CN110144301B - 一种绿针假单胞菌及其培养方法与应用 - Google Patents

一种绿针假单胞菌及其培养方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种绿针假单胞菌，该绿针假单胞菌为绿针假单胞菌Pseudomonas chlororaphis Pc‑HG28‑5，保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC No.14208。该绿针假单胞菌是从小麦根部分离、筛选出的植物根际促生细菌，可以采用蛋白胨培养基进行培养。该绿针假单胞菌可以降低种衣剂的副作用，防止疫病，降低植物根际土壤中有害真菌数量。

Description

一种绿针假单胞菌及其培养方法与应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体地，涉及一种绿针假单胞菌及其培养方法与应用。
背景技术
植物根际促生细菌(Plant Growth Promoting Rhizobacteria，简称PGPR)是指存在于植物根际环境中，通过产生植物激素、溶解无机磷等直接作用和竞争生态位、诱导植物系统抗性等间接作用促进植物生长的一类有益细菌。近年来大量研究表明，PGPR菌株能在植物根系及根际土壤有效定殖，具有显著的促生、防病和增产效果、同时调节植物根际土壤微生态环境、缓解生态污染等特性，成为有机生态农业可持续发展的有效途径之一，应用前景十分广阔。
种衣剂是根据种子或种苗的特性加工而成的一种种子处理剂，具有保护种子、提供营养、增强抗逆性、缓慢释放药肥等作用。但是种衣剂也具有一定的副作用，例如：影响种子出苗，降低出苗整齐度，甚至造成畸形苗；产生药害，影响植物生长发育，降低作物产量和品质，污染植物根际土壤环境，降低土壤肥力等等。利用有益PGPR菌株提高植物免疫能力，防治植物病害，提高产量和品质，同时减少种衣剂副作用，是农业可持续发展的新途径。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种绿针假单胞菌及其培养方法与应用，以解决上述问题。
具体地，本发明采取如下技术方案：
本发明提供一种绿针假单胞菌，它为绿针假单胞菌Pseudomonas chlororaphisPc-HG28-5，已于2017年06月01日，保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.14208。菌株的分类命名为Pseudomonas chlororaphis Pc-HG28-5。
本发明所得到的菌株具有以下生物学特性：
该菌株的菌体为微弯的杆状，直径0.6～0.8μm，长1.5～2.8μm，革兰氏阴性，多个极生鞭毛。生长温度范围为4～40℃，最适生长温度为30℃，最高耐盐浓度为5％。在营养琼脂(NA)平板上菌落呈米白色，圆形，表面光滑湿润，不透明，边缘整齐。能利用蔗糖、葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、丙酸盐和丁酸盐，不能利用L-阿拉伯糖和山梨醇，硝酸盐还原、过氧化氢酶反应和明胶液化呈阳性，淀粉水解呈阴性，不产生H2S。另外，该菌株的16Sr DNA序列如序列1所示，该序列全长为1474bp，Pseudomonas chlororaphis(绿针假单胞菌)的16Sr DNA序列同源性达到99％。
综上所述，综合该菌株的菌落形态、培养条件及分子生物学鉴定的结果表明：该菌株属于假单胞菌属Pseudomonas的绿针假单胞菌，其分类命名记为Pseudomonaschlororaphis Pc-HG28-5。
本发明提供一种所述的绿针假单胞菌的培养方法，它包括采用蛋白胨培养基对所述绿针假单胞菌进行培养的步骤，其中，所述绿针假单胞菌是从小麦根部分离、筛选得到的。
