CN101889585A - 10亿/克抗苯并咪唑类杀菌剂木霉分生孢子颗粒剂及制备方法 - Google Patents

Abstract

10亿/克抗苯并咪唑类杀菌剂木霉分生孢子颗粒剂及制备方法，本发明属于生物农药技术领域，实现高抗苯并咪唑类杀菌剂生防木霉商业化生产，其技术内容分为：1、分生孢子粉制备；2、木霉菌分生孢子颗粒剂及生产工艺；3、该剂型与苯并咪唑类杀菌剂联合应用于植物病害的综合防治方法。本发明颗粒剂有利于病害的防治和减少化学药剂的使用量。在对多种大田作物及蔬菜的立枯病、猝倒病、枯萎病等土传病害的防治试验中，其防治效果80％以上；对环境无污染、对人畜无害；投入低、易于商品化；使用方便、货架期长，保质期一年其孢子萌发率80％以上；同时具有持效期长，并有明显的增产作用，使用量少，化学农药残留量低，价格适中等特点。

Description

10亿/克抗苯并咪唑类杀菌剂木霉分生孢子颗粒剂及制备方法

技术领域

本发明涉及微生物农药，具体涉及是制备含有抗苯并咪唑类杀菌剂微生物木霉孢子颗粒剂及生产工艺。

背景技术

木霉菌生长快，产孢量大，抑制多种植物病原菌，但对苯并咪唑类杀菌剂敏感，在田间施用这类杀菌剂时不能发挥生物防治作用。目前单独使用生防因子来控制作物病害，往往受到环境条件等因素的干扰，造成田间防治效果不稳定，由于对化学农药的敏感性问题长期以来未能解决，使它们不能与化学农药同时应用于植物病害的综合防治。因此，为解决生防菌应用中所面临的问题，实现化学农药与木霉菌的联合使用，提高生防制剂的防治效果，减少化学农药的使用剂量及农药残留。哈尔滨工业大学杨谦等采用基因工程的方法，利用苯并咪唑类杀菌剂抗性基因改造木霉菌，获得了能够稳定遗传的、具有对苯并咪唑类杀菌剂高抗性水平的转化子T_S1(Min Li，Qian Yang.Isolationand characterization of a β-tubulin gene from Trichodermaharzianum.Biochemical genetics，2007，45：529-534.)，将苯并咪唑类杀菌剂抗性基因导入菌株中，可以与苯并咪唑类杀菌剂同时应用于植物病害的综合防治，有利于病害的防治和减少化学药剂的使用量，有效地减少环境污染。木霉菌剂型化有利于生产应用及延长菌剂孢子的货架期。目前急需解决的就是要研发出高效、经济且具备商业化生产与化学杀菌剂同时使用的复合剂型，以提高菌株的生防效果，解决当今我国农业生产中的迫切需求。

发明内容

本发明目的是制备一种具备商业化生产条件的高抗苯并咪唑类杀菌剂生防木霉，将高抗苯并咪唑类杀菌剂生防木霉研制成能用于田间方便使用的颗粒剂型。

本发明颗粒剂制备的工艺过程如下：

一、高抗苯并咪唑类杀菌剂木霉分生孢子粉生产

1、一级斜面培养

将高抗苯并咪唑类杀菌剂木霉采用PDA培养基，培养6-7天。

2、二级液体培养

将上述培养物接种马铃薯葡萄糖糖基液体扩繁，振荡培养24h，即作为固体发酵的种子液。

3、三级固体培养

用开水浸泡低值陈米；然后放入高温灭菌锅灭菌；灭菌后待温度降到25-30℃时，将种子液接入低值陈米培养介质中，放到培养箱培养，12小时光照12小时黑暗交替培养，保湿培养5天，培养至充分产孢即米粒上包裹一层淡绿色的孢子粉。

4、孢子收集

将三级固体培养物，在30℃下通风干燥48h后取出，采用封闭式真菌孢子分离器收获孢子粉，将孢子粉放在密闭容器里，在4℃低温条件保存备用。

二、颗粒剂及制备工艺

1、颗粒剂

本发明的颗粒剂的组分为，海藻酸钠2-4％、硅藻土5-8％、细米粉3-5％、抗苯并咪唑类杀菌剂木霉分生孢子粉0.2％(孢子粉量占以上三组分和的百分比)以及由水补足100％后组成；

该颗粒剂是由海藻酸钠固态高压灭菌，其余成分硅藻土、细米粉和水取上述成分比例拌均匀，高压灭菌冷却后，加入孢子粉搅拌成乳胶液，滴注入葡萄糖酸钙溶液形成胶珠硬化后制成。

