CN1932006A

CN1932006A - 防治蔬菜疫病的生防菌株与制剂的制备方法

Info

Publication number: CN1932006A
Application number: CN 200610117059
Authority: CN
Inventors: 张雪洪; 刘海明; 蒋海霞; 许煜泉
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2006-10-12
Filing date: 2006-10-12
Publication date: 2007-03-21

Abstract

本发明涉及一种防治蔬菜疫病的生防菌株与制剂的制备方法，首先利用甜椒根须和附着于根须的土壤样品，以及添加抗生素的KMB培养基，培养筛选出一种绿针假单胞菌GP72(Pseudomonas chlororaphis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏号为1748。然后利用活化冷冻保藏的菌株进行放大培养，所得到的微生物制剂可用于对辣椒、黄瓜、冬瓜、南瓜、番茄、茄子、韭菜、大蒜、菜豆、豇豆的疫病防治；用于对油菜菌核病、黄瓜枯萎病、西瓜枯萎病、西瓜炭疽病、棉花立枯病、水稻纹枯病的防治；还可以作为蔬菜生长促进剂使用，提高蔬菜产量。

Description

防治蔬菜疫病的生防菌株与制剂的制备方法

技术领域

本发明涉及一种防治蔬菜疫病的生防菌株与制剂的制备方法，具体涉及一种微生物菌株绿针假单胞菌GP72(Pseudomonas chlororaphis)，利用该菌株制备微生物制剂的方法，以及该微生物制剂在防治蔬菜疫病等植物土传性真菌病害方面的应用。属于生物防治和生物工程技术领域。

背景技术

我国的蔬菜种植面积大，产量高。2005年全国蔬菜种植面积1774万公顷，总产量为5.63亿吨。每年因病虫害而造成的蔬菜经济损失难以估计，其中蔬菜疫病是一种常见的蔬菜病害。

蔬菜疫病由鞭毛菌亚门疫霉属的真菌侵染所致，病原菌可以侵染黄瓜、冬瓜、南瓜、番茄、辣椒、茄子、韭菜、大蒜、菜豆、豇豆等十余种蔬菜，植株的叶、茎、果实等部位均可发病。在生产中，为害较重的有黄瓜疫病、辣椒疫病、番茄晚疫病、茄子绵疫病、韭菜疫病等。

高温多湿季节易发生蔬菜疫病，给蔬菜生产带来重大损失。防治不及时则会造成植株腐烂和大量死亡，引起大量减产，损失严重。

目前控制蔬菜疫病的蔓延的主要措施是喷洒化学药剂，但是化学农药的广泛使用而引起的各种问题也接踵而来，如造成残毒、土质退化、污染环境及病虫害抗药性的产生等。对于人体健康、生态环境造成了很大的威胁，不利于农业生产的可持续发展。目前绿色农业、食品安全、无公害蔬菜、无污染蔬菜的概念已日益深入人心。尽管国外有转基因蔬菜问世，但是其生物安全性仍有争议。

1980年以来，利用微生物进行植物病虫害的生物防治方法逐渐受到人们的重视。由于植物根际促生细菌(PGPR)具有天然防治植物病害与促进植物生长的特点，并且低毒，对环境相容性好，因此研制新型的微生物疫病防治和生长促进菌剂非常必要。绿针假单胞菌是一种常见的拮抗微生物，利用绿针假单胞菌进行农作物的防治时有报告，绝大多数对人体无害。

目前，国际上能有效防治蔬菜疫病的微生物制剂未见报道，也没有防治蔬菜疫病的生物农药的报道。

发明内容

本发明的目的在于针对目前对蔬菜疫病缺乏有效的生物防治手段，提供一种防治蔬菜疫病的生防菌株与制剂的制备方法，得到的生防菌制剂可以防治土传性真菌病害，对各种蔬菜作物的疫病有较好的防治效果。

为实现这一目的，本发明采集不同甜椒根际土样，取甜椒根须和附着于根须的土壤样品溶于1/3KMB液体培养基中，并添加抗生素，重复振荡培养后，再经含同样剂量抗生素的KMB琼脂平板培养，待长出单菌落后用异步培养法进行辣椒疫霉抑菌性试验，从中筛选出具有最大抑菌活性的强拮抗菌株——绿针假单胞菌GP72(Pseudomonas chlororaphis)，该菌株现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，菌株保藏号为1748。再利用活化冷冻保藏的菌株进行放大培养制备微生物制剂，可用于防治各种蔬菜作物的疫病。

本发明所述的一种防治蔬菜疫病等真菌病害的生防菌株CGMCC 1748的生物学特性如下：

1、形态特征：杆状，0.3μm～0.8μm×1.0μm～1.1μm，革兰氏染色阴性，无芽孢，单极生鞭毛，能运动。在KMB培养基上形成的1.2mm菌落，菌落可产生橙色色素，圆形，表面凸起，光滑，较粘稠，易挑起，边缘整齐。

