CN106434488A - 一种具有抑制大豆疫霉根腐病的昆虫病原线虫共生菌及应用 - Google Patents
一种具有抑制大豆疫霉根腐病的昆虫病原线虫共生菌及应用 Download PDFInfo
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Abstract
一种具有抑制大豆疫霉根腐病的昆虫病原线虫共生菌及应用，它涉及一种昆虫病原线虫共生菌及应用。该菌为致病杆菌(Xenorhabdus budapestensis)HEB02，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2016年4月11日，保藏号CGMCC No.12352。用于防治大豆疫霉根腐病。本发明致病杆菌HEB02具有较强的抑制大豆疫霉根腐病菌菌丝生长的能力，且随着体积浓度的增加而增大，抑菌效果显著。同时，该菌具有培养条件要求低、持效期长、来源环保无毒性等特点，使其具有很好的开发应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种昆虫病原线虫共生菌及应用。
背景技术
大豆疫霉根腐病，又称大豆疫病，是由大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)引起世界大豆生产上最为严重的病害之一。自于1948年于美国首次发现以来，其危害面积大，毁灭性强的特点，使其在世界大豆主产区均呈现扩大蔓延趋势。中国是栽培大豆的起源国，具有五千年的栽培历史，其粮菜兼做的特点，使其在我国农业生产以及社会经济生活中地位显著。东北作为全国大豆主产区，于1989年最早发现大豆疫霉菌，随后在全国其他省份也陆续有发现大豆疫霉菌的报道。研究表明，其环境适应能力强，种群变化速度快的特点，是其能够大面积发生且难于用药剂防治的主要原因。目前，该病已经在我国造成了巨大产量损失，严重威胁着我国大豆产业的发展。
昆虫病原线虫共生菌是存在于昆虫病原线虫肠道内的一类革兰氏阴性细菌，属肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，包括致病杆菌属(XeNorhabdus)、光杆状菌属(Photorhabdus)和沙氏菌属(Serratia)，其分别与斯氏线虫属(Steinernema)、异小杆线虫属(Heterorhabditis)及拟异小杆线虫属(Heterorhabditidoides)的线虫共生。在自然界，此类细菌存在于3龄侵染期线虫的肠道内，随着线虫的侵染，而被携带到寄主体内并释放到血腔中，经大量繁殖，产生毒素，在48之内就能杀死寄主。研究表明，昆虫病原线虫共生菌在离体人工培养时，也能够产生多种物质。随着对昆虫病原线虫共生菌研究的不断深入，这些产物的功能亦不断被发现，如对多种动植物加人类病原菌有广泛的抑菌活性等。目前，昆虫病原线虫共生菌已成为一类新型的具有开发潜力和应用前景的能够杀虫防病的生物资源。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种具有抑制大豆疫霉根腐病的昆虫病原线虫共生菌及应用。
本发明的一种具有抑制大豆疫霉根腐病的昆虫病原线虫共生菌，它为致病杆菌(XeNorhabdus budapestensis)HEB02，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2016年4月11日，保藏号CGMCC No.12352。
它用于防治大豆疫霉根腐病。
本发明具有抑制大豆疫霉根腐病的昆虫病原线虫共生菌为革兰氏阴性菌，在营养琼脂培养基上为乳黄色菌落，圆形，微凸，边缘不整齐，随着时间延长颜色加深；在NBTA培养基上，初生型可吸收溴麝香百里酚蓝(BTB)，形成蓝色菌落，次生型不能吸收呈紫色菌落。根据《常见细菌系统鉴定手册》方法进行生理生化指标测定，结果表明：昆虫病原线虫共生菌不能还原硝酸盐，过氧化氢酶、氧化酶阴性，淀粉水解、吲哚实验阴性，葡萄糖、纤维二糖、麦芽糖、甘油等产酸为阳性，蔗糖、蜜二糖、D-核糖等为阴性。
