium oxysporum Schlecht.)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、大豆疫霉(Phytophthora sojae)、玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum)、烟草赤星病(Alternaria alternata)，均为商业菌株。
3、试验方法
3.1冷冻和高温对LS-1药效的影响
对药剂LS-1分别进行冰冻(-20℃)处理168h、湿热(121℃)处理30min及常温下存放168h，以无菌水为空白对照，然后进行室内抑菌试验，计算菌丝生长抑制率，分析差异显著性。
3.2LS-1持效期的测定
配制一批药剂，常温下阴暗处保存，每间隔一定时间对该药剂进行室内抑菌测定，以无菌水为空白对照，分析差异显著性。
3.3温室条件(六月份)保存对LS-1药效的影响
将LS-1置于磨口瓶中放在温室环境条件(六月份)下，经168h、120h、72h、0h及空白CK的处理后，进行室内抑菌测定。
4、结果与分析
4.1冷冻和高温对LS-1药效的影响
结果见表4。由表4可见，LS-1经过冰冻(-20℃)168h、湿热(121℃)处理30min及常温(25℃)处理后，但对南瓜疫霉、大豆疫霉、番茄枯萎病菌和禾谷镰刀菌的菌丝生长抑制率与常温保存无显著差异；但对玉米大斑病菌、番茄早疫病菌和烟草赤星病存在一定的差异，其机制有待进一步研究。
表4 温度处理对LS-1药效的影响
| 植物病原真菌 | 处理方式 | 菌落直径(cm) | 抑制率(％) | 显著水平 | |
| 5％ | 1％ | ||||
| 烟草赤星病Alternariaalternata南瓜疫霉Phytophthora capsici番茄早疫病菌Alternariasolani番茄枯萎病菌FusariumoxysporumSchlecht.大豆疫霉Phytophthora sojae玉米大斑病菌Exserohilumturcicum | CKMoist heat(121℃15磅)common temperature(25℃)Freeze(-20℃)CKcommon temperature(25℃)Freeze(-20℃)Moist heat(121℃15磅)CKMoist heat(121℃15磅)common temperature(25℃)Freeze(-20℃)CKMoist heat(121℃15磅)common temperature(25℃)Freeze(-20℃)CKcommon temperature(25℃)Freeze(-20℃)Moist heat(121℃15磅)CKcommon temperature(25℃)Moist heat(121℃15磅)Freeze(-20℃) | 3.031.000.800.655.760.000.000.003.261.110.860.693.481.921.531.475.940.000.000.004.792.642.422.19 | -66.9273.6378.68-100100100-65.8173.3878.81-44.7856.1757.61-100100100-44.7849.4454.17 | abbccabbbabcdabbbabbbabcd | ABBBABBBABCDABBBABBBABCD |
| 禾谷镰刀菌Fusariumgraminicola | CKMoist heat(121℃15磅)common temperature(25℃)Freeze(-20℃) | 2.830.380.000.00 | -86.57100100 | abbb | ABBB |
注：菌落直径为3次重复的平均数
4.2 LS-1持效期的测定
结果见表5。由表5可以看出，LS-1在浓度为0.03g/ml时，对烟草赤星病菌、番茄枯萎病菌、辣椒疫霉、大豆疫霉及南瓜疫霉抑菌效果在九个月内的变化差异不显著。但对番茄早疫病菌在九个月内的变化差异显著，有待于进一步研究。
表5 杀菌剂LS-1持效期的测定
| 植物病原真菌 | 测定日期(月、日) | 菌落直径(cm) | 显著水平 | |
