CN103243030A - 一株用于防治柑橘木虱的刀孢轮枝菌菌株 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株用于防治柑橘木虱的刀孢轮枝菌（Lecanicilliumpsalliotae）菌株，属于微生物技术领域。所述菌株为刀孢轮枝菌（Lecanicilliumpsalliotae）ZJLP09，已于2013年4月26日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCCNo.7551。本发明所述的刀孢轮枝菌ZJLP09对柑橘木虱具有强致病力，与同属的蜡蚧轮枝菌菌株相比，菌株ZJLP09对柑橘木虱具有更强的作用效果，可被开发为生防菌制剂用于对柑橘木虱的生物防治，较目前防治柑橘木虱的化学药剂相比，具有高效、低毒、低残留、无污染、不易产生抗药性等特征，具有良好的市场应用前景。

Description

一株用于防治柑橘木虱的刀孢轮枝菌菌株

技术领域

本发明涉及一株用于防治柑橘木虱的刀孢轮枝菌（Lecanicillium psalliotae）菌株，属于微生物技术领域。

背景技术

柑橘黄龙病（Citrus Huanglongbing，HLB）是当前柑橘生产上防治最难、威胁最大的一种毁灭性病害，广泛分布在亚洲、非洲和美洲等多个国家和地区。该病害的猖獗发生和蔓延危害，给人们带来了巨大的经济损失，已成为柑橘产业稳定发展的重大障碍。尽管从发现该病害至今已有百余年的历史，但目前尚缺乏有效的防治药剂和理想的抗病品种，因此主要采取以治虫防病为主的综合防控措施来控制该病害的发生和流行。该病害的病原物为韧皮部杆菌属（Candidatus Liberibacter）细菌，在自然条件下主要通过柑橘木虱（Diaphorina citri）传播扩散。柑橘木虱除作为唯一自然虫媒传播黄龙病外，还是柑橘、柠檬、黄皮、九里香、枸杞等芸香科植物新梢期的主要害虫，可直接取食危害新梢嫩叶及产生分泌物诱发煤烟病等。因此，加强对柑橘木虱的防治，无论对于控制柑橘黄龙病的流行还是降低虫体本身对柑橘的危害都具有重要的意义。

目前对于柑橘木虱的防治多采用化学防治措施，然而化学农药的频繁使用造成了农药残留、环境污染、生物多样性破坏和柑橘木虱产生抗药性等诸多问题，而生物农药以其高效、低毒、低残留、无污染、不易产生抗药性和原料易得等特性被人们认为是未来化学农药的理想替代药剂。因此，利用生物农药防治柑橘木虱也逐渐引起人们的重视。已有报道对柑橘木虱具有致病效果的真菌有檬形被毛孢（Hirsutella citriformis）、宛氏拟青霉（paecilomyces varioti）、玫烟色拟青霉（Paecilomyces fumosoroseus）、球孢白僵菌（Beauveria bassiana）、蚜笋顶孢霉（Acrostalagmus aphidium）、黄色镰刀菌（Fusarium culmorum）和蜡蚧轮枝菌（Lecanicillium lecanii）等。但目前对于柑橘木虱生防菌的研究多处于实验室阶段，在农业生产中利用生防菌制剂成功防治柑橘木虱的实例尚未有见报道。因此，目前对于柑橘木虱虫生真菌进一步的分离筛选和生防潜能的深入研究，对于促进将来柑橘木虱生物防治的顺利开展具有重要的意义。

刀孢轮枝菌（Lecanicillium psalliotae）是蚧霉属（Lecanicillium）真菌，研究报道该菌可寄生根结线虫(Meloidogyne sp.)、孢囊线虫（Heterodera sp.）和腐生线虫（Panagrellus redivivus）等，可侵染麦长管蚜（Sitobion avenae）、粉蚧(Rhizoecus sp.)、松尺蠖蛾（Bupalus piniarius）等害虫，及对大豆锈病病菌（Phakopsora pachyrhizi）等植物病原菌具拮抗活性。目前，国内对该菌研究较少，只有关于其侵染根结线虫的报道。而关于利用刀孢轮枝菌防治柑橘木虱的研究在国内外尚未有见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一株用于防治柑橘木虱的刀孢轮枝菌菌株，该菌株对柑橘木虱具有强致病力，具有被开发为生物农药的潜能，具有良好的市场应用前景。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明所提供的刀孢轮枝菌菌株为刀孢轮枝菌（Lecanicillium psalliotae）ZJLP09，已于2013年4月26日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No. 7551。

