CN1724649A - 昆虫病原线虫共生菌发酵工艺及其发酵液的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种昆虫病原线虫共生菌的发酵工艺及发酵物的应用，以嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophilusYL001为材料，针对该菌建立了一套发酵工艺，通过该工艺得到的菌具有较高的生物量和抗菌活性。Xenorhabdus nematophilus YL001的发酵产物加工成的防治辣椒疫霉病的昆虫病原线虫共生菌杀菌剂，采用灌根、浸种处理均具有较好的防治作用。

Description

昆虫病原线虫共生菌发酵工艺及其发酵液的应用

                            技术领域

本发明涉及一种细菌的发酵工艺和发酵物在防治农作物病害方面的应用，具体说是嗜线虫致病杆菌的发酵工艺和其发酵液在制备防治农作物病害的杀菌剂的应用。

                            背景技术

昆虫病原线虫共生菌是寄生于昆虫病原线虫肠道内的一类细菌，属肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，兼性厌氧、化能异养，革兰氏染色阴性。包括致病杆菌属(Xenorhabdus)和光杆状菌属(Photorhabdus)，分别与斯氏线虫属(Steinernema)和异小杆线虫属(Heterorhabditis)线虫共生。在自然界，此类细菌存在于三龄侵染期线虫的肠道内，随着线虫对昆虫的侵染，共生菌被携带到昆虫体内并释放到寄主血腔中，共生菌大量繁殖，产生毒素和抑菌物质，与线虫共同作用，杀死寄主昆虫；另外，共生菌也能分解昆虫组织，为线虫和共生菌的生长和繁殖提供营养。昆虫病原线虫共生细菌Xenorhabdus和Photorhabdus能产生多种代谢产物。到目前为止，已从共生菌中分离鉴定出30多种生物活性成分，这些代谢产物不仅具有多种化学结构，而且在医疗卫生和农业上具有广泛的生物活性，如抑菌、杀虫、杀线虫、抗溃疡、抗肿瘤和抗病毒活性。特别是从P.luminescens W14中分离出一种外毒素蛋白复合体，对鳞翅目，鞘翅目、蜚蠊目和膜翅目等几个目的多种害虫均表现出很高的口服杀虫活性，毒性与Btδ-内毒素相当；杀虫基因转入烟草、玉米和水稻后，对烟草天蛾幼虫和玉米根叶甲幼虫具有较强的致死和抑制生长作用；杀虫蛋白基因在大肠杆菌细胞内也得到了有效表达。为生物农药的开发和抗虫基因工程提供了新的微生物杀虫资源和杀虫基因。昆虫病原线虫共生菌已成为一类新型的具有较大开发潜力和广泛应用前景的生物资源。近年来，昆虫病原线虫共生菌的生理代谢特征成为国际上研究的热点。

抑菌物质的产生与共生菌的菌株和培养条件有关。Xenorhabdus spp在1.0％的蛋白胨培养基中不产生抑菌物质，而在酵母提取物培养基、LB培养基、海水培养基和TSB培养基中可以产生抑菌物质。Paul et al.(1981)报道，Xenorhabdus sp.R产生的Indoles类衍生物1、2和3的产量分别为1.3、6.7和1.0mg.L^-1，Photorhabdus sp.Hb产生的ST1和ST2的产量为7.3和2.2mg.L^-1。X.nematophilus ALL在TSB培养基中产生的Xenocoumacins1和2的产量为300和100mg.L^-1。在酵母提取物培养基中，Xenorhabdus sp.Q1在连续培养条件下，Xenorhabdins1和2的产量为10.8和36.4mg.L^-1。在TSB培养基中，X.bovienii在分批培养条件下主要产生Xenorhabdins。

