CN105112339A - 一种新型细菌菌株及其培养方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型细菌菌株及其培养方法和应用，该菌株为恶臭假单胞菌(Pseudomonas？putida)，保藏号为CGMCC？No.10729。上述新型细菌菌株的培养基由以下质量百分比的原料制备而成：酵母浸膏0.1％-0.2％、蛋白胨0.5％-0.6％、牛肉浸膏0.3％-0.4％、蔗糖1％-2％，本发明的恶臭假单胞菌(Pseudomonas？putida)Sneb821或其代谢物具有对番茄的诱导活性，可用于番茄的种子处理，不仅可促进番茄植株和根部的生长，同时对南方根结线虫根结的形成具有很大的抑制作用，解决了根结线虫防治的难题。

Description

一种新型细菌菌株及其培养方法和应用

技术领域

本发明涉及菌株领域，具体涉及一种新型细菌菌株及其培养方法和应用。

背景技术

根结线虫(Meloidogynespp.)是一种高度专化型的杂食性植物病原线虫，其寄主十分广泛，常为害瓜类、茄果类、豆类及萝卜、莴苣、白菜等30多种蔬菜，同时又加重了土传真菌性病害和部分细菌性病害。在我国南方根结线虫分布最广，危害最大。近年来，随着农业种植结构的调整和全球性气候变暖，保护地作物栽培面积迅速发展，同时也为南方根结线虫的发生、发展提供了适宜的环境，使得土壤中的根结线虫得以积聚增殖，发病田的寄主常年减产15％-20％，严重时达到70％以上。从世界范围来看，根结线虫病的危害和蔓延有日趋加重的趋势，因此有关根结线虫病的研究越来越受到各国的重视。目前，在线虫的防治中化学防治仍占主导地位，但化学杀线剂对线虫的非特异性、对非靶标生物的高毒性以及污染环境等问题，是很多杀线剂被禁用。同时抗性品种的应用目前还不广泛。因此人们除急需探索一些高效、低毒、低残留、高选择性的杀线剂外，重点移向从生态角度寻求新方法，生物防治就是其中之一。

在根结线虫的生防上可供利用的微生物种类和其他生物因素很多，包括真菌、细菌、放线菌、病毒甚至高等植物等等。其中生防细菌资源极为丰富，因其具有对环境友好的优点使之成为根结线虫病害防控技术研究的热点。目前对南方根结线虫具有防效的根际细菌主要有：荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、球形芽孢杆菌(Bacillussphaericus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、放射性土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter)以及致金色假单胞菌(Pseudomonasaureofaciens)等，防治效果大部分超过40％。其中，假单胞菌属(Pseudomonasspp.)是微生物的重要类群，也是分布最广的微生物之一。一些假单胞菌属细菌在对植物寄生线虫防治方面表现出很大的潜力。对线虫有抑制或毒杀作用的假单胞菌还有：P.aeruginosa，P.chlororaphis，P.cepacia，P.gladioli，P.picketti，P.mendocina。通常一些植物寄生线虫需要寄主植物产生的某种促进卵孵化的因子，而特定根围的根际细菌，可消耗根分泌物或改变分泌形式，从而影响这类线虫的发育。Westcotiii等认为，施入铜绿假单胞菌P.aeruginosa后，小环线虫的卵很快就会停止发育，推测是细菌影响植物根系的分泌物导致的。而利用恶臭假单胞菌或恶臭假单胞菌的代谢产物对番茄种子进行处理，来防治南方根结线虫的方法尚未有报道。

发明内容

针对上述问题，本发明通过系统筛选获得通过系统筛选获得一株细菌，利用该菌或该菌的代谢产物处理番茄种子，可诱导番茄在种子萌发和生长期间产生对南方根结线虫的抗性，从而解决了根结线虫病的问题。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种新型细菌菌株，所述菌株为恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)Sneb821，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2015年4月21日；保藏登记入册编号：CGMCCNo.10729。恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)Sneb821是从中国辽宁省沈阳市康平县试验田中筛选出的一株对番茄具有强诱导活性的细菌菌株。