本发明提供一种绿针假单胞菌菌液，它包括所述绿针假单胞菌和硫酸镁。
基于上述，所述绿针假单胞菌菌液中绿针假单胞菌的浓度为(1～2)×108CFU/ml。
基于上述绿针假单胞菌菌液，它是通过浓度为0.05～0.1mol/l的无菌硫酸镁溶液和所述绿针假单胞菌混合得到的。
基于上述绿针假单胞菌菌液，它是通过含硫酸镁的缓冲溶液和所述绿针假单胞菌混合得到的，以100质量份计，所述缓冲溶液包括以下质量份的组分：柠檬酸钠0.02～0.1份、硫酸铵0.1～0.2份、磷酸氢二钾0.5～0.9份、磷酸二氢钾0.1～0.3份、硫酸镁0.01～0.05份、甘油0.5～1.5份、余量为无菌水。
本发明提供一种所述绿针假单胞菌菌液的应用方法，该方法包括播种前利用所述绿针假单胞菌菌液对种子进行浸泡，得到浸泡后的种子的步骤。
基于上述绿针假单胞菌菌液的应用方法，该方法还包括采用种衣剂对所述浸泡后的种子进行拌种的步骤。
本发明提供一种所述绿针假单胞菌菌液的应用方法，该方法包括移栽前利用所述绿针假单胞菌菌液对待移栽植株的根部进行浸泡和/或在移栽后20d之内对植株根部的土壤进行灌注处理的步骤。
本发明提供的绿针假单胞菌能强烈抑制辣椒、黄瓜、西红柿等植物生长过程中疫霉菌的菌丝生长，抑制游动孢子囊和游动孢子的形成，抑制游动孢子囊和休止孢子的发芽，抑制根际土壤疫霉菌、腐霉菌等病菌的浓度并防止病原菌侵入，因此，利用所述绿针假单胞菌配制的菌液对植物种子进行浸泡、对待移栽植株的根部进行浸泡和/或对移栽后植株的土壤进行浇灌，可以防治疫病的发生，促进植株生长，并显著提高根系活力，提高产量；进一步，在采用所述绿针假单胞菌液对种子进行浸泡之后，再与种衣剂进行拌种，还可以有效降低种衣剂的副作用。
序列表中：
序列1为本发明提供的绿针假单胞菌的DNA序列。
附图说明
图1实施例1中所述菌落的形态图。
图2根据16Sr DNA测序结果构建的系统发育树，图2中括号内为该菌株在GenBanK中的收录号，分支上的数字代表置信度。
图3处理一和处理二中辣椒根系活力的对比图。
图4处理一和处理二中辣椒根际土壤中脲酶活性的对比图。
图5处理一和处理二中辣椒根际土壤中磷酸酶活性的对比图。
图6处理一和处理二中辣椒根际土壤中蔗糖酶活性的对比图。
图7处理一和处理二中辣椒根际土壤中过氧化氢酶活性的对比图。
图8处理一和处理二中辣椒根际土壤速效氮含量的对比图。
图9 Pc-HG28-5菌液处理对辣椒根部疫病的防治效果图。
图10 Pc-HG28-5菌液处理对辣椒叶部疫病的诱导抗性效果图。
图11 Pc-HG28-5菌液处理对辣椒叶部疫病的诱导抗性效果叶片放大图。
图12处理三和处理四中辣椒根系活力的对比图。
图13处理三和处理四中辣椒根际土壤中脲酶活性的对比图。
图14处理三和处理四中辣椒根际土壤中磷酸酶活性的对比图。
图15处理三和处理四中辣椒根际土壤中蔗糖酶活性的对比图。
图16处理三和处理四中辣椒根际土壤中过氧化氢酶活性的对比图。
图17处理三和处理四中辣椒根际土壤速效氮含量的对比图。
图18是缓冲溶液和无菌硫酸镁溶液的抗病效果对比图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种从小麦根部及其根际土壤中的植物根际促生细菌菌群筛选出的绿针假单胞菌，绿针假单胞菌的获取和培养方法包括以下步骤：
菌株的获取采集健康生长优越的小麦带土根部剪取1g，用研钵研碎，并用无菌水稀释至10000倍，将稀释好得到的混合液均匀地涂在1/10TSA培养基平板上，倒置放于28℃恒温培养箱中培养48h，待菌株长出后，用无菌牙签挑取大小、颜色和形态不同的细菌菌落，在TSA培养基平板上划线分离纯化，纯化后的菌株放-70℃超低温冰箱里保存；将分离纯化得到的菌株通过室内试验和田间试验反复筛选得到具有防病、促生和缓解种衣剂副作用的菌株。