本发明还提供了所述刀孢轮枝菌菌株在制备用于防治柑橘木虱的生物农药中的应用，菌株ZJLP09的分生孢子悬浮液对柑橘木虱具有强致病力。

所述刀孢轮枝菌（Lecanicillium psalliotae）菌株ZJLP09是从浙江省台州市黄岩区的橘园中采集的柑橘木虱虫体上分离获得的，该菌株的形态特征、培养特性、ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列和菌种分类结果如下：

1、菌株ZJLP09的形态特征：菌株ZJLP09在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基生长良好，25℃下暗培养10 d其菌落直径可达4.64 cm。在PDA平板上菌落呈圆形、隆起，菌落正面为白色棉絮状，菌落背面呈红色或紫红色。培养3 d左右即产生粉红色或红色色素，色素常扩散到培养基琼脂内。瓶梗基部较粗，至顶部逐渐变细，大小为22.5~35.0×1.0~1.8 μm，着生于匍匐状分生孢子梗上，单生或3~4根轮生。分生孢子单生或少数几个簇生于瓶梗顶端，大的分生孢子呈镰刀形、弯曲、末端尖锐，单细胞或2个细胞，大小为4.5~10.5×1.5~3.0 μm；小的分生孢子为卵圆形或椭圆形，3.0~4.2×1.5~2.5 μm。

2、菌株ZJLP09的生物学特性：菌株ZJLP09在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基、马铃薯蔗糖琼脂（PSA）培养基、沙氏葡萄糖酵母浸膏琼脂（SDAY）培养基、察氏（CDA）培养基、麦芽浸膏琼脂（MEA）培养基、LCA培养基和沙氏葡萄糖琼脂（SDA）培养基上均生长良好，其中在PDA、PSA、CDA和LCA培养基上可产生浅红色至深红色色素，而在MEA、SDAY和SDA培养基上无可见色素产生。菌株ZJLP09在10℃~35℃的温度条件下均可生长，其中25℃和30℃为其适宜生长温度。在25℃及以下温度下菌株ZJLP09可产生红色色素，而30℃及以上温度下菌株ZJLP09产生色素颜色极浅或不产生红色色素。光照时间长短对菌株ZJLP09的生长影响不显著。沙氏葡萄糖（SD）液体培养基为菌株ZJLP09的最佳产孢培养基。菌株ZJLP09的分生孢子在10℃~40℃的温度条件下均能萌发，其中25℃~30℃为菌株ZJLP09孢子萌发的适宜温度。

3、菌株ZJLP09的ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列：测序所得菌株ZJLP09的ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列如SEQ ID NO:1所示，利用NCBI Blast进行比对分析发现，所测序列与GenBank中刀孢轮枝菌（Lecanicillium psalliotae）的多个分离物（JN797793、EU918702、AB160994等）的序列相似性高达98~100%，与购自中国普通微生物菌种保藏中心的2个刀孢轮枝菌菌株（CGMCC3.4423和CGMCC3.4506）的序列相似性也高达99.9~100%。

根据以上关于菌株ZJLP09的形态特征及ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列特征，可将菌株ZJLP09鉴定为肉座菌目（Hypocreales）虫草菌科（Cordycipitaceae）蚧霉属（Lecanicillium）的刀孢轮枝菌（Lecanicillium psalliotae）。

与现有技术相比，本发明的优点和有益效果为：（1）目前国内外尚无关于刀孢轮枝菌侵染柑橘木虱的报道，而本发明提供的刀孢轮枝菌菌株ZJLP09是从浙江省台州市黄岩区柑橘园中被侵染的柑橘木虱虫体上分离获得的，经测定菌株ZJLP09对柑橘木虱具有强的致病力；（2）本发明所述的刀孢轮枝菌ZJLP09是一种昆虫病原真菌，其分生孢子悬浮液可直接作用于柑橘木虱，较目前防治柑橘木虱的化学药剂相比，具有高效、低毒、低残留、无污染和不易产生抗药性的特征；（3）同等条件下，本发明所提供的刀孢轮枝菌菌株ZJLP09较与之同属的蜡蚧轮枝菌菌株对柑橘木虱具有更强的作用效果，同时间内对柑橘木虱的致死率更高。（4）菌株ZJLP09培养快，产孢量大，孢子萌发率高，易于制备。因此菌株ZJLP09在被开发为生防菌制剂用于对柑橘木虱的生物防治上，具有良好的市场应用前景。