| 5％ | 1％ | |||
| 烟草赤星病Alternariaalternaia | 4.26.29.21.2 | 0.1650.40.360.39 | BAAA | baaa |
| 番茄枯萎病菌Fusariumoxysporum | 4.26.29.21.2 | 0.2550.3650.250.205 | AAAA | aaaa |
| 番茄早疫病菌Alternaria solani | 4.26.29.21.2 | 0.0700.470.41 | EFAB | cdaa |
| 辣椒疫霉Phytophthoracapsici | 4.26.29.21.2 | 0000 | AAAA | aaaa |
| 大豆疫霉Phytophthorasojae | 4.26.29.21.2 | 0000 | AAAA | aaaa |
| 南瓜疫霉Phytophthoracapsici | 4.26.29.21.2 | 0000 | AAAA | aaaa |
4.3温室条件(六月份)对LS-1药效的影响
结果见表6和图3。由表6和图3可以看出，杀菌剂LS-1在温室条件(六月份)下分别存放168h、120h、72h、0h后，对辣椒疫霉、番茄枯萎病菌、水稻稻瘟病菌、大豆疫霉和禾谷镰刀菌的抑菌效果无显著差异，但可以看出随着时间的延长，抑菌效果有下降趋势。对番茄枯萎病、烟草赤星病菌的抑制率发生了变化，但并不是呈规律性变化，其机制有待于进一步研究。
表6 温室条件保存对杀菌剂LS-1药效的影响
| 植物病原真菌 | 处理时数 | 菌落直径(cm) | 抑制率 | 显著水平 | |
| 0.05 | 0.01 | ||||
| 辣椒疫霉Phytophthora capsici | CK168h0h120h72h | 7.221.911.701.641.60 | -73.5576.4577.2977.84 | abbbb | ABBBB |
| 番茄枯萎病菌FusariumoxysporumSchlecht. | CK0h72h168h120h | 5.423.173.142.772.74 | -41.5242.0148.8949.45 | abcbccc | ABBBB |
| 水稻稻瘟病菌Pyriculariaoryzae | CK72h0h120h168h | 2.601.441.391.361.35 | -44.6246.5447.7048.08 | abbbb | ABBBB |
| 大豆疫霉Phytophthora sojae | CK0h72h120h168h | 3.510000 | -100100100100 | abbbb | ABBBB |
| 烟草赤星病菌Alternariaalternata | CK0h72h168h120h | 4.252.952.311.931.58 | -30.5945.6554.5962.82 | abccdd | ABCCDCD |
| 禾谷镰刀菌Fusariumgraminicola | CK72h0h120h168h | 2.751.131.121.071.06 | -58.9159.2761.1161.45 | abbbb | ABBBB |
实施例5、杀菌剂对种子发芽及植株幼苗生长的影响
1供试材料
种子及幼苗 番茄-东农704、辣椒-台湾盖世羊角椒、黄瓜-长春密刺
2试验方法
2.1 LS-1对植物种子发芽的影响
以辣椒、番茄和黄瓜为供试植物，选取健康无病种子30粒为1组，共3组，分别用10％LS-1和加入10％生化黄腐酸的LS-1(生化黄腐酸与IS-1重量比1∶10)(简称生LS-1)浸种20min，无菌水作对照。将处理后的种子平铺于有三层纱布的平皿底部，每皿加10ml无菌水保湿，置24℃恒温箱中培养。种子萌发后，调查并计算种子萌发率，观察种子外部形态是否异常。
2.2 LS-1对植株幼苗生长的影响
以辣椒、番茄和黄瓜为供试植物，育苗并移栽至培养钵中，6-8叶期喷药处理，LS-1设置四个浓度，分别为0.01g/ml、0.02g/ml、0.03g/ml和0.05g/ml，以清水为空白对照，每处理20株，第一次喷药前测株高，每隔7天喷药1次，每次喷药前测量株高，共测四次，观察株高和植株形态变化，分析各处理株高与对照相比是否存在显著性差异。