菌株的鉴定采用TSA培养基在25～30℃对所述菌株进行培养3～5天形成菌落，所述菌落的形态参见图1，由图1可知，所述菌落呈米白色，圆形，表面光滑湿润，不透明，边缘整齐。
16Sr DNA鉴定利用16Sr DNA鉴定对所述菌株的种属进行鉴定，测序结果见序列1，根据16Sr DNA测序结果构建的系统发育树参见图2；所述菌株的16Sr DNA序列全长为1474bp，和Pseudomonas chlororaphis(绿针假单胞菌)的16Sr DNA序列同源性达到99％，所以该菌株为绿针假单胞菌Pseudomonas chlororaphis Pc-HG28-5。
实施例2
本实施例提供一种绿针假单胞菌菌液，它是由实施例1提供的绿针假单胞菌Pseudomonas chlororaphis Pc-HG28-5和浓度为0.1mol/l无菌硫酸镁溶液配制得到的悬浮液，且所述绿针假单胞菌菌液中绿针假单胞菌的浓度为2×108CFU/ml。
实施例3
本实施例提供一种绿针假单胞菌菌液，它是通过含硫酸镁的缓冲溶液和所述绿针假单胞菌混合得到的，所述绿针假单胞菌菌液中绿针假单胞菌的浓度为1×108CFU/ml；以100质量份计，所述缓冲溶液包括：柠檬酸钠0.02份、硫酸铵0.15份、磷酸氢二钾0.5份、磷酸二氢钾0.1份、硫酸镁0.03份、甘油0.5份、余量为无菌水。
实施例4
本实施例提供一种绿针假单胞菌菌液，本实施例与实施例3的区别在于：以100质量份计，所述缓冲溶液包括：柠檬酸钠0.1份、硫酸铵0.2份、磷酸氢二钾0.9份、磷酸二氢钾0.3份、硫酸镁0.05份、甘油1.5份、余量为无菌水。
实施例5
本实施例提供一种绿针假单胞菌菌液，本实施例与实施例3的区别在于：以100质量份计，所述缓冲溶液包括：柠檬酸钠0.05份、硫酸铵0.1份、磷酸氢二钾0.7份、磷酸二氢钾0.2份、硫酸镁0.01份和甘油1份、余量为无菌水。
性能验证
(一)利用实施例2得到的所述绿针假单胞菌菌液(以下简称Pc-HG28-5菌液)进行四组对比试验验证本发明得到的绿针假单胞菌Pseudomonas chlororaphis Pc-HG28-5(以下简称Pc-HG28-5)对辣椒生长的影响。
处理一、利用Pc-HG28-5菌液处理3次：播种前利用Pc-HG28-5菌液对辣椒种子浸种2h；移栽前利用Pc-HG28-5菌液将待移栽辣椒的根际完全浸透；移栽后20d之内，按照200ml/株的用量对辣椒的根际土壤进行灌注处理；辣椒栽培的其它条件和常规的辣椒栽培条件相同。
处理二、处理二为对照试验，处理二和处理一的区别在于：栽培过程未使用Pc-HG28-5菌液，仅使用浓度为0.1mol/l无菌硫酸镁溶液对辣椒种子浸种。
处理四、处理四和处理二的区别在于：播种前采用克醇福美双对辣椒种子进行拌种。
处理三、处理三和处理四的区别在于：播种前先采用Pc-HG28-5菌液对辣椒种子浸种2h，再采用克醇福美双种衣剂对辣椒种子进行拌种，然后再进行播种。
Pc-HG28-5菌液处理对辣椒出苗情况的影响参见表1，Pc-HG28-5菌液处理对辣椒苗期生长的影响参见表2，Pc-HG28-5菌液处理对辣椒现蕾期地上部生长的影响参见表3，Pc-HG28-5菌液处理对辣椒根系活力的影响参见图3，Pc-HG28-5菌液处理对辣椒产量的影响参见表4，Pc-HG28-5菌液处理对辣椒品质的影响参见表5，Pc-HG28-5菌液处理对辣椒根际土壤酶活性的影响参见图4～7，Pc-HG28-5菌液处理对辣椒根际土壤微生物的影响参见表6，Pc-HG28-5菌液处理对辣椒根际土壤速效氮含量的影响参见图8，Pc-HG28-5菌液处理对辣椒疫病的影响参见表7和图9，图9中，A是Pc-HG28-5菌液处理后接种辣椒疫霉菌的状态；B是对照试验中接种辣椒疫霉菌的状态；C是对照试验中未接种辣椒疫霉菌的状态；Pc-HG28-5菌液处理对辣椒叶部疫病的诱导抗性效果参见表8和图10～11，图10～11中，A是Pc-HG28-5菌液处理后辣椒叶部产生对疫病的诱导抗性的状态；B是对照试验中辣椒叶部发生疫病的状态。