附图说明

图1为刀孢轮枝菌（Lecanicillium psalliotae）菌株ZJLP09在PDA培养基上培养5 d后的菌落特征。

图2为体视显微镜下观察刀孢轮枝菌（Lecanicillium psalliotae）菌株ZJLP09对柑橘木虱的侵染情况。

图3为扫描电子显微镜下观察刀孢轮枝菌（Lecanicillium psalliotae）菌株ZJLP09的分生孢子在柑橘木虱体表的附着和萌发。

图4为光学显微镜下观察刀孢轮枝菌（Lecanicillium psalliotae）菌株ZJLP09的菌丝在柑橘木虱体腔内的分布。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

一株用于防治柑橘木虱的刀孢轮枝菌，菌种命名为ZJLP09，分类命名：刀孢轮枝菌（Lecanicillium psalliotae），其保藏编号：CGMCC No. 7551，保藏日期：2013年4月26日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

实施例1：昆虫病原菌的分离和筛选

1、病菌的分离纯化：从浙江省台州市黄岩区柑橘园内采集柑橘木虱虫尸，于实验室超净工作台中进行如下操作：先将虫体放于70%乙醇中浸泡30 s，再经过0.1%升汞浸泡3 min，最后用无菌水冲洗3次。用无菌滤纸吸干虫体上的水分，然后将其放于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基（配制方法为：称取200 g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000 mL煮沸半个小时，纱布过滤，再加20 g葡萄糖和20 g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装至锥形瓶或玻璃试管中，121℃，高压灭菌20 min）中。将培养皿置于微生物培养箱中25℃恒温培养，至虫体周围长出菌丝后，挑取菌丝转至新的PDA平板上培养（重复此操作2~3次），持续培养10 d左右，待菌落上产生分生孢子，用无菌水洗脱分生孢子制备成分生孢子悬浮液，然后参照《植病研究方法》中所述的稀释纯化法（方中达. 植病研究方法(第三版)[M]. 北京: 中国农业出版社,1998: 122-140）对病菌进行单孢分离。最后将分离纯化获得的菌株保存于PDA斜面培养基中，培养5 d左右，置于4℃冰箱保存。

2、致病菌的筛选：将上述分离纯化保存的菌株接种到PDA平板上，于25℃恒温培养10 d左右后，以无菌水洗脱菌落上产生的分生孢子，制备获得分生孢子悬浮液，向其中加入适量的吐温-80至终浓度为0.1%。取于温室饲养的30头健康柑橘木虱成虫（本说明书实施例均以柑橘木虱成虫为测试对象）浸没于含0.1%吐温-80的分生孢子悬浮液中10~15 s，挑取处理后仍能自由活动的柑橘木虱置于培养皿中的九里香叶片上（培养皿底部铺有2层用无菌水湿润过的滤纸，其上放置一个带10个左右叶片的九里香嫩枝，枝条底端以无菌水湿润的脱脂棉包裹），然后放于25℃光照培养箱中（每天14 h光照/10 h黑暗，湿度95%以上）培养，同时设立含0.1%吐温-80的无菌水处理柑橘木虱为对照，培养7 d后观察病菌对柑橘木虱的侵染和致死情况。之后再按步骤1中的方法从处理后的柑橘木虱虫体中分离病菌，比较再分离的病菌与初始接种的病菌的形态特征和培养特征。

通过以上操作，筛选出符合科赫氏法则的对柑橘木虱具致病性的菌株，排除从柑橘木虱虫体上分离到的腐生菌等非致病菌。通过筛选，获得1株对柑橘木虱具有致病力的菌株，将其命名ZJLP09。

3、菌株的复壮：制备上述筛选到的对柑橘木虱具致病力的菌株ZJLP09的分生孢子悬浮液，接种到健康柑橘木虱虫体上，然后再从发病的柑橘木虱虫体上分离纯化病菌，具体操作方法同上。最后获得分离纯化的菌株ZJLP09。