上述新型细菌菌株的培养方法，包括如下步骤：

S1、按质量百分比称取：酵母浸膏0.1％-0.2％、蛋白胨0.5％-0.6％、牛肉浸膏0.3％-0.4％、蔗糖1％-2％，余下为蒸馏水混合后，得液体培养基；

S2、将步骤S1所得的液体培养基按每瓶150mL的比例分装于250mL的三角瓶内，分装完成后将上述菌株接种于液体培养基上pH6.8-7.0，温度25-28℃，摇床转速150r·min^-1，发酵2-3d，得发酵原液。

优选的，发酵时间为3d。

上述的一种新型细菌菌株可用于诱导番茄产生对南方根结线虫的抗性。

上述的一种新型细菌菌株可用于制作番茄种子处理剂，所述番茄种子处理剂包含有效量的步骤S2所得的发酵液原液。

其中，本发明通过研究发现，从土壤中筛选出多株具有诱导番茄抗南方根结线虫的细菌菌株，其中恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)Sneb821效果较好，且相对稳定。

本发明具有以下有益效果：

本发明的恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)Sneb821或其代谢物具有对番茄的诱导活性，可用于番茄的种子处理，不仅可促进番茄植株和根部的生长，同时对南方根结线虫根结的形成具有很大的抑制作用，解决了根结线虫防治的难题。

具体实施方式

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)Sneb821的培养

将恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)Sneb821的菌株接种到试管培养基上，培养基配方为牛肉膏蛋白胨培养基，即成分：牛肉浸膏3g，酵母浸膏1g，蛋白胨10g，蔗糖10g，琼脂17-20g，加蒸馏水至1000mL。28℃培养3d，获得试管种。

再将试管种接种到250mL三角瓶(每瓶装150mL)液体培养基中，培养基配方为：以重量百分比计，酵母浸膏0.1％-0.2％、蛋白胨0.5％-0.6％、牛肉浸膏0.3％-0.4％、蔗糖1％-2％，余下为蒸馏水，pH为6.8-7.0，发酵温度为25-28℃，摇床转速150r·min^-1、发酵时间2-3d。形成的发酵液或发酵液的制成品可以直接或间接处理番茄种子。被处理的番茄种子可以减轻由根结线虫病害所造成的危害。

实施例2

恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)Sneb821的发酵基本同实施例1，不同之处是将液体培养的菌种接种到1000L的发酵罐进行发酵，在28℃下培养，pH为7.0，发酵3d。

实施例3

恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)Sneb821发酵产品防治南方根结线虫田间效果试验

本试验分别在辽宁省铁岭市李千户镇和辽宁省盘锦市高升镇温室大棚进行田间效果试验。将制备好的发酵原液，采用液种1∶40体积比进行种子包衣处理，在无菌条件下干燥，将处理过的番茄种子正常播种，番茄植株在苗期可以产生对南方根结线虫的抗性，并且诱抗效果比较稳定，取得很好的防治效果。

步骤一、制备试验制剂

按前述液体发酵培养方法制备恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)Sneb821的发酵液，待备用。

步骤二、制备试验用种子

番茄品种L-402，辽宁省农业科学院蔬菜研究所提供。

步骤三、种子处理方法

将番茄种子先用5.25％次氯酸钠溶液表面消毒5min，再用无菌水冲洗3-5次。将制备好的发酵液采用液种1∶40体积比进行种子包衣处理，在无菌条件下干燥，备用。

步骤四、试验方法

本试验分别在辽宁省铁岭市李千户镇营盘村和辽宁省盘锦市高升镇日光温室大棚进行田间效果试验，两处温室大棚根结线虫均很严重，主栽作物番茄、黄瓜及十字花科蔬菜等。番茄育苗在沈阳农业大学温室大棚进行，待番茄植株生长至四叶期时移栽到试验大棚中，完全随机种植。以未经过包衣的番茄种子和NA液体培养液包衣的番茄种子为对照，在移栽后45d进行调查，将番茄植株连根挖出，保持根系完整，调查番茄根系根结指数。