3结果与分析
3.1 LS-1对植物种子发芽的影响
结果见表7和图4。由表7和图4可以看出，浓度为10％的LS-1及生LS-1对黄瓜、辣椒和番茄种子发芽率没有影响，与CK无显著差异。浓度为10％的LS-1与生LS-1处理对黄瓜、辣椒和番茄幼芽生长(芽势)有一定的促进作用。
表7 LS-1对三种蔬菜种子发芽率的影响
| 供试植物 | 药剂 | 浓度(g/ml) | 供试种子(萌发种子数) | 发芽率(％) | 显著水平 | |
| 5％ | 1％ | |||||
| 黄瓜 | LS-1CK生LS-1 | 0.1-0.1 | (90)90(90)87(90)87 | 10096.6795.57 | aaa | AAA |
| 辣椒 | 生LS-1LS-1CK | 0.10.1- | (90)72(90)72(90)69 | 78.9078.9077.77 | aaa | AAA |
| 番茄 | CKLS-1生LS-1 | -0.10.1 | (90)78(90)75(90)72 | 86.6784.4381.10 | aaa | AAA |
注：种子萌发率为3次重复的平均值
3.2 LS-1对幼苗生长发育的影响
结果见表8和图5。由表8和图5可见，用浓度为0.01g/ml、0.02g/ml、0.03g/ml、0.05g/ml的LS-1四次处理幼苗，其株高没有异常变化，并且各个处理间及与空白对照并无显著差异，说明此药剂在供试浓度范围内对幼苗没有伤害。
表8 LS-1对植株幼苗株高的影响
| 供试植物 | 药剂 | 浓度(g/ml) | 株高平均数(cm) | 显著水平 | |
| 5％ | 1％ | ||||
| 黄瓜番茄辣椒 | LS-1LS-1LS-1CKLS-1LS-1LS-1LS-1LS-1CKCKLS-1LS-1LS-1LS-1 | 0.030.020.01-0.050.030.050.020.01--0.030.050.020.01 | 12.3411.8411.4911.0711.0220.5420.0819.9319.7619.5112.7712.2212.0211.8911.81 | aaaaaaaaaaaaaaa | AAAAAAAAAAAAAAA |
注：植株株高为四次测量的平均值
实施例6、杀菌剂对番茄叶霉病诱导抗病性研究
1、化学药品及仪器设备
供试药剂 用于防御酶活性测定的化学药剂：巯基乙醇、磷酸缓冲液(pH6.0)、愈创木酚、硼酸缓冲液(pH8.8)、L-苯丙氨酸、邻苯二酚。
试验用仪器设备UV1601紫外分光光度计；PB303电子天平；Biofuge Stratos全能台式高速冷冻离心机；CK2倒置显微镜；HC冰箱；冰柜。
2、试验方法
试验用番茄品种为早粉二号，于温室中育苗并移栽至营养钵内，每钵内只栽一株，常规肥水管理。诱导物为20.00g/L的LS-1，接种菌为Fulvia fulva(Cookee)Ciferri(接种叶霉菌孢子浓度为2×104个/ml)。本试验共设诱导、挑战接种(诱导处理后接种)、清水对照和接种4个处理，在番茄幼苗4～5叶期进行诱导，诱导后2d叶面喷雾接种，保湿48h。诱导后1d、4d、7d、10d、13d、16d取样，共6次，于-20℃冰柜保存备用。
2.1苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性测定
分别取各处理番茄叶片0.5g，加入5ml 0.05M硼酸缓冲液(含5mM巯基乙醇和0.5％聚乙烯吡咯烷酮(PVP))，再加入少量石英砂在预冷的研钵中研磨，样品在离心机上离心(10000rpm，4℃)30min，上清液为酶粗提液，取上清液加缓冲液定容至10ml，用吸管将定容酶液分装于Eppendorff管中，贴好标签放入-20℃冰箱中备用。
酶活性的测定参照Mozzetti(1995)的方法，0.2ml酶粗提液加2ml 0.02mM的L-苯丙氨酸，4ml缓冲液，总体积为6.2ml。对照用0.2ml缓冲液代替酶液，反应液置恒温水浴锅中30℃保温。30min后用UV1601紫外分光光度计测定OD290nm。每个样品及对照均3次重复，取平均值。
