CN114599227A - 吸引线虫的细菌及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及属于假单胞菌属的具有线虫趋化性诱导活性的分离的细菌菌株，包含其的组合物以及使用其的方法，例如用于将线虫吸引到表面，或用于保护植物免受线虫诱导的损害。

Description

吸引线虫的细菌及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年9月6日提交的题目为“吸引线虫的细菌及其使用方法(NEMATODE-ATTRACTING BACTERIA AND METHODS OF USE THEREOF)”的美国临时申请号62/896,640的优先权，其内容通过引用以其整体并入本文。
技术领域
本发明属于生物防治领域，并且在一些实施方式中，涉及防止和/或治疗线虫诱导的植物疾病。
技术背景
根结线虫(RKN)是世界上最具破坏性的植物病原体之一，其导致几乎所有主要农作物的大量产量损失。它们见于所有冬季气温温和的地区，并且随着气候变化的发展，它们被认为是对农业的最严重威胁之一。在它们的生命周期中，南方根结线虫群(MIG)的种类在土壤中孵化并侵入根部。一旦进入根部，蠕虫就会形成特征性的结，它们的名字由此而来。每个结含有至少一个线虫，它们来自(feeding from)一种独特的细胞类型(巨细胞)，周围环绕着一瘿分裂的皮层细胞。RKN在其整个生命周期与微生物相互作用，因此为生物防治提供了机会。
线虫造成全球所有植物损失的估计14％，转化为每年大约900亿美元。由于杀线虫剂的争议性作用以及近年来几种主要化学杀线虫剂的逐步淘汰(包括禁用溴甲烷)，仍然非常需要更好的通用、有效和无害的杀线虫剂。
发明内容
结合旨在示例性和说明性而非限制范围的系统、工具和方法来描述和说明以下实施方式及其方面。
在其一些实施方式中，本发明涉及包含具有线虫趋化性诱导活性的细菌的组合物及其使用方法，例如用于吸引线虫和/或用于防止线虫诱导的对植物的损害。
根据第一方面，提供了假单胞菌属的分离的细菌菌株，其包含与以BioSample登录号SAMN15770455保藏在NCBI的基因组具有至少94％同源性或同一性的基因组。
根据另一方面，提供了组合物，其包含本发明的分离的细菌菌株和农业或环境可接受的载体。
根据另一方面，提供用于将线虫吸引到表面的方法，其包括使表面与具有线虫趋化性诱导活性的细菌接触，从而将线虫吸引到表面。
根据另一方面，提供用于保护植物免受线虫诱导的损害的方法，其包括：使包含线虫的生长培养基与包含具有线虫趋化性诱导活性的细菌和人工支持物的组合物接触，其中细菌与人工支持物结合或在人工支持物内，从而保护植物免受线虫诱导的损害。
在一些实施方式中，分离的细菌菌株包含与以BioSample登录号SAMN15770455保藏在NCBI的基因组具有100％同源性或同一性的基因组。
在一些实施方式中，分离的细菌菌株包含与SEQ ID NO:1具有至少90％同源性或同一性的多核苷酸序列。
在一些实施方式中，分离的细菌菌株包含与SEQ ID NO:1具有100％同源性或同一性的多核苷酸序列。
在一些实施方式中，与SEQ ID NO:1具有至少90％同源性或同一性的多核苷酸序列是16S-rRNA序列。
在一些实施方式中，分离的细菌菌株的特征在于具有线虫趋化性诱导活性、线虫卵孵化抑制活性、杀线虫活性或其任何组合。
在一些实施方式中，组合物进一步包含人工支持物。
在一些实施方式中，分离的细菌菌株与人工支持物结合或在人工支持物内。
在一些实施方式中，人工支持物被配置为诱捕被分离的细菌菌株吸引的线虫。
在一些实施方式中，线虫属于根结线虫属。
在一些实施方式中，线虫是南方根结线虫。
在一些实施方式中，细菌属于假单胞菌属。
在一些实施方式中，细菌是本发明的分离的细菌菌株。
在一些实施方式中，线虫是植物寄生线虫(PPN)。
在一些实施方式中，线虫属于根结线虫属。
在一些实施方式中，组合物是本发明的组合物。
在一些实施方式中，组合物是比根部是线虫的引诱剂更强的线虫的引诱剂。
在一些实施方式中，所述组合物是根部的至少两倍的引诱剂。
在一些实施方式中，保护植物包括降低线虫对根部的穿透率、降低穿透根部的线虫的数量、降低线虫的孵化卵的数量、降低线虫的卵孵化率、或其任何组合。
在一些实施方式中，具有线虫趋化性诱导活性的细菌将线虫诱捕在组合物中。
在一些实施方式中，组合物降低线虫的存活率。
在一些实施方式中，组合物杀死线虫。
在一些实施方式中，组合物具有杀线虫活性。
在一些实施方式中，保护包括将线虫吸引至组合物。
在一些实施方式中，接触生长培养基不包括接触植物的根部。
