CN109161511B - 一种诱导番茄抗南方根结线虫的不动杆菌及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种诱导番茄抗南方根结线虫的不动杆菌，其特征是：所述的不动杆菌的保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏日期为2018年8月24日；保藏编号为CGMCC No.16335。所述不动杆菌的菌剂具有诱导番茄抗南方根结线虫的用途，可诱导番茄在种子萌发和生长期间产生对南方根结线虫的抗性；本发明提出的不动杆菌对线虫具有防治作用，利用该菌或该菌株的代谢产物，可诱导番茄在种子萌发和生长期间产生对南方根结线虫的抗性，同时不动杆菌与杀线虫剂混合使用对根结线虫病具有优异的防效，可以降低化学农药的使用量，从而达到保护环境的目的。

Description

一种诱导番茄抗南方根结线虫的不动杆菌及应用
技术领域
本发明属于微生物农药技术领域，具体涉及一种诱导番茄抗南方根结线虫的不动杆菌及应用。
背景技术
近年来，随着我国温室塑料棚蔬菜生产的不断扩大，已将农业推向工厂化高度。但是，种植年限一长，重茬严重，病虫害严重影响保护地蔬菜生产的可持续发展。其中，根结线虫病普遍发生且日益严重。根结线虫是一种典型的土传病害，其寄主十分广泛，已超过3000种植物，以茄科、葫芦科、十字花科等植物受害尤为严重，已成为病虫害防治的世界性难题。据统计，由根结线虫引起的病害而造成的损失每年高达数百亿美元。由于采用轮作、抗线品种和化学防治等方法依然存才局限性，国际上逐渐采用生物防治的方法来控制病害的严重发生。
根结线虫的生防因子有很多，包括真菌、细菌、病毒和原生动物等。细菌由于易于培养、定殖，且对植物寄生线虫的致死性强，因此对生防细菌的研究比较多。已报道的可防治植物寄生线虫的生防细菌主要类群有：Bacillius，Pseudomonas，Acinebacter， Chromobacterium，Enterobacter，Serratia，Burkholderia等，其中以Bacillus和Pseudomonas中的种类最多。多样的生境造就了假单胞菌拥有较广的生长温度、pH值范围和较多的营养代谢类型。研究表明，不动杆菌可促进种子萌发、根生长、矿物营养尤其是磷的积累、水分的利用和防治植物病害，使得不动杆菌作为生防菌具有广阔的应用前景。研究发现不动杆菌属（Acinetobacter spp.）红树林聚磷微生物，在红树林生态系统中所扮演的角色。有研究表明不动杆菌（Acinetobacter ）Ab8可作为柑桔溃疡病生防细菌，盆栽抑制率可达到52. 6%, Tian等对菌Acinetobacter johnsonii的基因研究发现，其含有多个对线虫毒性的基因簇。Jang等研究发现 P. chlororaphis O6具有较强的杀线虫活性，推测是其产生的氰化物的起到重要作用。而利用不动杆菌的代谢产物对番茄种子进行处理，来防治南方根结线虫的方法尚未有报道。
发明内容
为了弥补上述现有技术的不足，本发明的目的是提出一种诱导番茄抗南方根结线虫的不动杆菌及应用，利用该菌或该菌株的代谢产物，可诱导番茄在种子萌发和生长期间产生对南方根结线虫的抗性，与杀线虫剂混合使用对根结线虫病具有优异的防效。
本发明提供了一种诱导番茄抗南方根结线虫的不动杆菌，所述的不动杆菌的保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏日期为2018年8月 24日 ；保藏编号为CGMCCNo. 16335，分类命名为Acinetobacter guillouiae。