表1处理一和处理二中辣椒出苗情况对比表
出苗率(％) 出苗势(％) 出苗指数
处理一 98.67±0.67a* 78.67±1.76a 26.60±0.18a
处理二 97.33±0.67a 35.33±0.67b 21.34±0.24b
表2处理一和处理二中辣椒苗期生长情况对比表
Figure GDA0003313261190000071
表3处理一和处理二中辣椒现蕾期地上部生长情况对比表
Figure GDA0003313261190000072
表4处理一和处理二中辣椒产量对比表
单株产量(kg) 亩产量(kg·(667m2)-1) 增产率(％)
处理一 2.61±0.01a 3388.83±10.94a 14.22
处理二 2.28±0.00b 2966.88±5.41b —
表5处理一和处理二中辣椒品质对比表
Figure GDA0003313261190000081
表6处理一和处理二中辣椒各个时期根际土壤中微生物对比表
Figure GDA0003313261190000082
表7处理一和处理二中辣椒的疫病情况对比表
发病率(％) 防治效果(％)
处理一 11.11±2.78b 81.69
处理二 60.67±2.78a —
表8处理一和处理二中辣椒叶部产生对疫病的诱导抗性情况对比表
病情指数 防治效果(％)
处理一 0.00±0.00 100
处理二 43.33±1.33 —
由表1～8和图3～11可知，Pc-HG28-5可以改善辣椒出苗情况，对辣椒各个阶段的生长发育具有促进作用，提高辣椒的产量和品质；同时，Pc-HG28-5还能显著提高辣椒根际土壤脲酶、磷酸酶、蔗糖酶和过氧化氢酶活性；增加辣椒根际土壤细菌和放线菌的数量，减少辣椒根际土壤疫霉菌和腐霉菌；增加辣椒根际土壤速效氮含量；提高辣椒对疫病的抵抗力。
处理三和处理四中辣椒各个阶段生长情况对比数据具体参见表9～14和图12～17所示。
表9处理三和处理四中辣椒出苗情况对比表
出苗率(％) 出苗势(％) 出苗指数
处理三 96.67±2.40a 43.33±2.53a 9.92±0.32a
处理四 97.33±0.67a 26.67±1.81b 7.84±0.28b
表10处理三和处理四中辣椒苗期生长情况对比表
Figure GDA0003313261190000091
表11处理三和处理四中辣椒现蕾期地上部生长情况对比表
株高(cm) 茎粗(mm) 叶片数
处理三 32.77±0.66a 6.74±0.15a 23.53±1.90a
处理四 28.91±1.51b 6.63±0.15a 22.93±0.64a
表12处理三和处理四中辣椒产量情况对比表
单株产量(kg) 亩产量(kg·(667m<sup>2</sup>)<sup>-1</sup>)
处理三 2.59±0.04a 3366.73±51.48a
处理四 2.16±0.01b 2811.00±15.46b
表13处理三和处理四中辣椒品质情况对比表
Figure GDA0003313261190000101
表14处理三和处理四中辣椒各个时期根际土壤中微生物对比表
Figure GDA0003313261190000102
由上表9～14和图12～17可知，Pc-HG28-5处理能够降低克醇福美双种衣剂的副作用。
(二)验证缓冲溶液的作用
对比试验组1本试验提供一组绿针假单胞菌菌液，它是由实施例1提供的绿针假单胞菌Pseudomonas chlororaphis Pc-HG28-5和浓度为0.1mol/l无菌硫酸镁溶液配制得到的悬浮液，且所述绿针假单胞菌菌液中绿针假单胞菌的浓度分别为1×109CFU/ml、1×108CFU/ml和1×107CFU/ml。