试验结果

使用Sneb821发酵产品处理的番茄，根结指数明显低于对照，在铁岭和盘锦的田间防效分别为51.51％和61.54％，包衣处理后的番茄与未处理的番茄存在明显差异。

表1Sneb821发酵产品包衣处理番茄种子在辽宁铁岭的田间防效

其中，表1为45d后的调查后的结果

实施例4

恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)Sneb821发酵产品防治南方根结线虫盆栽效果试验

为了验证其诱抗的稳定性，特此进行了盆栽的防治效果研究。本试验在沈阳农业大学温室大棚进行盆栽效果试验，以未经过包衣的番茄种子和NA液体培养液包衣的番茄种子为对照，试验重复两次。

步骤一、制备试验制剂

按前述液体发酵培养方法制备恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)Sneb821的发酵液，待备用。

步骤二、制备试验用种子

L-402，辽宁省农业科学院蔬菜研究所提供。

步骤三、种子处理方法

将番茄种子先用5.25％次氯酸钠溶液表面消毒5min，再用无菌水冲洗3-5次。将制备好的发酵液采用液种1∶40体积比进行种子包衣处理，在无菌条件下干燥，备用。

步骤四、供试线虫

采自辽宁省铁岭市李千户镇营盘村大棚发病严重的番茄根系，经鉴定为南方根结线虫(Meloidogyneincognita)，用镊子挑取饱满成熟的卵囊，放入盛有无菌水的灭菌培养皿中，然后用0.5％NaClO消毒3min，并无菌水冲洗3次，从中挑取完整且饱满的卵囊，置入盛有适量无菌水的灭菌培养皿中，将其放入28℃的恒温箱中培养，3d后将孵化出的二龄幼虫J2接种到温室内易感病的番茄根部进行扩繁。将扩繁获得的卵囊采用浅盘法孵化出J2，制备成线虫悬浮液200条/mL。

步骤五、试验方法

将Sneb821的发酵液原液采用液种1∶40体积比进行种子包衣处理，将包衣后晾干的番茄种子播种到育苗钵中，待番茄植株长到四叶期时进行移栽，移栽到12×12cm的钵中，定植1-2天后，每盆接种2000条二龄幼虫。以未经过包衣的番茄种子和NA液体培养液包衣的番茄种子为对照，在移栽后45d进行调查，测量番茄株高、根长、根鲜重和根结数。

试验结果

使用Sneb821发酵产品处理的番茄，根结数明显低于对照，番茄株高、根长、根鲜重与未处理的番茄存在明显差异，盆栽防效为85.28％。

表2Sneb821发酵产品包衣处理番茄种子的温室防效

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种新型细菌菌株，其特征在于，所述菌株为恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)，保藏号为CGMCCNo.10729。

2.如权利要求1所述的一种新型细菌菌株的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、按质量百分比称取：酵母浸膏0.1％-0.2％、蛋白胨0.5％-0.6％、牛肉浸膏0.3％-0.4％、蔗糖1％-2％，余下为蒸馏水混合后，得液体培养基；

S2、将步骤S1所得的液体培养基按每瓶150mL的比例分装于250mL的三角瓶内，分装完成后将上述菌株接种于液体培养基上pH6.8-7.0，温度25-28℃，摇床转速150r·min^-1，发酵2-3d，得发酵原液。

3.如权利要求2所述的一种新型细菌菌株的培养方法，其特征在于，发酵时间为3d。

4.如权利要求1所述的一种新型细菌菌株的应用，其特征在于，用于诱导番茄产生对南方根结线虫的抗性。

5.如权利要求1所述的一种新型细菌菌株的应用，其特征在于，用于制作番茄种子处理剂。

6.如权利要求5所述的一种新型细菌菌株的应用，其特征在于，所述番茄种子处理剂包含有效量的步骤S2所得的发酵液原液。