本发明提供了一种不动杆菌菌剂的制备方法：其技术要点是：所述不动杆菌的液体发酵培养基为YMB培养基，成分为（g/L）：酵母提取物 1.0；甘露醇 10.0；磷酸氢二钾0.5；硫酸镁 0.2；氯化钠 0.1；碳酸钙1.0；pH 6.8 -7.0；发酵温度为25-28℃，摇床转速150r·min-1、发酵时间2-3d，，将不动杆菌的浓度调至浓度为107-108CFU/mL，制得不动杆菌菌剂。
本发明提供了一株诱导番茄抗南方根结线虫的不动杆菌菌剂的应用方法，其技术要点是：将番茄种子进行表面消毒，无菌水冲洗干净，晾干采用不动杆菌菌剂进行拌种处理，浓度为107-108CFU/mL，处理量为10-30 μL/g种子。
进一步的，所述不动杆菌菌剂可与杀线虫剂阿维菌素混合使用，混剂中所述不动杆菌菌剂的浓度为107-108CFU/mL，所述阿维菌素在不动杆菌菌剂中的含量为2-15μg/mL菌剂，处理量为10-30 μL/g番茄种子。
进一步的，所述不动杆菌菌剂可与杀线虫剂噻唑膦混合使用，混剂中所述不动杆菌菌剂的浓度为107—108CFU/mL，所述噻唑膦3-15μg/mL，处理量为10-30 μL/g番茄种子。
本发明的有益效果：本发明提出的不动杆菌对线虫具有防治作用，利用该菌或该菌株的代谢产物，可诱导番茄在种子萌发和生长期间产生对南方根结线虫的抗性，同时不动杆菌与杀线虫剂混合使用对根结线虫病具有优异的防效，可以降低化学农药的使用量，从而达到保护环境的目的。
具体实施方式
为了更详细地进一步阐明而不是为了限制本发明，给出了下列实施例。
实施例1：不动杆菌（Acinetobacter guillouiae)Sneb1988的培养
本发明的细菌菌株不动杆菌（Acinetobacter guillouiae)Sneb1988是通过培养皿培养后，再经扩大发酵培养来制备，具体方法如下：
首先对不动杆菌（Acinetobacter guillouiae)Sneb1988菌株进行发酵培养，制成不动杆菌菌剂，然后对所述菌剂进行番茄诱导活性试验，确定其对番茄的诱导作用。
将不动杆菌（Acinetobacter guillouiae)Sneb1988的菌株接种到试管培养基上，培养基配方为为酵母甘露醇琼脂（YMA），成分为（g/L）：酵母提取物 1.0；甘露醇 10.0；磷酸氢二钾0.5；硫酸镁 0.2；氯化钠 0.1；碳酸钙 1.0；琼脂15g； pH 6.8。28℃培养3d，获得试管种。
再将试管种接种到250mL三角瓶（每瓶装150mL）液体培养基中，培养基为YMB培养基，成分为（g/L）：酵母提取物 1.0；甘露醇 10.0；磷酸氢二钾0.5；硫酸镁 0.2；氯化钠0.1；碳酸钙 1.0； pH 6.8 -7.0。
发酵温度为25-28℃，摇床转速150r·min-1、发酵时间2-3d。
将上述不动杆菌发酵液调整浓度为107-108CFU/mL，制成不动杆菌菌剂，菌剂处理番茄种子。
实施例2：不动杆菌（Acinetobacter guillouiae)Sneb1988菌剂的制备
不动杆菌（Acinetobacter guillouiae)Sneb1988的发酵基本同实施例1，不同之处是将液体培养的菌种接种到30L的发酵罐进行发酵，在28℃下培养，pH为7.0，发酵3d。
实施例3：不动杆菌（Acinetobacter guillouiae)Sneb1988菌剂防治南方根结线虫田间效果试验