酶活性计算公式：
PAL活性(ΔOD290nm/g.rpm.cm.min)＝(ΔOD290nm×N)/(W×T×n×d×0.01)
N-酶粗提液总体积(ml)，W-样品鲜重(g)，T-反应时间(min)，
n-反应液所用酶粗提液的体积(ml)，d-比色杯直径(cm)。
对照接种变化率(％)＝100×(A1-A0)/A0
A1-接种后供试叶片PAL活性(ΔOD290nm/g.frw.min.cm)，
A0-对照植株PAL活性(ΔOD290nm/g.frw.min.cm)。
诱导变化率(％)＝100×(A′1-A0)/A0
A′1诱导后供试叶片PAL活性(ΔOD290nm/g.frw.min.cm)，
A0-对照植株PAL活性(ΔOD290nm/g.frw.min.cm)。
诱导接种变化率(％)＝100×(A″1-A0)/A0
A″1-诱导接种后供试叶片PAL活性(ΔOD290nm/g.frw.min.cm)，
A0-对照植株PAL活性(ΔOD290nm/g.frw.min.cm)。
2.2过氧化物酶(POD)活性的测定
取各处理番茄叶片0.5g，加入5ml 0.5mM磷酸缓冲液(pH6.0，内含少量PVP及15mM巯基乙醇)，再加入少量石英砂在冰冻的研钵中研磨至匀浆，样品在离心机上离心(4000rpm，4℃)20min，上清液为酶粗提液，取上清液加缓冲液定容至10ml，用吸管将定容酶液分装于Eppendorff管中，贴好标签放入-20℃冰箱中备用。
参考Hammerschmidt(1982)的愈创木酚方法测定POD的活性，反应组成液为：5ml 10mM磷酸缓冲液，0.2ml 0.25％W/V愈疮木酚，0.2ml 100mMH2O2和200μL酶粗提液，25℃下反应10min后立即用UV1601紫外分光光度计测定OD470nm。每个样品及对照均3次重复，取平均值。
酶活计算公式：
POD活性(ΔOD470nm/g.rpm.cm.min)＝(ΔOD470nm×N)/(W×T×n×d)
N-酶粗提液总体积(ml)，W-样品鲜重(g)，T-反应时间(min)，
n-反应液所用酶粗提液的体积(ml)，d-比色杯直径(cm)。
变化率计算公式参见PAL变化率计算公式。
2.3多酚氧化酶(PPO)的活性测定
取各处理番茄叶片0.5g，加入5ml 0.2mM磷酸缓冲液和少许石英砂，在预冷的研钵中研磨至匀浆，样品在离心机上离心(15000rpm，4℃)20min，上清液为酶粗提液，加缓冲液定容至10ml，用吸管将定容酶液分装于Eppendorff管中，贴好标签放入-20℃冰箱中备用。
在试管中加入6ml 0.2M pH6.0磷酸缓冲液和200μL PPO酶提取液，混匀后于30℃水浴中保温10min，然后加入2ml 0.2M邻苯二酚溶液，立即计时，混匀后用UV1601紫外分光光度计测定反应2min的OD398nm值。每个样品及对照均3次重复，取平均值。
酶活计算公式：
PPO活性(ΔOD398nm/g.rpm.cm.min)＝(ΔOD398nm×N)/(W×T×n×d)
N-酶粗提液总体积(ml)，W-样品鲜重(g)，T-反应时间(min)，
n-反应液所用酶粗提液的体积(ml)，d-比色杯直径(cm)。
变化率计算公式参见PAL变化率计算公式。
3结果与分析
3.1苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性测定
番茄植株经杀菌剂LS-1诱导、接种处理后苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性测定结果列于表9和图6、图7。
从表9和图6可以看出，各处理PAL活性高于对照，其中诱导和诱导+挑战表现出相似的变化规律，在处理7d时产生PAL活性高峰，7d后PAL活性下降，在7d-16d期间保持平稳。而接种处理在10d时才出现PAL活性高峰，比诱导和诱导+挑战出现的活性高峰晚3d，但其峰值高达171.33，接近于诱导+挑战的峰值171.67。诱导处理7d时的峰值为155.42，分别比诱导+挑战和对照接种的峰值低16.25和15.91个酶活单位。