对比试验组2本试验提供一组绿针假单胞菌菌液，它是由实施例1提供的绿针假单胞菌Pseudomonas chlororaphis Pc-HG28-5和缓冲溶液配制得到的悬浮液，以100质量份计，所述缓冲溶液包括：柠檬酸钠0.02份、硫酸铵0.1份、磷酸氢二钾0.5份、磷酸二氢钾0.1份、硫酸镁0.01份和甘油0.5份；且所述绿针假单胞菌菌液中绿针假单胞菌的浓度分别为1×109CFU/ml、1×108CFU/ml和1×107CFU/ml。
验证试验利用对比试验组1和对比试验组2得到的Pc-HG28-5菌液处理3次，播种前利用Pc-HG28-5菌液对辣椒种子浸种2h；移栽前利用Pc-HG28-5菌液将待移栽辣椒的根际完全浸透；移栽后20d之内，按照200ml/株的用量对辣椒的根际土壤进行灌注处理；辣椒栽培的其它栽培条件和常规的辣椒栽培条件相同。
空白试验本试验与验证试验基本相同，区别在于：利用对比试验组1中所述无菌硫酸镁溶液和对比试验组2中所述缓冲溶液进行处理。
对比试验组1、对比试验组2、所述无菌硫酸镁溶液和所述缓冲溶液处理对辣椒疫病发病率的影响参见图18。由图18可知，单独用所述无菌硫酸镁溶液和所述缓冲溶液处理辣椒疫病的发病率最高，在Pc-HG28-5菌浓度相同的条件下，对比试验组2中辣椒疫病的发病率明显低于对比试验组1的发病率，缓冲溶液可以有效提高Pc-HG28-5抗病效果。
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。
序列表
<110> 河南农业大学
<120> 一种绿针假单胞菌及其培养方法与应用
<130> 2016
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1474
<212> DNA
<213> 绿针假单胞菌Pseudomonas chlororaphis Pc-HG28-5
<400> 1
GCTCAGATTG AACGCTGGCG GCAGGCCTAA CACATGCAAG TCGAGCGGTA GAGAGAAGCT 60
TGCTTCTCTT GAGAGCGGCG GACGGGTGAG TAATGCCTAG GAATCTGCCT GGTAGTGGGG 120
GATAACGTTC GGAAACGGAC GCTAATACCG CATACGTCCT ACGGGAGAAA GCAGGGGACC 180
TTCGGGCCTT GCGCTATCAG ATGAGCCTAG GTCGGATTAG CTAGTTGGTG AGGTAATGGC 240
TCACCAAGGC GACGATCCGT AACTGGTCTG AGAGGATGAT CAGTCACACT GGAACTGAGA 300
CACGGTCCAG ACTCCTACGG GAGGCAGCAG TGGGGAATAT TGGACAATGG GCGAAAGCCT 360
GATCCAGCCA TGCCGCGTGT GTGAAGAAGG TCTTCGGATT GTAAAGCACT TTAAGTTGGG 420
AGGAAGGGTA CTTACCTAAT ACGTGAGTAT TTTGACGTTA CCGACAGAAT AAGCACCGGC 480
TAACTCTGTG CCAGCAGCCG CGGTAATACA GAGGGTGCAA GCGTTAATCG GAATTACTGG 540
GCGTAAAGCG CGCGTAGGTG GTTCGTTAAG TTGGATGTGA AATCCCCGGG CTCAACCTGG 600
GAACTGCATC CAAAACTGGC GAGCTAGAGT ATGGTAGAGG GTGGTGGAAT TTCCTGTGTA 660
GCGGTGAAAT GCGTAGATAT AGGAAGGAAC ACCAGTGGCG AAGGCGACCA CCTGGACTGA 720
TACTGACACT GAGGTGCGAA AGCGTGGGGA GCAAACAGGA TTAGATACCC TGGTAGTCCA 780