本发明具有抑制大豆疫霉根腐病的昆虫病原线虫共生菌可在NBTA培养基上生长，生长温度为28℃，最适pH为7.2～7.4，转速180r/min。NBTA培养基由牛肉膏5g、蛋白胨10g、营养琼脂20g、氯化钠5g、溴麝香百里酚蓝(BTB)0.025g、氯化三苯基四氮唑(TCC)0.04g和蒸馏水1000mL组成。
本发明具有抑制大豆疫霉根腐病的昆虫病原线虫共生菌通过16S rDNA序列比对分析，与致病杆菌属有极高的同源性，同源性为99％以上。通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定昆虫病原线虫共生菌属于致病杆菌属(XeNorhabdus)，为致病杆菌XeNorhabdus budapestensis。
平板抑菌实验表明，在固体培养培养条件下，本发明致病杆菌(XeNorhabdusbudapestensis)HEB02具有较强的抑制大豆疫霉根腐病菌菌丝生长的能力，随着体积浓度的增加而增大，持效期长，抑菌效果显著。
附图说明
图1为致病杆菌(XeNorhabdus budapestensis)HEB02无菌体发酵液在CA培养基上对大豆疫霉菌产生抑菌带照片；其中，A为产生抑菌带第1天的照片，B为和产生抑菌带第7天的照片。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式的一种具有抑制大豆疫霉根腐病的昆虫病原线虫共生菌，它为致病杆菌(XeNorhabdus budapestensis)HEB02，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2016年4月11日，保藏号CGMCC No.12352。
本实施方式的致病杆菌(XeNorhabdus budapestensis)HEB02是按照如下方式获取的：
利用大腊螟诱集法从采自哈尔滨市的土样中分离出昆虫病原线虫；按下列方法分离初生型共生细菌：
用分离得到的昆虫病原线虫感染大腊螟5龄幼虫，虫体死亡后，用体积百分含量为75％的酒精浸泡3s后，用质量百分含量为1％的NaClO溶液擦拭虫体表面，并用灭菌滤纸吸干虫体上的水分；用灭菌剪子剪掉大腊螟前足，将从伤口流出的血淋巴涂布于NBTA培养基上，置于28℃生化培养箱中培养2-3天，挑取蓝色单菌落为初生型共生单菌落并接种于NA培养液(由牛肉膏5g、蛋白胨10g和蒸馏水1000mL组成)中，于28℃下180r/min振荡培养24h后，按体积比1％转入发酵培养液中振荡发酵36-48h后，离心管中冷冻离心，取上清液，以获得无菌体发酵液。
所筛选的具有抑制大豆疫霉根腐病的昆虫病原线虫共生菌为革兰氏阴性菌，在营养琼脂培养基上为乳黄色菌落，圆形，微凸，边缘不整齐，随着时间延长颜色加深；在NBTA培养基上，初生型可吸收溴麝香百里酚蓝(BTB)，形成蓝色菌落，次生型不能吸收呈紫色菌落。根据《常见细菌系统鉴定手册》方法进行生理生化指标测定，结果表明：昆虫病原线虫共生菌不能还原硝酸盐，过氧化氢酶、氧化酶阴性，淀粉水解、吲哚实验阴性，葡萄糖、纤维二糖、麦芽糖、甘油等产酸为阳性，蔗糖、蜜二糖、D-核糖等为阴性。
对分离筛选得到的致病杆菌进行分子鉴定，按以下步骤进行：提取菌株的总DNA，根据共生菌16S rDNA设计引物，以基因组DNA为模板进行PCR扩增。然后利用胶回收试剂盒回收纯化PCR产物，之后，进行克隆、转化，测序。测序结果与GenBank中的16S rDNA序列进行同源性比对，同源性达到99％以上。通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定昆虫病原线虫共生菌HEB02属于致病杆菌属(XeNorhabdus)，为致病杆菌XeNorhabdusbudapestensis。