实施例2：菌株ZJLP09的鉴定

1、菌株ZJLP09的形态特征：将上述分离纯化的菌株ZJLP09接种到PDA培养基平板中央，置于25℃恒温培养，每天观察菌落生长情况并记录菌落颜色和形态。将菌株ZJLP09接种到另一PDA培养基平板中央，同时将灭菌后的盖玻片（1 cm×1 cm）斜插入距接种点约1 cm左右处的培养基内，置于25 ℃恒温培养5 d左右待菌丝爬到盖玻片上后，取出盖玻片置于光学显微镜下观察菌株ZJLP09的菌丝和孢子形态。

图1示菌株ZJLP09在 PDA培养基上25 ℃恒温培养7 d后的形态特征，可见菌株ZJLP09菌落呈圆形、隆起，菌落正面为白色棉絮状，菌落背面呈红色。红色色素扩散到培养基琼脂内。光学显微镜下观察菌株ZJLP09的瓶梗基部较粗，至顶部逐渐变细，大小为22.5~35.0×1.0~1.8 μm，着生于匍匐状分生孢子梗上，单生或3~4根轮生。分生孢子单生或少数几个簇生于瓶梗顶端，大的分生孢子呈镰刀形、弯曲、末端尖锐，单细胞或2个细胞，大小为4.5~10.5×1.5~3.0 μm；小的分生孢子为卵圆形或椭圆形，3.0~4.2×1.5~2.5 μm。其形态特征与购自中国普通微生物菌种保藏中心的2个刀孢轮枝菌菌株（保藏编号为CGMCC3.4423和CGMCC3.4506）的特征基本一致。

2、菌株ZJLP09的序列分析：将菌株ZJLP09接种至PDA培养基平板，置于25℃恒温培养至菌落长满整个培养皿，以无菌药匙刮取PDA平板上生长的真菌菌丝于无菌研钵中，加入液氮研磨至粉末状，采用改良的CTAB法提取菌株ZJLP09的总DNA，以纯化的DNA为模板，用真菌通用引物ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′） 和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）进行PCR扩增（具体操作方法参考：鹿连明等. 柑橘黄龙病菌核糖体蛋白基因的多态性及系统发育分析. 浙江大学学报, 2011, 37(2):125-132）。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶回收试剂盒回收后送交公司测序。

测序所得菌株ZJLP09的ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列如SEQ ID NO:1所示，利用NCBI Blast进行比对分析发现，所测序列与GenBank中刀孢轮枝菌（Lecanicillium psalliotae）的多个分离物（JN797793、EU918702、AB160994等）的序列相似性高达98~100%，与购自中国普通微生物菌种保藏中心的2个刀孢轮枝菌菌株（CGMCC3.4423和CGMCC3.4506）的相似性也高达99.9~100%。

根据以上关于菌株ZJLP09的形态特征及ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列特征，结合相关文献（Zare R., Gams W. A revision of Verticillium section Prostrata. IV. The genera Lecanicilliumand Simplicillium gen. nov. Nova Hedwigia, 2001,37(1): 1-50）的描述，可将菌株ZJLP09鉴定为肉座菌目（Hypocreales）虫草菌科（Cordycipitaceae）蚧霉属（Lecanicillium）的刀孢轮枝菌（Lecanicillium psalliotae）。

实施例3：菌株ZJLP09的生物学特性

1、不同温度对菌株ZJLP09生长的影响：以无菌打孔器于在PDA培养基上培养7 d左右的菌株ZJLP09的菌落周围打取5 mm大小的菌饼，然后将菌饼分别置于数个新鲜制备的PDA平板（直径为9 cm）中央，分别于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃和40℃微生物培养箱中倒置培养，每个温度下设3个重复。培养14 d，每24 h观察菌落生长情况并采用十字交叉法记录菌落直径。

结果见表1，可以看出，菌株ZJLP09在PDA培养基上于10℃~35℃的温度下均可生长，其中25℃和30℃时菌丝生长速率明显高于其他温度，5℃低温和40℃高温下菌落不生长。因此，25℃~30℃为菌株ZJLP09的适宜生长温度。在10℃、15℃、20℃、25℃温度条件下菌株ZJLP09均可产生红色色素，而30℃下菌株ZJLP09产生红色色素颜色极浅或不产生红色色素，35℃和40℃条件下无红色色素产生，可见菌株ZJLP09产生红色色素受温度影响明显。