2、培养特征：该菌株在在KMB培养基上培养形成菌落，菌落可产生橙色色素，圆形，表面凸起，光滑，较粘稠，易挑起，边缘整齐。

3、菌株的生理生化特性：能产生荧光色素，能水解脂酶、氧化酶、过氧化氢酶、柠檬酸盐、明胶，不水解淀粉，不产生H₂S。菌株GP72最适培养温度为28℃～32℃，最适生长pH值为7.0～8.0，可产生橙色非荧光色素，能利用卵磷脂酶，可把蔗糖转化为果聚糖，不产生脓青素，也不进行反硝化作用。

4、菌株具有良好的稳定性：将该菌株置于-70℃冰柜中保存，传代5次仍保持菌株的活性稳定。本菌株的发酵液在4℃以下可以贮存一年。

本发明所述的防治蔬菜疫病的生防菌株与制剂的制备方法具体如下：

1、菌株的获得：采集不同甜椒根际土样若干，称取甜椒根须和附着于根须的土壤样品溶于1/3KMB液体培养基中，甜椒根须、土壤样品与1/3KMB液体培养基的质量比为1∶0.5～3∶30～80，在培养液中添加抗生素氨苄青霉素40μg/ml、氯霉素13μg/ml、放线菌酮100μg/ml，28～32℃下180～280rpm/min摇床振荡1～2小时，将6个平行样品混和，以减少随机性。然后取200μl培养液涂布于含同样剂量抗生素的KMB琼脂平板上，在28～32℃条件下培养16～18小时，待长出单菌落后用异步培养法进行辣椒疫霉抑菌性试验，从中筛选出具有最大抑菌活性的强拮抗菌株，即为绿针假单胞菌GP72(Pseudomonaschlororaphis)，CGMCC 1748。

2、微生物制剂的制备：用King’s B培养基(KMB培养基)活化冷冻保藏的CGMCC 1748菌株，然后将上述的培养物移入摇瓶放大培养，按1％～5％接种量进行接种后，在水浴摇床中震荡培养，作为种子液，然后，进行摇瓶放大生产或发酵生产制备微生物制剂，接种量为2％～5％，培养温度为28℃～32℃，生长pH值为7.0～8.0，发酵周期为36～60小时。

本发明所述King’s B培养基(KMB培养基)的组分为：蛋白胨15～25g，甘油10～20g，KH₂PO₄ 0.3～0.5g，无水MgSO₄ 0.6～0.9g琼脂14～20g，pH7.0～8.0，定容至1L。

本发明所述1/3KMB液体培养基的组分与KMB相同，但无琼脂，最后定容至3L。

本发明制备得到的微生物制剂可用于防治蔬菜疫病等真菌病害，包括对辣椒、黄瓜、冬瓜、南瓜、番茄、茄子、韭菜、大蒜、菜豆、豇豆等蔬菜的疫病防治，对油菜菌核病、黄瓜枯萎病、西瓜枯萎病、西瓜炭疽病、棉花立枯病、水稻纹枯病等真菌引起的植物土传病害的防治。经试验，对于辣椒、黄瓜、冬瓜、南瓜、番茄、茄子等蔬菜作物的疫病有较好的防治效果，对于其他的土传性真菌病害如油菜菌核病、黄瓜枯萎病、西瓜枯萎病等病害的防治效果达50～80％。

本发明的微生物制剂还可用于蔬菜生长的促进剂。使用本发明的制剂，可有效的促进植物的增长，与对照和常规栽培技术相比，菌剂处理后蔬菜幼苗的营养生长和生殖生长都明显加快，生物活菌剂表现出明显的促进作物生长的作用，可提高收获物的产量。

本发明的菌株可以作为生物农药的生产菌株。使用本发明的制剂可以避免化学农药造成的土壤污染、土质退化、农药残留、抗药性病害的产生和再次蔓延等严重的问题。

菌株分类命名：绿针假单胞菌GP72(Pseudomonas chlororaphis)，

保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，

保藏日期：2006年7月

保藏编号：1748

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。

实施例1：

1、菌株的获得：采集不同甜椒根际土样若干，称取1g甜椒根须和1g附着于根须的土壤样品溶于50ml 1/3 KMB液体培养基中，并添加抗生素：氨苄青霉素(40μg/ml)、氯霉素(13μg/ml)、放线菌酮(100μg/ml)，28℃下230rpm/min摇床振荡1小时，将6个平行样品混和，从中取200μl培养液涂布于含同样剂量抗生素的KMB琼脂平板上。在28℃培养18h待长出单菌落后用异步培养法进行辣椒疫霉抑菌性试验，从中筛选出具有最大抑菌活性的强拮抗菌株，鉴定为绿针假单胞菌GP72(Pseudomonas chlororaphis)。