CGCCGTAAAC GATGTCAACT AGCCGTTGGG AGCCTTGAGC TCTTAGTGGC GCAGCTAACG 840
CATTAAGTTG ACCGCCTGGG GAGTACGGCC GCAAGGTTAA AACTCAAATG AATTGACGGG 900
GGCCCGCACA AGCGGTGGAG CATGTGGTTT AATTCGAAGC AACGCGAAGA ACCTTACCAG 960
GCCTTGACAT CCAATGAACT TTCCAGAGAT GGATTGGTGC CTTCGGGAAC ATTGAGACAG 1020
GTGCTGCATG GCTGTCGTCA GCTCGTGTCG TGAGATGTTG GGTTAAGTCC CGTAACGAGC 1080
GCAACCCTTG TCCTTAGTTA CCAGCACGTC ATGGTGGGCA CTCTAAGGAG ACTGCCGGTG 1140
ACAAACCGGA GGAAGGTGGG GATGACGTCA AGTCATCATG GCCCTTACGG CCTGGGCTAC 1200
ACACGTGCTA CAATGGTCGG TACAGAGGGT TGCCAAGCCG CGAGGTGGAG CTAATCCCAT 1260
AAAACCGATC GTAGTCCGGA TCGCAGTCTG CAACTCGACT GCGTGAAGTC GGAATCGCTA 1320
GTAATCGCGA ATCAGAATGT CGCGGTGAAT ACGTTCCCGG GCCTTGTACA CACCGCCCGT 1380
CACACCATGG GAGTGGGTTG CACCAGAAGT AGCTAGTCTA ACCTTCGGGA GGACGGTTAC 1440
CACGGTGTGA TTCATGACTG GGGTGAAGTC GTAA 1474

Claims (9)

1. 一种绿针假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis），其特征在于，它为绿针假单胞菌Pc-HG28-5，保藏号为CGMCC No.14208。
2.一种权利要求1所述的绿针假单胞菌的培养方法，其特征在于，它包括采用蛋白胨培养基对所述绿针假单胞菌进行培养的步骤，其中，所述绿针假单胞菌是从小麦根部分离、筛选得到的。
3.一种绿针假单胞菌菌液，其特征在于，它包括权利要求1所述的绿针假单胞菌和硫酸镁。
4. 根据权利要求3所述的绿针假单胞菌菌液，其特征在于，它中的绿针假单胞菌的浓度为（1～2）×108 CFU/ml。
5. 根据权利要求3或4所述的绿针假单胞菌菌液，其特征在于，它是通过浓度为0.05～0.1 mol/l的无菌硫酸镁溶液和所述绿针假单胞菌混合得到的。
6. 根据权利要求3或4所述的绿针假单胞菌菌液，其特征在于，它是通过含硫酸镁的缓冲溶液和所述绿针假单胞菌混合得到的，其中，所述缓冲溶液以100质量份计，包括以下质量份的组分：柠檬酸钠 0.02～0.1份、硫酸铵 0.1～0.2份、磷酸氢二钾 0.5～0.9份、磷酸二氢钾 0.1～0.3份、硫酸镁 0.01～0.05份、甘油 0.5～1.5份、余量为无菌水。
7.一种绿针假单胞菌菌液的应用方法，它包括播种前利用权利要求3～6任一项所述的绿针假单胞菌菌液对种子进行浸泡，得到浸泡后的种子的步骤。
8.根据权利要求7所述的绿针假单胞菌菌液的应用方法，其特征在于，它还包括采用种衣剂对所述浸泡后的种子进行拌种的步骤。
9.一种绿针假单胞菌菌液的应用方法，其特征在于，它包括移栽前利用权利要求3～6任一项所述的绿针假单胞菌菌液对待移栽植株的根部进行浸泡和/或在移栽后20 d之内对植株根部的土壤进行灌注处理的步骤。
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