2、颗粒剂的制备工艺

①将海藻酸钠2-4％固态高压灭菌，其余成分硅藻土5-8％、细米粉3-5％以及由水补足100％后，加入搅拌器搅拌均匀，高压灭菌；

②将上述混合物灭菌后冷却到30℃时，加入0.2％的孢子粉(孢子粉量占海藻酸钠、硅藻土、细米粉三组分和的百分比)，搅拌均匀，即制成乳胶液。

③将乳胶液放入灭菌滴注器内滴注，使滴注的乳胶液落入0.1M高压灭菌的葡萄糖酸钙溶液中，由于表面张力的作用，落入葡萄糖酸钙溶液后呈球形，搅拌待胶珠硬化后滤出。

④干燥后装入包装袋中，20℃以下温度贮藏，贮藏期为一年。

本发明优点是生产工艺简单、易于控制、成本低廉、是一种理想的防治植物土传病害生物农药，使用方法：可以拌种穴施、苗床处理。同时具有持效期长，并有明显的增产作用，防效80％以上；对环境无污染、对人畜无害、投入低、易于商品化；使用量少，化学农药残留量低，价格适中等特点。保质期一年。

具体实施方式

一、高抗苯并咪唑类杀菌剂分生孢子粉生产

1、一级斜面培养

将高抗苯并咪唑类杀菌剂木霉采用PDA培养基，培养6-7天。

2、二级液体培养

将上述培养物接种马铃薯葡萄糖糖基液体扩繁，振荡培养(28±1℃，200r/min)24h，作为固体发酵的种子液。

3、三级固体培养

用开水浸泡低值陈米，时间最佳值为8-10分钟；然后放入高温灭菌锅灭菌，其灭菌最佳温度值为105℃、最佳时间值为8-10分钟；待温度降到25-30℃时，将种子液接入低值陈米培养介质中，其种子液与米的最佳比例为1∶10，放到培养箱培养，最佳温度28℃，12小时光照12小时黑暗交替培养，保湿培养5天，培养至充分产孢即米粒上包裹一层淡绿色的孢子粉。

4、孢子收集

将三级固体培养物，在30℃下通风干燥48h后取出，采用封闭式真菌孢子分离器MycoHarvester收孢机收获孢子粉，在4℃低温条件保存备用。

本发明的生产工艺满足因地取材、成本低廉、简便易行及质量保证的原则，也能解决企业生产中车间粉尘飘逸的要求。每公斤陈米可产40克孢子粉，故经济实用。该工艺生产的孢子粉质量达到微生物农药的企业生产标准，为进一步制剂加工提供保证。

5、质量检测

①含孢量的测定

将0.001克样品加入50mL 0.5％Tween 80溶液中，磁力搅拌30min，用血球计数板测定孢子悬液浓度，计算样品的含孢量，重复5次。

②活孢率的测定

将0.001克样品加入含2％蔗糖和0.5％蛋白胨50mL萌发液中。将孢子液在28士1℃下振荡(120r/min)培养20h，取样用血球计数，重复5次。

③水分的测定

参照GB/T1600-2001共沸蒸馏法

按此工艺生产木霉孢子粉，可获得含孢量500亿/克左右、含水量控制在5％以下的孢子粉产品。活孢率90％以上。

6、贮存

将孢子粉放在密闭容器里，在4℃低温条件保存备用。

二、颗粒剂制备工艺

1、将海藻酸钠2-4％固态高压灭菌(最佳温度值为121℃、最佳时间值为20分钟)，其它成分硅藻土5-8％、细米粉3-5％以及由水补足100％后加入搅拌器搅拌均匀高压灭菌(最佳温度值为121℃、最佳时间值为20分钟)；

2、将上述混合物灭菌后冷却到30℃时，加入0.2％(孢子粉量占海藻酸钠、硅藻土、细米粉三组分和的百分比)的孢子粉，搅拌均匀即制成乳胶液。

3、将上述乳胶液放入孔口直径最佳值为2mm的灭菌滴注器内滴注，使滴注的乳胶液落入0.1M高压灭菌的葡萄糖酸钙溶液中，颗粒由于表面张力的作用，落入葡萄糖酸钙溶液后呈球形，搅拌待胶珠硬化后滤出。