不同培养时间抑菌物质的产生也有一定的差异。共生菌在TSB培养基中，nematophin的浓度在不同的培养时间相差5倍。在培养的1-2d nematophin的浓度急剧增加，然后维持在较高的水平。X.bovienii产生的indoles2和indoles4的产量在培养的第1d达到最大，分别为17.00和11.56μg.ml^-1，然后产量逐渐降低；而indoles1和indoles3在培养第1d的产量最小，分别为24.42和18.87μg.ml^-1，随培养时间的延长产量逐渐增加。这说明indoles2和indoles4是在共生菌生长早期合成的，随后逐渐降解为indoles1和indoles3。Indoles是通过色氨酸合成的，它保留了色氨酸上的亚甲基碳，去除了羧基碳，这是因为向培养基中添加色氨酸可以提高indoles的产量。不同培养条件下P.luminscens产生的ST的量有较大的差异，即是同一菌株。

型态变化、培养温度和溶氧条件影响共生菌的生长和抑菌物质的产生。初生型共生菌可以产生抑菌物质，而次生型则不能；在体外培养中，共生菌能发生型态变化，这是影响抑菌素产生的一个主要问题。X.nematophilus D1在35℃的抑菌活性远低于15-30℃。Xenorhabdus和Photorhabdus是兼性厌养菌，氧气是其生长和抑菌物质产生所必须的。共生菌在封闭的容器中，在不振荡的条件下不产生抑菌素。

如前所述，共生菌在不同培养基和不同培养时间次生代谢产物有一定的差异；型态变化、培养温度和溶氧条件等影响共生菌的生长和抑菌物质的产生。对共生菌的培养发酵与次生代谢产物的产生的相关技术和方法的文献或专利未见报道。

                            发明内容

本发明的目的是针对昆虫病原线虫共生菌在培养发酵技术和方法上的不足，以嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophilus YL001为材料(该菌是从陕西杨陵筛选的一种线虫Steinernema sp中分离获得，经鉴定并命名为Xenorhabdus nematophilus YL001)，针对该菌建立了一套批量生产的发酵工艺。本发明的具体工艺步骤是：

1、将种管保存的嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophilus YL001，划线于NA培养基平板上，28℃培养24～48h，挑取单菌落，再划线于NBTA培养基平板上，28℃培养24～48h；

2、用接种环挑取NBTA培养基平板上的蓝色菌落，接种于装有50ml NB培养基的250ml三角瓶中，28℃、180r/min振荡培养16-24h，成为一级种子液；

3、将一级种子液按9.1％的接种量接入装有种子培养基的250ml三角瓶中，装液量为25ml，pH7.25，在26℃、220rpm振荡培养16-24h，成为二级种子液；

4、在7L搅拌式发酵罐内加入4.5L发酵培养基，0.01％消泡剂，pH 7.2，离位0.1-0.15MPa蒸汽灭菌30min，冷却至28℃，按9.1％接入二级种子液，在26℃、通气量2.5L/min、搅拌转速300rpm条件下，培养72-96h，即可获得发酵物，将发酵物过滤，去除细胞得到发酵液；或

在70L搅拌式发酵罐内加入45L发酵培养基，0.01％消泡剂，pH 7.2，0.1-0.15MPa蒸汽灭菌30min，冷却至26℃，按9.1％接入二级种子液，在26℃、通气量40L/min、搅拌转速150rpm、罐压0.03-0.05MPa条件下，培养72-96h，即可获得发酵物，将发酵物过滤，去除细胞得到发酵液。

5、对发酵液进行离体和活体抑菌试验。

其中所述的NA培养基为：牛肉膏3.0g、蛋白胨5.0g、营养琼脂20g、水1000ml、PH 7.2～7.4。

其中所述的NBTA培养基为：NA+(TTC 0.04g、BTB 0.025g)。

其中所述的NB培养基为：牛肉膏3.0g、蛋白胨5.0g、水1000ml，PH 7.2～7.4。

其中所述的种子培养基为(g/L)：葡萄糖6.13、蛋白胨21.29、MgSO₄ 1.50、(NH₄)₂SO₄ 2.46、KH₂PO₄ 0.86、K₂HPO₄ 1.11、Na₂SO₄ 1.72。