表1 接种后不同天数不同温度下菌株ZJLP09的生长情况

2、不同光照条件对菌株ZJLP09生长的影响：以无菌打孔器于在PDA培养基上培养7 d左右的菌株ZJLP09的菌落周围打取5 mm大小的菌饼，然后将菌饼分别置于数个新鲜制备的PDA平板（直径为9 cm）中央，于25℃培养箱中分别在每天0 h、12 h和24 h光照条件下培养，连续培养14 d，每24 h观察并记录菌落直径。

结果如表2，可以看出，菌株ZJLP09在不同光照条件下均生长良好，光照时间长短对菌株ZJLP09的生长影响不显著。

表2 接种后不同天数不同光照条件下菌株ZJLP09的生长情况

3、不同培养基对菌株ZJLP09生长的影响：配制马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基（配制方法同上）、马铃薯蔗糖琼脂（PSA）培养基（配制方法同PDA培养基，只将其中的葡萄糖替换为蔗糖）、沙氏葡萄糖酵母浸膏琼脂（SDAY）培养基（酵母浸膏10 g、葡萄糖40 g、蛋白胨10 g、琼脂20 g、蒸馏水1 L，pH6.0）、察氏（CDA）培养基（硝酸钠3 g、磷酸氢二钾1 g、七水硫酸镁0.5 g、氯化钾0.5 g、硫酸亚铁0.01 g、蔗糖30 g、琼脂15 g、蒸馏水1 L，pH7.3）、麦芽浸膏琼脂（MEA）培养基（麦芽浸粉30 g、大豆蛋白胨3 g、琼脂15 g、蒸馏水1 L，pH5.6）、LCA培养基（葡萄糖 1 g、磷酸二氢钾1 g、七水硫酸镁0.2 g、氯化钾0.2 g、硝酸钠2 g、酵母粉0.2 g、琼脂15 g、蒸馏水1 L，pH6.6-7.0）和沙氏葡萄糖琼脂（SDA）培养基（蛋白胨10 g、葡萄糖40 g、琼脂15 g、蒸馏水1 L，pH5.6）。上述配制的培养基经高压灭菌后于超净工作台下制备培养基平板，以无菌打孔器于培养7 d左右的菌株ZJLP09的菌落周围打取5 mm大小的菌饼，然后将菌饼分别置于上述各培养基平板中央，将培养皿密封后置于培养箱中暗培养，每隔一天观察菌落生长情况并采用十字交叉法记录菌落直径。

结果如表3，可以看出菌株ZJLP09在PDA、PSA、SDAY、CDA、MEA、LCA和SDA等培养基上均生长良好，其中在PSA、PDA和LCA培养基上菌株ZJLP09的生长速度略高于其他几种培养基。菌株ZJLP09在PDA、PSA、CDA和LCA培养基上可产生浅红色至深红色色素，而在MEA、SDAY和SDA培养基上无可见色素产生。

表3 接种后不同天数不同培养基上菌株ZJLP09的生长情况

4、不同培养基对菌株ZJLP09产孢量的影响：配制马铃薯葡萄糖（PD）液体培养基、马铃薯蔗糖（PS）液体培养基、沙氏葡萄糖酵母浸膏（SDY）液体培养基、察氏（CD）液体培养基、麦芽浸膏（ME）液体培养基、LC液体培养基和沙氏葡萄糖（SD）液体培养基（除不加琼脂外，配方分别同上述PDA、PSA、SDAY、CDA、MEA、LCA和SDA培养基）。挑取新鲜培养的菌株ZJLP09的菌块接种至装有PD培养液（120 mL/瓶）的锥形瓶中，置25℃摇床上振荡培养（150 rpm/min）2 d，作为种子培养液。然后分别取1 mL种子培养液加入到装有PD、PS、SDY、CD、ME、LC和SD培养液的锥形瓶中（120 mL/瓶），每个处理设3次重复，置25℃摇床振荡培养（150 rpm/min）6 d，每24 h取少量培养液滴在血球计数板上在光学显微镜下观察并记录孢子数量，然后计算各培养基中孢子的浓度。

测定结果如表4，可以看出通常在接种后3~4 d，菌株ZJLP09在各培养基中的孢子浓度达到最高，之后逐渐呈下降趋势。在接种后不同天数，菌株ZJLP09在SD培养基中的孢子浓度均高于其他各培养基。因此，将SD培养基确定为菌株ZJLP09的最佳产孢培养基。