具体实施方式二：本实施方式的一种具有抑制大豆疫霉根腐病的昆虫病原线虫共生菌，它用于防治大豆疫霉根腐病。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：它是采用昆虫病原线虫共生菌的菌液防治大豆疫霉根腐病。其它与具体实施方式二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二或三不同的是：所述的具有抑制大豆疫霉根腐病的昆虫病原线虫共生菌的菌液制备方法是按照以下步骤进行的：
将致病杆菌(XeNorhabdus budapestensis)HEB02接种于液体培养基中，在28℃，180r/min的条件下，振荡发酵培养36～48h，倒入离心管中冷冻离心后，取上清液，获到无菌体发酵液。
其它与具体实施方式二或三相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式四不同的是：所述的液体培养基为NA培养液；1L的NA培养液是由5g的牛肉膏、10g的蛋白胨以及1000mL蒸馏水组成。
其它与具体实施方式四相同。
本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。
通过以下实施例验证本发明的有益效果：
应用梯度稀释法测定无菌体发酵液对大豆疫霉根腐病的拮抗作用。
具体步骤为：
1.前期准备：将本实验室保存的大豆疫霉菌，接种于胡萝卜琼脂培养基(CA)上置于25℃恒温培养箱内，培养至菌丝刚刚长满培养皿时，备用。
2.胡萝卜琼脂培养基(CA)的制备：将200g新鲜胡萝卜加少量蒸馏水用组织捣碎机捣碎，去掉残渣，再在汁液中加入18～20g琼脂煮沸熔化，加蒸馏水补至1000mL，分装，121℃高压灭菌，备用。
3.拮抗作用测定：在无菌条件下，用内径为5mm的打孔器在CA培养基上打孔，孔内加入无菌体发酵液60μL，在距该孔4cm处接种大豆疫霉菌菌块。以加入无菌水为对照，每处理3次重复。置于25℃恒温培养箱内，当对照菌落长至时，测量抑菌带宽度。
4.结果分析：经测定致病杆菌HEB02的无菌体发酵液对大豆疫霉菌具有明显抑制作用，从产生抑菌带第1天起，至7天后菌丝绕过发酵液接菌孔，拮抗菌周围平均产生了6mm宽的抑菌带，靠近拮抗菌一侧的大豆疫霉菌菌丝停止生长。
对大豆疫霉根腐病的拮抗作用结果如图1所示，由图1可以得出致病杆菌HEB02的无菌体发酵液对大豆疫霉菌具有明显拮抗作用，且持效期较长，能够很好的抑制靠近拮抗菌一侧的大豆疫霉菌菌丝生长。
Claims (5)
1.一种具有抑制大豆疫霉根腐病的昆虫病原线虫共生菌，其特征在于它为致病杆菌(XeNorhabdus budapestensis)HEB02，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2016年4月11日，保藏号CGMCC No.12352。
2.一种具有抑制大豆疫霉根腐病的昆虫病原线虫共生菌的应用，其特征在于它用于防治大豆疫霉根腐病。
3.根据权利要求2所述的一种具有抑制大豆疫霉根腐病的昆虫病原线虫共生菌的应用，其特征在于它是采用具有抑制大豆疫霉根腐病的昆虫病原线虫共生菌的菌液防治大豆疫霉根腐病。
4.根据权利要求3所述的一种具有抑制大豆疫霉根腐病的昆虫病原线虫共生菌的应用，其特征在于所述的具有抑制大豆疫霉根腐病的昆虫病原线虫共生菌的菌液制备方法是按照以下步骤进行的：
将致病杆菌(XeNorhabdus budapestensis)HEB02接种于液体培养基中，在28℃，180r/min的条件下，振荡发酵培养36～48h，倒入离心管中冷冻离心后，取上清液，获到无菌体发酵液。
5.根据权利要求4所述的一种具有抑制大豆疫霉根腐病的昆虫病原线虫共生菌的应用，其特征在于所述的液体培养基为NA培养液；1L的NA培养液是由5g的牛肉膏、10g的蛋白胨以及1000mL蒸馏水组成。
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