其中所述的发酵培养基为(g/L)：玉米粉9.69、豆饼粉51.57、棉饼粉6.88、鱼粉13.75、酵母粉4.30、MgSO₄ 1.07、(NH₄)₂SO₄ 1.79、KH₂PO₄ 0.63、K₂HPO₄ 0.80、Na₂SO₄ 1.25。

本发明的工艺能够稳定的获得嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophilus YL001发酵物，其生产成本相对较低，能够用于批量生产。

得到的嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophilus YL001发酵物，在制备用于防治辣椒疫霉病的杀菌剂有较好的应用前景。

防治辣椒疫霉病的昆虫病原线虫共生菌的杀菌剂的各组分的体积百份比为：嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophilus YL001的发酵液60％-85％，助剂1％-5％，余为表面活性剂，上述组分的总和为100％。

所述的助剂是苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸等物质中的一种，表面活性剂为本领域工作人员公知的物质的组合物。

                          具体实施方式

以下将本发明的内容通过下列的较优的实施例作进一步的阐述，但这些实施例并不限制本发明的保护范围。

嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophilus YL001的获得：

A、首先用0.1％甲醛溶液将浸染期的昆虫病原线虫(IJs)(该线虫从陕西杨陵筛选获得，经鉴定为斯氏线虫Steinernema sp)浸泡消毒3次，每次30min，每次消毒完后用无菌水冲洗；随后用0.1％乙汞硫代水杨酸钠将线虫浸泡30min，消毒完后用无菌水冲洗3次，最后将消毒过的线虫加到NBTA培养基平板上进行分离；

C、用10％的次氯酸钠或1％的升汞将侵染期昆虫病原线虫浸泡30min，然后用无菌水冲洗3次，将消毒过的线虫直接散布在NBTA培养基上进行分离。NBTA培养基平板在28℃、黑暗条件下培养3-5d，线虫释放出共生菌，形成蓝绿色菌落，周围培养基中的染料被吸收变为黄色，即可得到昆虫病原线虫共生菌，经鉴定并命名为Xenorhabdusnematophilus YL001。

其中所述的NBTA培养基为：牛肉膏3.0g、蛋白胨5.0g、营养琼脂20g、TTC 0.04g、BTB 0.025g、水1000ml、PH 7.2～7.4。

实施例1：

1、将种管保存的嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophilus YL001，划线于NA培养基平板上，28℃培养24h，挑取单菌落，再划线于NBTA培养基平板上，28℃培养48h；

2、用接种环挑取NBTA培养基平板上的蓝色菌落，接种于装有50ml NB培养基的250ml三角瓶中，28℃、180r/min振荡培养16-24h，成为一级种子液；

3、将一级种子液按9.1％的接种量接入装有种子培养基的250ml三角瓶中，装液量为25ml，pH7.25，在26℃、220rpm振荡培养16-24h，成为二级种子液；

4、在7L搅拌式发酵罐内加入4.5L发酵培养基，0.01％消泡剂，pH 7.2，离位0.1-0.15MPa蒸汽灭菌30min冷却至28℃，按9.1％接入二级种子液，在26℃、通气量2.5L/min、搅拌转速300rpm条件下，培养72h，获得4升发酵物，过滤除去细胞得4升发酵液。

NA培养基为：牛肉膏3.0g、蛋白胨5.0g、营养琼脂20g、水1000ml、PH 7.2～7.4。

NBTA培养基为：NA+(TTC 0.04g、BTB 0.025g)。

NB培养基为：牛肉膏3.0g、蛋白胨5.0g、水1000ml，PH 7.2～7.4。

种子培养基为(g/L)：葡萄糖6.13、蛋白胨21.29、MgSO₄ 1.50、(NH₄)₂SO₄ 2.46、KH₂PO₄ 0.86、K₂HPO₄ 1.11、Na₂SO₄ 1.72。