表4 接种后不同时间不同培养基中菌株ZJLP09的孢子浓度

5、不同温度和时间对菌株ZJLP09孢子萌发率的影响：以PD液体培养基洗脱于PDA上培养的菌株ZJLP的分生孢子配制成分生孢子悬浮液，分别取30 μL孢子悬浮液滴加至各无菌载玻片的中央，然后置于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃和40℃培养箱中暗培养，每个温度条件设3个重复，每1 h在显微镜下计数400~600个孢子，以芽管长度超过孢子长度1/2为标准视为孢子萌发，统计孢子萌发个数并计算孢子萌发率。

结果见表5，可以看出，菌株ZJLP09的分生孢子在10℃~40℃的温度条件下均能萌发，其中在25℃和30℃下孢子萌发率最高，培养5 h萌发率可达90%以上，10℃和40℃菌株ZJLP09的孢子萌发率极低，5℃下培养5 h也未见有孢子萌发。因此，确定25℃~30℃为菌株ZJLP09孢子萌发的适宜温度。

表5 不同温度条件下菌株ZJLP09的分生孢子萌发率

实施例4：菌株ZJLP09对柑橘木虱的致病性测定

1、菌株ZJLP09对柑橘木虱的致死中浓度和致死中时间：将菌株ZJLP09接种至SD液体培养基中（蛋白胨10 g、葡萄糖40 g、蒸馏水1 L，pH5.6），于25℃恒温摇床振荡培养（150 rpm/min）3 d后，培养的菌液经由无菌纱布过滤除去菌丝体，收集分生孢子悬浮液，以无菌水进行系列稀释，获得浓度分别为1.0×10⁸ spores/mL、1.0×10⁷ spores/mL、1.0×10⁶ spores/mL、1.0×10⁵ spores/mL、1.0×10⁴ spores/mL的分生孢子悬浮液，并向其中加入适量的吐温-80至终浓度为0.1%。按实施例1所述将健康柑橘木虱放于上述各浓度的含0.1%吐温-80的分生孢子悬浮液中浸润处理，之后放于25℃光照培养箱中（每天14 h光照/10 h黑暗，湿度95%以上）培养，同时设立以含0.1%吐温-80的无菌水处理柑橘木虱为对照。以上每个处理设3个重复，每个重复处理30头柑橘木虱。从培养第2 d开始每天观察病菌对柑橘木虱的侵染和致死情况，记录柑橘木虱死亡数目，按如下公式计算死亡率和校正死亡率，所得数据通过SAS软件进行回归分析，得到回归方程和相关系数r，计算致死中浓度（LC₅₀）和致死中时间（LT₅₀）。

测定结果显示，菌株ZJLP09的分生孢子悬浮液浓度越高，对柑橘木虱的致病效果越好。在同一浓度条件下，接种后培养时间越长，柑橘木虱的死亡率越高。接种后第3 d，菌株ZJLP09对柑橘木虱的LC₅₀为3.15×10⁹ spores/mL，第7 d则仅为9.89×10³ spores/mL。分生孢子悬浮液浓度越高，菌株ZJLP09对柑橘木虱的LT₅₀也越短，浓度为1.0×10⁴ spores/mL的分生孢子悬浮液对柑橘木虱的LT₅₀为6.56 d，而浓度为1.0×10⁸的孢子悬浮液的LT₅₀仅为2.98 d。

2、菌株ZJLP09对柑橘木虱的侵染过程：如步骤1所述制备菌株ZJLP09的分生孢子悬浮液并接种柑橘木虱，于25℃光照培养箱中（每天14 h光照/10 h黑暗，湿度95%以上）培养不同时间后取样。取其中部分柑橘木虱样品置于体视显微镜下直接观察昆虫体表的菌丝生长情况。取其中部分柑橘木虱样品固定于4%的多聚甲醛溶液中，经石蜡切片后，将超薄切片放入苏木精-伊红（HE）染色液或六胺银（GMS）染色液中染色处理后，置于光学显微镜下观察菌株ZJLP09对柑橘木虱的侵染情况及菌丝在木虱体腔内的分布；另外，取部分柑橘木虱样品于2.5%戊二醛溶液中固定，清洗、干燥、喷金等处理后，放于扫描电子显微镜下观察菌株ZJLP09的孢子在木虱体表的附着和萌发情况。以上操作参照方中达（方中达. 植病研究方法(第三版)[M]. 北京: 中国农业出版社,1998）及Leemon和Jonsson（Leemon D.M., Jonsson N.N. Comparative studies on the invasion of cattle ticks (Rhipicephalus (Boophilus) microplus) and sheep blowflies (Lucilia cuprina) by Metarhizium anisopliae (Sorokin) . Journal of Invertebrate Pathology, 2012, 109: 248-259）的方法进行。