由表9和图7可以看出，各处理PAL活性变化率表现出与PAL活性变化类似的趋势，诱导和诱导+挑战在7d时出现变化率高峰，比对照接种出现变化率高峰早了3d，初步说明LS-1的诱导使番茄体内的PAL活性提前达到高峰，加强植株的苯丙烷类的代谢，从而达到防病作用。
表9 LS-1诱导对番茄叶片中PAL活性的影响
| 时间(d) | PAL活性(OD470nm/g.rpm.cm.min) | PAL活性变化率(％) | |||||
| 对照CK | 接种 | 诱导 | 诱导+挑战 | 接种 | 诱导 | 诱导+挑战 | |
| 147101316 | 90.53120.42121.25110.58107.83106.08 | 89.33124.92125.92171.33123.08130.42 | 94.08121.58155.42123.67126.58113.33 | 102.17120.25171.67116.17125.75118.58 | -1.333.743.8554.9414.1422.94 | 3.920.9628.18118417.396.83 | 12.86-0.1441.585.0616.6211.78 |
3.2过氧化物酶(POD)活性的测定
番茄经LS-1诱导、接种处理后过氧化物酶(POD)活性测定结果列于表10和图8、图9。
从表10可以看出，各处理POD活性均明显高于对照，诱导、两导+挑战和接种均在7d时出现POD活性高峰，且活性高峰诱导+挑战＞接种＞诱导。诱导和诱导+挑战在1d～7d期间POD活性均呈直线上升，只是诱导的增幅(0.33个酶活单位)比诱导+挑战的增幅(0.72个酶活单位)缓慢(见图8)。各处理POD活性达到最高值后迅速下降，此后接种与诱导+挑战表现出相似的变化趋势，但诱导+挑战的POD活性自始至终高于接种。POD活性变化率表现为诱导+挑战与接种趋势基本相同，但诱导变化率始终高于接种(见图9)，初步说明LS-1可以诱导番茄体内的POD较高活性的表达，如果在病原菌侵入前进行诱导处理会显著提高POD活性，增强番茄对病原菌的抗性。
表10 杀菌剂LS-1诱导对番茄叶片中POD活性的影响
| 时间(d) | POD活性(OD470nm/g.rpm.cm.min) | POD活性变化率(％) | |||||
| 对照CK | 接种 | 诱导 | 诱导+挑战 | 接种 | 诱导 | 诱导+挑战 | |
| 147101316 | 0.991.141.181.171.140.98 | 1.151.301.801.161.101.18 | 1.191.341.521.301.180.98 | 1.211.621.931.331.221.26 | 16.1642.1152.54-0.85-3.5120.41 | 20.2017.5428.8111.113.510.00 | 22.2214.0463.5613.687.0228.57 |
8.3.4多酚氧化酶(PPO)的活性测定
番茄经LS-1诱导、接种处理后多酚氧化酶(PPO)活性测定结果列于表11和图10、图11。
从表11和图10中可以看出，各处理PPO活性均高于对照，但差距不是很大，而且变化趋势相对平缓，其中诱导处理的PPO活性变化最为平缓，极值仅为1.4个酶活单位。接种与诱导+挑战的PPO活性变化趋势相似，都是在7d时出现酶活性高峰，且诱导+挑战(14.70酶活单位)＞接种(13.60酶活单位)，但是诱导+挑战PPO活性在10d后变化趋于平缓，而接种则有较大的起伏。由表11和图11可见，诱导+挑战能够保持较高的且稳定的PPO活性变化率，而接种有很大的起伏。可以初步说明LS-1能够诱导提高番茄的PPO活性。
表11 LS-1诱导对番茄叶片中PPO活性的影响
| 时间(d) | PPO活性(OD398nm/g.rpm.cm.min) | PPO活性变化率(％) | |||||
| 对照CK | 接种 | 诱导 | 诱导+挑战 | 接种 | 诱导 | 诱导+挑战 | |