4、干燥后装入包装袋中，20℃以下温度贮藏，贮藏期为一年。

5、质量检测

将颗粒溶解在0.087M磷酸二氢钾和0.03M磷酸氢二钠混合溶液中，在PDA培养基上培养估测孢子萌发率，萌发率为80.5％。

生产应用

本发明的颗粒剂与苯并咪唑类杀菌剂多菌灵(1∶1比例)混合应用于植物病害的综合防治，有利于病害的防治和减少化学药剂的使用量，有效地减少环境污染。经田间试验，对瓜类枯萎病、水稻立枯病、番茄幼苗的猝倒病等多种土传病害有较好的防治效果，其防治效果80％以上，还有提高植物的抗逆性、促进植物生长的作用。其使用方法为本发明的颗粒剂与苯并咪唑类杀菌剂多菌灵以1∶1混合，穴施，用量为0.5-1.0克/穴。

Claims (8)

1.一种10亿/克抗苯并咪唑类杀菌剂木霉分生孢子颗粒剂，其特征是：其颗粒剂的组分为，海藻酸钠2-4％、硅藻土5-8％、细米粉3-5％、抗苯并咪唑类杀菌剂木霉分生孢子粉0.2％(孢子粉量占以上三组分和的百分比)以及由水补足100％；

颗粒剂是由海藻酸钠固态高压灭菌，其余成分硅藻土、细米粉和水按上述比例搅拌均匀，高压灭菌冷却后，加入孢子粉搅拌成乳胶液，滴注入葡萄糖酸钙溶液形成胶珠，硬化后制成。

2.一种制造权利要求1的颗粒剂制备工艺，其特征是：

①将海藻酸钠2-4％固态高压灭菌，其余成分硅藻土5-8％、细米粉3-5％以及由水补足100％后，加入搅拌器搅拌均匀，高压灭菌；

②将上述混合物灭菌后冷却到30℃时，加入0.2％的孢子粉(孢子粉量占海藻酸钠、硅藻土、细米粉三组分和的百分比)，搅拌均匀，即制成乳胶液；

③将乳胶液放入灭菌滴注器内滴注，使滴注的乳胶液落入0.1M高压灭菌的葡萄糖酸钙溶液中，由于表面张力的作用，落入葡萄糖酸钙溶液后呈球形，搅拌待胶珠硬化后滤出；

④干燥后装入包装袋中，20℃以下温度贮藏，贮藏期为一年。

3.根据权利要求1或2所述的颗粒剂制备工艺，其特征是：所述的固态高压灭菌以及高压灭菌，其灭菌的最佳温度值为121℃，最佳时间值为20分钟。

4.根据权利要求2所述的颗粒剂制备工艺，其特征是：在步骤③中所述的将乳胶液放入灭菌滴注器内滴注，其滴注器孔口直径最佳值为2mm。

5.一种10亿/克抗苯并咪唑类杀菌剂木霉分生孢子粉的制备方法，其特征是：高抗苯并咪唑类杀菌剂木霉分生孢子粉生产工艺如下

①一级斜面培养

将高抗苯并咪唑类杀菌剂木霉采用PDA培养基，培养6-7天；

②二级液体培养

将上述培养物接种马铃薯葡萄糖糖基液体扩繁，振荡培养24h，即作为固体发酵的种子液；

③三级固体培养

用开水浸泡低值陈米；然后放入高温灭菌锅灭菌，灭菌后待温度降到25-30℃时，将种子液接入低值陈米培养介质中；放到培养箱培养，12小时光照12小时黑暗交替培养，保湿培养5天，培养至充分产孢即米粒上包裹一层淡绿色的孢子粉；

④孢子收集

将三级固体培养物，在30℃下通风干燥48h后取出，采用封闭式真菌孢子分离器收获孢子粉，将孢子粉放在密闭容器里，在4℃低温条件保存备用。

6.根据权利要求5所述的木霉分生孢子粉的制备方法，其特征是：在步骤②中所述的，将上述培养物接种马铃薯葡萄糖糖基液体扩繁，振荡培养24h，其最佳振荡环境参数为28±1℃，200r/min。

7.根据权利要求5所述的木霉分生孢子粉的制备方法，其特征是：在步骤③中所述的，用开水浸泡低值陈米，时间最佳值为8-10分钟；在高温灭菌锅灭菌，其灭菌的最佳温度值为105℃，最佳时间值为8-10分钟；其种子液与米的最佳比例为1∶10；培养箱培养，最佳温度28℃。

8.一种权利要求1、2所述的抗苯并咪唑类杀菌剂木霉分生孢子颗粒剂应用方法，其特征是：本发明的颗粒剂与苯并咪唑类杀菌剂多菌灵按1∶1的比例混合应用于植物病害的综合防治，可进行穴施，用量为0.5-1.0克/穴。