将处理后的柑橘木虱培养2 d后，即可通过体视显微镜观察到昆虫体表有菌丝产生，之后虫体上的菌丝不断生长增殖。图2为培养5 d后在体视显微镜下观察菌株ZJLP09对柑橘木虱的侵染情况，可见柑橘木虱已被侵染致死，白色菌丝已几乎覆盖整个昆虫虫体。通过对柑橘木虱样品的电镜观察及对其超薄切片的显微镜观察，可以看到菌株ZJLP09的分生孢子附着在刚处理后的柑橘木虱体表，培养1 h后即可观察到有少量分生孢子在虫体上萌发出芽管或产生附着胞，如图3所示。之后通过芽管或附着胞穿透木虱体表侵入木虱体内，并在体腔内不断增殖，48 h后可见菌株ZJLP09的大量菌丝分布在昆虫体腔内，如图4所示。

3、菌株ZJLP09对柑橘木虱的防治应用：取健康柑橘木虱放于养虫笼内的盆栽九里香幼苗上（1个养虫笼内放置1株九里香幼苗，1株九里香幼苗上放柑橘木虱30头，设5个重复），按上述操作制备含0.1%吐温-80的浓度为1.0×10⁸ spores/mL的菌株ZJLP09的分生孢子悬浮液，通过小型喷雾器对九里香上的柑橘木虱均匀喷雾，至昆虫体表完全湿润。以分离自柑橘木虱的与菌株ZJLP09同属的蜡蚧轮枝菌（Lecanicillium lecanii）菌株作为对比菌株，制备与菌株ZJLP09同浓度的孢子悬浮液并处理柑橘木虱。此外，以含0.1%吐温-80的无菌水处理柑橘木虱作为对照。上述各处理完成后，将养虫笼放入玻璃温室内，控制温室内温度为25℃~30℃，湿度为90%以上，每天14 h光照/10 h黑暗。于处理后第3 d、第6 d和第9 d观察并记录上述各处理的柑橘木虱的总虫数和死亡虫数，计算死亡率和校正死亡率。

以浓度为1.0×10⁸ spores/mL的刀孢轮枝菌菌株ZJLP09的分生孢子悬浮液处理的柑橘木虱，在第3 d、第6 d和第9 d的校正死亡率分别34.67%、71.33%和100%，而以同浓度的蜡蚧轮枝菌的分生孢子悬浮液处理的柑橘木虱的校正死亡率分别为25.33%、56.67%和81.33%。可以看出，本发明提供的刀孢轮枝菌菌株ZJLP09较同属的蜡蚧轮枝菌菌株对柑橘木虱具有更强的作用效果。

<110> 浙江省柑桔研究所

<120>一株用于防治柑橘木虱的刀孢轮枝菌菌株

<160> 1

<170> PatentIn Version 3.3

<210> 1

<211> 529

<212> DNA

<213> 刀孢轮枝菌（Lecanicillium psalliotae）

<400> 1

cagagtttac aactcccaaa cccttatgtg aacataccaa gatgttgctt cggcggactc      60

gccccggcgt ccggacggcc tagcgccgcc cgcggcccgg actcaggcgg ccgccggaga     120

ccaccaaact cttttgtatc atgagtatct tctgaatccg ccgcaaggca aaacaaatga     180

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ccgtaaaaca ccccactttc tgaacgttga cctcggatca ggtaggaat                 529

 

Claims (2)

1.一株刀孢轮枝菌菌株，其特征在于该菌株为刀孢轮枝菌（Lecanicillium psalliotae）ZJLP09，已于2013年4月26日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No.7551。

2.如权利要求1所述的刀孢轮枝菌菌株在制备用于防治柑橘木虱的生物农药中的应用。

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