该菌株现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，菌株保藏号为1748。

2、微生物制剂的制备：用King’s B培养基(KMB)活化冷冻保藏的CGMCC1748菌株，然后将上述的培养物移入摇瓶放大培养，按2％接种量进行接种后，在水浴摇床中震荡培养，作为种子液，然后，进行摇瓶放大生产或发酵生产制备微生物制剂，接种量为5％，培养温度为28℃，生长pH值为7.0，发酵周期为48小时。

上述KMB培养基的组分为：蛋白胨18g，甘油16g，KH₂PO₄ 0.392g，无水MgSO₄ 0.732g琼脂16g，pH7.5，定容至1L。

上述1/3KMB液体培养基的组分与KMB相同，但无琼脂，最后定容至3L。

获得的微生物制剂对甜椒疫病的防治应用：

处理方法：取上述含GP72菌液的微生物制剂(10⁹CFU/mL)，稀释150倍，对甜椒幼苗灌根，叶面喷雾。与对照和常规栽培技术相比，菌剂处理后幼苗的营养生长和生殖生长都明显加快，经处理的幼苗每株平均株高提高10％以上，叶片数增加20％以上，花蕾数增加20％以上。微生物活菌制剂表现出明显的促进作物生长的作用。

实施例2：

1、菌株的准备：用接种针挑取冷冻保藏的菌株(绿针假单胞菌GP72)样品，加入0.2ml无菌水待样品溶解后转入KMB培养基培养16小时。

2、微生物制剂的制备：将上述的培养物移入摇瓶放大培养，按3％接种量进行接种后，在水浴摇床中震荡培养，作为种子液，然后，进行摇瓶放大生产或发酵生产制备微生物制剂，接种量为4％，培养温度为28℃，生长pH值为7.5，发酵周期为60小时。

上述KMB培养基的组分为：蛋白胨20g，甘油15g，KH₂PO₄ 0.50g，无水MgSO₄ 0.75g琼脂16g，pH7.5，定容至1L。

获得的微生物制剂对黄瓜枯萎病的防治应用：

处理方法：取上述含GP72菌液的微生物制剂(2*10⁹CFU/mL)，稀释200倍。将黄瓜种子在菌悬液浸泡30min后沥干，与干泥拌匀后播种。苗床经稀释的菌悬液浇灌后，供使用。苗床和秧苗以及定植时，都用稀释的菌悬液浇灌。分别在定植后的40天考查了霜霉病的发病率及危害程度，定植后的56天考查了黄瓜枯萎病发病株数。发现与未使用生防菌制剂的常规栽培对照组相比，黄瓜的枯萎病发病率下降75％左右，霜霉病的病情指数也分别下降90％。表明该制剂能有效地抑制土壤中的枯萎病菌。

Claims

1、一种防治蔬菜疫病的生防菌株，其特征在于：所述的菌株为绿针假单胞菌GP72(Pseudomonas chlororaphis)，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，菌株保藏号为1748。

2、一种权利要求1所述的防治蔬菜疫病的生防菌株制剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

1)菌株的获得：采集不同甜椒根际土样若干，称取甜椒根须和附着于根须的土壤样品溶于1/3KMB液体培养基中，甜椒根须、土壤样品与1/3KMB液体培养基的质量比为1∶0.5～3∶30～80，在培养液中添加抗生素氨苄青霉素40μg/ml、氯霉素13μg/ml、放线菌酮100μg/ml，28～32℃下180～280rpm/min摇床振荡1～2小时，将6个平行样品混和；然后取200μl培养液涂布于含同样剂量抗生素的KMB琼脂平板上，在28～32℃条件下培养16～18小时，待长出单菌落后用异步培养法进行辣椒疫霉抑菌性试验，从中筛选出具有最大抑菌活性的强拮抗菌株，即为绿针假单胞菌GP72(Pseudomonaschlororaphis)，CGMCC 1748；

2)微生物制剂的制备：用KMB培养基活化冷冻保藏的CGMCC 1748菌株，然后将上述的培养物移入摇瓶放大培养，按1％～5％接种量进行接种后，在水浴摇床中震荡培养，作为种子液，然后，进行摇瓶放大生产或发酵生产制备微生物制剂，接种量为2％～5％，培养温度为28℃～32℃，生长pH值为7.0～8.0，发酵周期为36～60小时；

其中，所述KMB培养基的组分为：蛋白胨15～25g，甘油10～20g，KH₂PO₄0.3～0.5g，无水MgSO₄ 0.6～0.9g琼脂14～20g，pH7.0～8.0，定容至1L；

所述1/3KMB液体培养基的组分与KMB相同，但无琼脂，最后定容至3L。

3、一种权利要求2的防治蔬菜疫病的生防菌株制剂的应用，其特征在于用于对辣椒、黄瓜、冬瓜、南瓜、番茄、茄子、韭菜、大蒜、菜豆、豇豆的疫病防治；用于对油菜菌核病、黄瓜枯萎病、西瓜枯萎病、西瓜炭疽病、棉花立枯病、水稻纹枯病的防治；用于蔬菜生长促进剂。