发酵培养基为(g/L)：玉米粉9.69、豆饼粉51.57、棉饼粉6.88、鱼粉13.75、酵母粉4.30、MgSO₄ 1.07、(NH₄)₂SO₄ 1.79、KH₂PO₄ 0.63、K₂HPO₄ 0.80、Na₂SO₄ 1.25。

表1：7L罐发酵过程的主要参数

发酵参数
		初始葡萄糖/g.L-1剩余葡萄糖/g.L-1葡萄糖消耗率/g.L-1.h-1葡萄糖利用率/％X(细胞干重)/g.L-1P(抗菌活性单位)/U.ml-1细胞生产强度PX/g.L-1.h-1产物生产强度PP/U.ml-1.h-1细胞比生长速率μ/h-1产物比合成速率qp/h-1YX/S/g.g-1YP/S/U.g-1KLα/h-1	6.00.620.1189.719.5823.20.340.480.230.163.204.31185.7

实施例2

1、将种管保存的嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophilus YL001，划线于NA培养基平板上，28℃培养24h，挑取单菌落，再划线于NBTA培养基平板上，28℃培养48h；

2、用接种环挑取NBTA培养基平板上的蓝色菌落，接种于装有50ml NB培养基的250ml三角瓶中，28℃、180r/min振荡培养16-24h，成为一级种子液；

3、将一级种子液按9.1％的接种量接入装有种子培养基的250ml三角瓶中，装液量为25ml，pH7.25，在26℃、220rpm振荡培养16-24h，成为二级种子液；

4、70L搅拌式发酵罐内加入45L发酵培养基，0.01％消泡剂，pH 7.2，0.1-0.15MPa蒸汽灭菌30min冷却至26℃，按9.1％接入二级种子液，在26℃、通气量40L/min、搅拌转速150rpm、罐压0.03-0.05MPa条件下，培养72h，获得40升发酵物，过滤去除细胞得40升发酵液。

NA培养基为：牛肉膏3.0g、蛋白胨5.0g、营养琼脂20g、水1000ml、PH 7.2～7.4。

NBTA培养基为：NA+(TTC 0.04g、BTB 0.025g)。

NB培养基为：牛肉膏3.0g、蛋白胨5.0g、水1000ml，PH 7.2～7.4。

种子培养基为(g/L)：葡萄糖6.13、蛋白胨21.29、MgSO₄ 1.50、(NH₄)₂SO₄ 2.46、KH₂PO₄ 0.86、K₂HPO₄ 1.11、Na₂SO₄ 1.72。

发酵培养基为(g/L)：玉米粉9.69、豆饼粉51.57、棉饼粉6.88、鱼粉13.75、酵母粉4.30、MgSO₄ 1.07、(NH₄)₂SO₄ 1.79、KH₂PO₄ 0.63、K₂HPO₄ 0.80、Na₂SO₄ 1.25。

表2  70L罐发酵过程的主要参数

发酵参数
		X(细胞干重)/g·L-1	22.47

P(抗菌活性单位)/U.ml-1细胞生产强度PX/g.L-1.h-1产物生产强度PP/U.ml-1.h-1细胞比生长速率μ/h-1产物比合成速率qp/h-1YX/S/g.g-1YP/S/U.g-1KLα/h-1

21.670.310.260.270.074.214.17194.3

实施例3：

嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophilus YL001发酵液的应用在实施例1、2的基础上进行：

1、工艺中得到的发酵液进一步在14000r/min、4℃离心10min，收集上清液；

2、用融化的PDA培养基将上清液和发酵物稀释10倍，分别将10ml培养基到入直径9.0cm的灭菌培养皿内，制成平板，以加无菌培养基的PDA为对照。从培养3～6d的植物病原真菌菌落边缘，用打孔器切成直径7.5mm的菌块，置于平板中央，于20℃黑暗条件下培养3d，测量各病原菌菌落直径；