| 147101316 | 10.1010.6512.3010.4510.6510.85 | 10.1010.5513.6012.7510.9012.80 | 11.9012.0513.3013.1513.2012.75 | 11.0012.2014.7011.6511.9511.90 | 0.00-0.9410.5722.012.3017.97 | 17.8213.158.1325.8423.9417.51 | 8.9114.5519.5111.4812.219.68 |
实施例7、加有助剂的杀菌剂对于番茄叶霉病的防治实验
将杀菌剂LS-1与表12中的各助剂按浓度混匀，得到加有助剂的杀菌剂(最终保证杀菌剂LS-1的浓度为0.02g/ml)。
以东农704番茄为供试植物，育苗并移栽至营养钵中，于番茄幼苗4～5叶期采用均匀喷雾法进行人工接种(番茄叶霉菌孢子浓度为2×104个左右/ml)，薄膜保湿培养2d，之后用加有助剂的杀菌剂喷施番茄植株，以清水为空白对照，每处理选用20株苗，重复2次，每7d喷药1次，连喷2次，于第2次施药后3d调查病情，方法为全株叶片进行调查。计算病情指数及防治效果。
取样方法为每处理所有植株均调查，以复叶上的每个小叶片病斑面积占整个小叶片面积百分率分级。番茄采用育苗后移栽至营养钵中种植至7叶1花期移至大棚中。
番茄叶霉病分级标准
0级：叶片上无病班 ；
1级：病斑面积占整个叶片面积的5％以下；
3级：病斑面积占整个叶片面积的6％～10％；
5级：病斑面积占整个叶片面积的11％～20％；
7级：病斑面积占整个叶片面积的21％～50％；
9级：病斑面积占整个叶片面积的50％以上。
根据上述分级标准计算病情指数及防治效果
病情指数＝100×∑(各级病叶数×相对级数值)/(调查总叶数×9)
防治效果(％)＝100×(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数
(以下凡是番茄叶霉病的防治效果及调查均用以上方法和公式)
加有不同助剂浓度的杀菌剂，以清水为对照喷施于番茄幼苗(4-5叶龄)，测量其对番茄幼苗生长的影响，结果列于表12。
表12 两种助剂浓度配比对番茄幼苗株高的影响
| 助剂浓度(g/ml) | 株高平均数(cm) | 显著水平 | ||
| 豆油 | 黄腐酸 | 0.05 | 0.01 | |
| 0.000.0005 | 0.000.00050.00080.00010.0003 | 14.3314.5313.9913.9613.83 | aaaaa | AAAAA |
| 0.001 | 0.00080.00010.00050.0003 | 14.7114.6714.4414.12 | aaaa | AAAA |
| 0.003 | 0.00050.00030.00010.0008 | 14.4414.3614.2814.10 | aaaa | AAAA |
| 0.005 | 0.00080.00050.00030.0001 | 14.5514.4214.2714.12 | aaaa | AAAA |
由表可见，以加有上述两种助剂的杀菌剂处理幼苗，幼苗株高没有异常变化，并且各个处理间及其与空白对照间并无显著差异，说明2种助剂在选用浓度范围内配合使用对番茄幼苗没有伤害。
加有上述两种助剂的杀菌剂对番茄叶霉病的接种防治效果，结果列于表13。由表13可见2种助剂不同配比与杀菌剂LS-1混合使用时，相对于单独使用LS-1防治效果均有所提高，其中豆油(0.003g/ml)+黄腐酸(0.0003g/ml)与豆油(0.003g/ml)+黄腐酸(0.0001g/ml)的防效分别为79.36％和76.34％，显著高于其它配比。
表13 加有助剂的杀菌剂对番茄叶霉病的接种防治效果
| 药剂及助剂 | 病情指数 | 防治效果(％) | 显著水平 | |||
| 助剂浓度(g/ml) | ||||||
| 豆油 | 黄腐酸 | 0.05 | 0.01 | |||