本试验分别在辽宁省铁岭市李千户镇和辽宁省铁岭县蔡牛乡东贝河温室大棚进行田间效果试验。将制备好的发酵原液，采用液种1:40体积比进行种子包衣处理（即药剂的处理量为20 μL/g种子），在无菌条件下干燥，将处理过的番茄种子正常播种，番茄植株在苗期可以产生对南方根结线虫的抗性，并且诱抗效果比较稳定，取得很好的防治效果。
1.制备试验制剂
按前述液体发酵培养方法制备不动杆菌（Acinetobacter guillouiae)Sneb1988的菌剂，不动杆菌浓度为107-108CFU/mL；
不动杆菌菌剂+1.8%阿维菌素乳油混剂，在不动杆菌菌剂中加入阿维菌素；即将1.8%阿维菌素乳油100μL加入到不动杆菌1 mL菌剂中，配成不动杆菌菌剂+1.8%阿维菌素乳油混剂，不动杆菌在混剂中的浓度为107CFU/mL；
不动杆菌菌剂+10%噻唑膦颗粒剂混剂，在不动杆菌菌剂中加入噻唑膦；即将10%噻唑膦颗粒剂100μg加入到1 mL不动杆菌菌剂中，配成不动杆菌菌剂+ 10%噻唑膦颗粒剂混剂，不动杆菌在混剂中的浓度为107CFU/mL。
2.制备试验用种子
番茄品种L-402，辽宁省农业科学院蔬菜研究所提供，也可以在市场上购买获得。
3.种子处理方法
将番茄种子先用5.0%次氯酸钠溶液表面消毒5min，再用无菌水冲洗3-5次。将制备好的不动杆菌菌剂、不动杆菌与阿维菌素混剂、不动杆菌菌剂与噻唑膦混剂分别采用液种进行种子包衣处理， 处理量均为20 μL/g种子，在无菌条件下干燥，备用。
4.试验方法
本试验分别在辽宁省铁岭市李千户镇营盘村和辽宁省铁岭县蔡牛乡东贝河日光温室大棚进行田间效果试验，两处温室大棚根结线虫均很严重，主栽作物番茄、黄瓜及十字花科蔬菜等。番茄育苗在沈阳农业大学温室大棚进行，待番茄植株生长至四叶期时移栽到试验大棚中，完全随机种植。以未经过包衣的番茄种子和YMB液体培养液包衣的番茄种子为对照，在移栽后45d进行调查，将番茄植株连根挖出，保持根系完整，调查番茄根系根结指数。
5.试验结果
使用不动杆菌菌剂处理的番茄，根结指数明显低于对照，在铁岭李千户和蔡牛乡的田间防效分别为37.84%和35.71%，包衣处理后的番茄与未处理的番茄存在明显差异，防效明显。不动杆菌与阿维菌素混剂两地的防效分别为51.38%与51.72，不动杆菌与噻唑膦混剂两地的防效分别为56.76%与57.14%，两种混剂的效果都比单剂的效果要好。
表1 不动杆菌Sneb1988菌剂包衣处理番茄种子田间防效
Figure 610958DEST_PATH_IMAGE002
注：45d后的调查后的结果
实施例4：不动杆菌（Acinetobacter guillouiae)Sneb1988菌剂防治南方根结线虫盆栽效果试验
为了验证其诱抗的稳定性，特此进行了盆栽的防治效果研究。本试验在温室大棚进行盆栽效果试验，以未经过包衣的番茄种子和YMB液体培养液包衣的番茄种子为对照，试验重复两次。
1.制备试验制剂
按前述液体发酵培养方法制备不动杆菌（Acinetobacter guillouiae)Sneb1988的发酵液，待备用。
2.制备试验用种子
L-402，辽宁省农业科学院蔬菜研究所。
3.种子处理方法
将番茄种子先用5.0%次氯酸钠溶液表面消毒5min，再用无菌水冲洗3-5次。将制备好的发酵液采用液种1:40体积比（即每克种子与20μL不动杆菌发酵液一起处理 ）进行种子包衣处理，在无菌条件下干燥，备用。
4.供试线虫