2、Xenorhabdus nematophilus YL001上清液，在300～500ml/L剂量下，对烟草赤星菌、番茄早疫菌、南瓜枯萎菌、黄瓜炭疽菌、稻瘟菌和辣椒疫霉菌菌丝生长有较强的抑制作用，抑制率在70～90％；发酵物对辣椒疫霉菌有较强的抑制作用，EC₅₀为26.3ml/L。

实施例4：

嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophilus YL001发酵液的应用在实施例1、2的基础上进行：

1、发酵液在14000r/min、4℃离心10min，收集上清液；

2、将熔化的营养琼脂培养基冷却至45℃～50℃，加入供试病原细菌(1.5％V/V)摇均，每皿(d＝9.0cm)倒入15ml培养基，制好平板后，用打孔器(直径7.5mm)在平板上均匀的打三个孔，每孔内加入100μl共生菌发酵液或发酵物，以培养基为对照，在28℃培养24h，测量抑菌圈直径；

3、X.nematophilus YL001的上清液和发酵物对金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用(发酵液、发酵物的抑菌圈直径分别为21.50mm、19.25mm)；水稻白叶枯菌次之；对沙门氏菌的抑制作用较弱(发酵液、发酵物的抑菌圈直径分别为11.50mm、13.13mm)。

实施例5：

嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophilus YL001发酵液的应用在实施例1、2的基础上进行：

取发酵物65升，十二烷基苯磺酸钠25升，0.5kg/L苯甲酸水溶液10升，在反应釜中搅拌均匀，即得100升昆虫病原线虫共生菌杀菌剂。该杀菌剂用于防治辣椒疫霉病。

实施例6：

本实施例与实施例5不同的是，取发酵物80升，二丁基萘磺酸钠15升，0.5kg/L苯甲酸水溶液5升，在反应釜中搅拌均匀，即得100升昆虫病原线虫共生菌杀菌剂。其余同实施例5。

实施例7：

本实施例与实施例5不同的是，取发酵物70升，聚羧酸酯钠盐20升，0.5kg/L山梨酸水溶液10升，在反应釜中搅拌均匀，即得100升昆虫病原线虫共生菌杀菌剂。其余同实施例5。

实施例8：

本实施例与实施例5不同的是，取发酵物85升，琥珀酸二辛酯磺酸钠10升，0.5kg/L苯甲酸钠水溶液5升，在反应釜中搅拌均匀，即得100升昆虫病原线虫共生菌杀菌剂。其余同实施例5。

实施例9：

嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophilus YL001发酵物的应用在实施例5～实施例8的基础上进行：

从培养3～6d的辣椒疫霉菌菌落边缘，用打孔器切成直径7.5mm的菌块，置于含灭菌蛭石的花盆中，将辣椒种子用实施例6杀菌剂100倍稀释液浸种6小时，用清水冲洗两遍，播于含无菌蛭石纸杯中的辣椒疫霉菌块上，然后在上面覆一层无菌蛭石，并洒水。以蒸馏水浸种的为对照，在25℃培养，分别在第12天调查幼苗的发病情况，辣椒幼苗的病株减退率分别为66.2％。

实施例10：

嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophilus YL001发酵液的应用在实施例5～实施例8的基础上进行：

将已萌发的种子播于含无菌蛭石花盆中的辣椒疫霉菌块上，上面覆一层无菌蛭石，并洒水。在25℃培养24h，然后将浓度为200mL/L的昆虫病原线虫共生菌杀菌剂及1.7mL/L甲霜灵液体25mL分别浇灌于花盆中，以自来水为对照，以不含辣椒疫霉菌块的为健康对照。在25℃～28℃下培养12d，检查幼苗的发病情况，辣椒幼苗的病株减退率分别为73.34％；甲霜灵处理后辣椒幼苗的病株减退率分别为64.90％。

Claims (10)