| CKLS-1(0.02) | -0.000.00050.0010.0030.005 | -0.000.000300.000500.000100.000800.000800.000500.000300.000100.000800.000500.000100.000300.000300.000100.000800.00050 | 36.0517.2317.1015.9514.6813.3417.0215.6013.2311.9612.7510.898.537.4416.8316.1814.6812.34 | -52.2152.5755.7659.2863.0052.7956.7363.3066.8264.6369.7976.3479.3653.3155.1259.2865.77 | abbcdefbdfhgijkbceh | ABBCDEFBDFGIGHJKLBBEHI |
实施例8、加有助剂的杀菌剂对番茄叶霉病的田间防治效果
1、材料：
供试品种 东农704
供试药剂
加有助剂的杀菌剂：在杀菌剂LS-1(实施例1制得)中加入0.1％(重量)的吐温，再加入豆油和黄腐酸，得到加有助剂的杀菌剂(杀菌剂LS-1∶豆油∶黄腐酸重量比为200∶30∶3)。
大蒜素乳油 山东济南化工厂
70％甲基托布津可湿性粉剂(海利贵溪化农药有限公司)
70％百菌清百·福超微可湿性粉剂(天津市新农药技术开发研究中心)
九亿丰(哈尔滨科技有限责任公司)
1％脂肽类生物可溶性微颗粒(南京农业大学研制)
伊利特1％可溶性微颗粒剂(南京农业大学研制)
菌克毒克(黑龙江强尔生物技术开发股份有限公司)
BS-208(依天得)
卫保
2、试验方法
以接种叶霉病菌的番茄植株为供试植株，进行接种防治试验，待发病后(每处理选20株苗)进行病情调查，重复2次，计算病情指数及防治效果(计算方法同实施例7)。
3结果与分析
3.1本发明杀菌剂对番茄叶霉病的田间防治试验
在保护地番茄叶霉病发病初期用药，每间隔1周喷药1次。结果见表14。
由表14可见，本发明杀菌剂在浓度为0.04g/ml时对番茄叶霉病的田间防治效果为88.29％，接近于化学药剂甲基托布津(0.00125g/ml)的防治效果91.20％，明显优于大蒜素(0.0005g/ml)的防治效果55.3％。
表14 本发明杀菌剂对番茄叶霉病的田间防治效果
| 药剂 | 浓度(g/ml) | 病叶率(％) | 病情指数(％) | 防治效果(％) |
| CK甲基托布津助LS-1大蒜素 | -0.001250.040.0005 | 637.318.4730.88 | 30.562.693.5813.66 | -91.2088.2955.3 |
实施例9、其他杀菌剂的制备及毒力测定
取苍耳子70克，黄柏20克，蛇床子40克，苦参20克，白矾50克，露蜂房20克，金银花10克，银杏叶20克，白头翁25克和细辛20克，按传统中药熬制方法熬制：混合后依次加水2000ml、1000ml和1000ml，熬3遍，每遍熬制到200-300ml，3遍滤液合并加热浓缩至500ml制成水剂，得杀菌剂LS-2。
采用实施例2的方法，测定杀菌剂LS-2的毒力，得到与实施例1杀菌剂LS-1相同的结果。
实施例10、其他杀菌剂的制备及毒力测定
取苍耳子50克，黄柏40克，蛇床子20克，苦参40克，白矾70克，露蜂房10克，金银花20克，银杏叶10克，白头翁15克和细辛10克，按传统中药熬制方法熬制：混合后依次加水2000ml、1000ml和1000ml，熬3遍，每遍熬制到200-300ml，3遍滤液合并加热浓缩至500ml制成水剂，得杀菌剂LS-3。
采用实施例2的方法，测定杀菌剂LS-3的毒力，得到与实施例1杀菌剂LS-1相同的结果。
Claims (3)
1、一种中草药杀菌剂，含有如下重量份的原料制成的药剂：
苍耳子50-70，黄柏20-40， 蛇床子20-40，苦参20-40， 白矾50-70，
露蜂房10-20，金银花10-20，银杏叶10-20，白头翁15-25，细辛10-20。
2、根据权利要求1所述的中草药杀菌剂，其特征在于：原料的重量份为
苍耳子60，黄柏30， 蛇床子30，苦参30， 白矾60，
露蜂房15，金银花15，银杏叶15，白头翁20，细辛15。
3、根据权利要求1或2所述的中草药杀菌剂，其特征在于：所述杀菌剂中还含有0.05-0.1％杀菌剂重量的吐温，10-20％杀菌剂重量的豆油和1-2％杀菌剂重量的黄腐酸。
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