采自辽宁省铁岭市李千户镇营盘村大棚发病严重的番茄根系，经鉴定为南方根结线虫（Meloidogyne incognita），用镊子挑取饱满成熟的卵囊，放入盛有无菌水的灭菌培养皿中，然后用0.5%NaClO消毒3min，并无菌水冲洗3次，从中挑取完整且饱满的卵囊，置入盛有适量无菌水的灭菌培养皿中，将其放入28℃的恒温箱中培养，3d后将孵化出的二龄幼虫J2接种到温室内易感病的番茄根部进行扩繁。将扩繁获得的卵囊采用浅盘法孵化出J2，制备成线虫悬浮液200条/mL。
5.试验方法
将不动杆菌菌剂采用药剂和种子比为1:40体积比（即每克种子与20μL不动杆菌发酵液一起处理 ）进行种子包衣处理，将包衣后晾干的番茄种子播种到育苗钵中，待番茄植株长到四叶期时进行移栽，移栽到12×12cm的钵中，定植1-2天后，每盆接种2000条根结线虫。以未经过包衣的番茄种子和YMB液体培养液包衣的番茄种子为对照，在移栽后45d进行调查，测量番茄株高、根长、根鲜重和根结数。
6.试验结果
使用不动杆菌Sneb1988菌剂处理的番茄，根结数明显低于对照，番茄株高、根长、根鲜重与未处理的番茄存在明显差异，盆栽防效为34.76%。
表2 不动杆菌Sneb1988菌剂包衣处理番茄种子盆栽防效
株高（cm） 株鲜重（g） 根结数（个） 盆栽防效
Sneb1988 35.35±3.91a 7.21±2.05a 53.5±28.46b 34.76%
YMB 30.56±5.17b 5.45±1.46b 72.00±20.88ab ——
CK 28.89±5.36b 4.95±1.96b 82.00±34.06a ——

Claims (4)

1.一种诱导番茄抗南方根结线虫的不动杆菌，其特征是：所述的不动杆菌的保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏日期为2018年8月 24日 ；保藏编号为CGMCC No.16335，分类命名为Acinetobacter guillouiae。
2.根据权利要求1所述的一种诱导番茄抗南方根结线虫的不动杆菌的应用，其特征是：所述的不动杆菌用于制备不动杆菌菌剂，所述不动杆菌菌剂具有诱导番茄抗南方根结线虫的用途，用于诱导番茄在种子萌发和生长期间产生对南方根结线虫的抗性；
所述不动杆菌菌剂的制备方法：所述不动杆菌的液体发酵培养基为YMB培养基，成分为（g/L）：酵母提取物 1.0；甘露醇 10.0；磷酸氢二钾 0.5；硫酸镁 0.2；氯化钠 0.1；碳酸钙1.0；pH 6.8 -7.0；发酵温度为25-28℃，摇床转速150r·min-1、发酵时间2-3d，将不动杆菌的浓度调至浓度为107-108CFU/mL，制得不动杆菌菌剂；
所述不动杆菌菌剂的应用方法：将番茄种子进行表面消毒，无菌水冲洗干净，晾干采用不动杆菌菌剂进行拌种处理，浓度为107-108CFU/mL，处理量为10-30 μL/g种子。
3.根据权利要求2所述的一种诱导番茄抗南方根结线虫的不动杆菌的应用，其特征是：所述不动杆菌菌剂与杀线虫剂阿维菌素混合使用，混剂中所述不动杆菌菌剂的浓度为107-108CFU/mL，所述阿维菌素在不动杆菌菌剂中的含量为2-15μg/mL菌剂，处理量为10-30 μL/g番茄种子。
4.根据权利要求2所述的一种诱导番茄抗南方根结线虫的不动杆菌的应用，其特征是：所述不动杆菌菌剂与杀线虫剂噻唑膦混合使用，混剂中所述不动杆菌菌剂的浓度为107-108CFU/mL，所述噻唑膦3-15μg/mL，处理量为10-30 μL/g番茄种子。
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