1.一种昆虫病原线虫共生菌的发酵工艺，发酵菌株为嗜线虫致病杆菌Xenorhabdusnematophilus YL001；其特征在于：

1)将种管保存的上述嗜线虫致病杆菌，划线于NA培养基平板上，28℃培养24～48h，挑取单菌落，再划线于NBTA培养基平板上，28℃培养24～48h；

2)用接种环挑取NBTA培养基平板上的蓝色菌落，接种于装有50ml NB培养基的250ml三角瓶中，28℃、180r/min振荡培养16-24h，成为一级种子液；

3)将一级种子液按1-15％的接种量接入装有种子培养基的250ml三角瓶中，装液量为25-125ml，pH4-10.0，在20.0-37.0℃、80-240r/min振荡培养16-24h，成为二级种子液；

4)在7L搅拌式发酵罐内加入3.5-5.5L发酵培养基，0.01％消泡剂，pH6.8-7.4，离位0.1-0.15MPa蒸汽灭菌30min冷却至28℃，按10.0％接入二级种子液，在28℃、通气量2.0-2.5L/min、搅拌转速200-300rpm条件下，培养72-96h，即可获得发酵物，将发酵物过滤，去除细胞得到发酵液；或

在70L搅拌式发酵罐内加入35-55L发酵培养基，0.01％消泡剂，pH6.8-7.4，0.1-0.15MPa蒸汽灭菌30min冷却至28℃，按10.0％接入二级种子液，在28℃、通气量30-60L/min、搅拌转速100-200rpm、罐压0.03-0.05MPa条件下，培养72-96h，即可获得发酵物，将发酵物过滤，去除细胞得到发酵液。

2、如权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，步骤1)所述的NA培养基为：牛肉膏3.0g、蛋白胨5.0g、营养琼脂20g、水1000ml、PH7.2～7.4；所述的NBTA培养基为：NA培养基+(TTC 0.04g、BTB 0.025g)；步骤2)所述的NB培养基为：牛肉膏3.0g、蛋白胨5.0g、水1000ml，PH7.2～7.4；步骤3)所述的种子培养基的每升溶液中含有下列重量的原料：葡萄糖6.13g、蛋白胨21.29g、MgSO₄ 1.50g、(NH₄)₂SO₄ 2.46g、KH₂PO₄0.86g、K₂HPO₄ 1.11g、Na₂SO₄ 1.72g。

3、如权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，步骤3)所述的一级种子液接种量为9.1％，pH7.25、装液量25ml、摇床转速220rpm、培养温度26.2℃。

4、如权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，步骤4)所述的消泡剂为丙三醇聚氧丙烯聚氧乙烯醚。

5、如权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，步骤4)所述的7L搅拌式发酵罐的通气量为2.5L/min，搅拌转速为300rpm。

6、如权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，步骤4)所述的发酵培养基每升含有下列重量的原料：玉米粉9.69g、豆饼粉51.57g、棉饼粉6.88g、鱼粉13.75g、酵母粉4.30g、MgSO₄ 1.07g、(NH₄)₂SO₄ 1.79g、KH₂PO₄ 0.63g、K₂HPO₄ 0.80g、Na₂SO₄ 1.25g。

7、如权利要求1所述的一种昆虫病原线虫共生菌的发酵工艺，其特征在于，步骤(4)所述的70L搅拌式发酵罐的通气量为40L/min，搅拌转速为150rpm。

8.嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophilus YL001的发酵液用于制备防治辣椒疫霉病害的农用杀菌剂的应用。

9.一种防治辣椒疫霉病害的昆虫病原线虫共生菌的杀菌剂，其特征在于，该杀菌剂由下列组分的体积百份比构成：嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophilus YL001的发酵液60％-85％，助剂1％-5％，余为表面活性剂，上述组分的总和为100％。

10.如权利要求9所述的杀菌剂，其特征在于，所述的助剂是苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸等物质中的一种，表面活性剂为本领域工作人员公知的物质的组合物。