在一些实施方式中，接触生长培养基是在距植物的根部至少0.1cm的距离处。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文所述的方法和材料相似或等效的方法和材料可以用于本发明的实施方式的实践或测试，但在下文描述了示例性方法和/或材料。如有冲突，以专利说明书(包括定义)为准。此外，这些材料、方法和实例仅是说明性的，并不意味着必然是限制性的。
从下文给出的详细描述中，本发明的其他实施方式和全部适用范围将变得显而易见。然而，应该理解的是，详细描述和具体实例虽然指示了本发明的优选实施例，但仅以说明性的方式给出，因为在本发明的精神和范围内的多种变化和修改根据详细描述对于本领域技术人员来说是显而易见的。
附图说明
图1A-1C包括证明吸引测定的图示和显微照片。(1A)是描绘12孔板的孔的吸引测定装置的非限制性说明，该孔包含在1ml Pluronic-P127-Tris-MES凝胶中温育的根部片段、第二阶段幼虫(J2)和移液管吸头(含有细菌分离菌/对照中为无菌培养基)。(1B)是显示根部(箭头)和J2幼虫的图像。(1C)是显示J2幼虫和含有细菌分离菌的移液管吸头(箭头)的图像。
图2A-2B包括显示基于(2A)P距离和(2B)树分支距离的种内遗传距离分布的图表。(2A-2B)来自220个种类的318个序列(产生213个种内距离)包括在无效分布中。本文公开的分离菌的序列与其最接近的测序亲属(●)之间的距离显著大于种内距离。(2A)P现有种类＝0.0227；(2B)P现有种类＝0.0045。
图3包括显示根据以下四种不同的处理24和48小时后，孵化计数分布的图表：(1)含有双蒸馏水(DDH)的Biocasle胶囊(Menashe和Kurzbaum，2014)；(2)含有无菌培养基的Biocasle胶囊；(3)含有过滤细菌的培养基的Biocasle胶囊(“滤液”)；和(4)其培养基中含有活细菌的Biocasle胶囊。
具体实施方式
在一些实施方式中，本发明涉及包含分离的细菌的组合物，其中所述细菌具有线虫趋化性诱导活性，即线虫吸引活性。
还提供了使用组合物吸引线虫并保护植物免受线虫诱导的损害的方法。
根据一些实施方式，提供了假单胞菌属的分离的细菌菌株。
在一些实施方式中，提供了包含分离的细菌的组合物，其中至少80％的分离的细菌是本发明的分离的细菌。
在一些实施方式中，提供了将线虫吸引到表面的方法，其包括使表面与本发明的组合物接触。
在一些实施方式中，提供了在包含线虫的生长培养基中保护包含根部的植物免受线虫诱导的损害的方法，其包括使包含线虫的生长培养基与本发明的组合物接触。本发明部分基于令人惊讶的发现：即从茄子根部中分离出的细菌被鉴定为假单胞菌的新型种类，其吸引根结线虫幼年阶段2的幼虫。这种迄今为止未知的细菌种类是比茄子根部高出一个数量级以上的更强的线虫引诱剂。放在具有根部和新细菌的盘子里的线虫幼虫被细菌强烈吸引，以至于没有蠕虫迁移到根部。因此，这种新型细菌可以用作线虫诱捕物，以使它们远离植物根部，否则这些植物根部可能会受到入侵线虫的伤害。
细菌分离菌
根据一些实施方式，提供了假单胞菌属的分离的细菌菌株，其包含或特征在于具有与以BioSample登录号SAMN15770455保藏在NCBI的基因组具有至少94％同源性或同一性、95％同源性或同一性、96％同源性或同一性、97％同源性或同一性、98％同源性或同一性、至少99％同源性或同一性、或100％同源性或同一性、或它们之间的任何值和范围的基因组。每种可能性代表本发明的单独实施方式。
根据一些实施方式，假单胞菌属的分离的细菌菌株(例如，本发明的细菌)包含或特征在于具有与以BioSample登录号SAMN15770455保藏在NCBI的基因组具有94-100％同源性或同一性、95-99％同源性或同一性、96-98％的同源性或同一性、或97-100％的同源性或同一性的基因组。每种可能性代表本发明的单独实施方式。
在一些实施方式中，提供了假单胞菌属的分离的细菌菌株，其包含基因组，该基因组包含以BioSample登录号SAMN15770455保藏在NCBI的基因组或由其组成。
在一些实施方式中，本发明的细菌从植物中分离。在一些实施方式中，细菌从植物根部中分离。在一些实施方式中，细菌从包含植物根部的样品中分离。在一些实施方式中，细菌从包含被线虫侵染的植物根部的样品中分离。在一些实施方式中，细菌从包含土壤的样品中分离，在该土壤中培养过植物或培养植物。在一个实施方式中，如本文上文所用的植物是茄子。
用于分离细菌的方法是常见的，例如在下文中举例说明的，并且对于本领域普通技术人员来说是显而易见的。
根据一些实施方式中，分离的细菌包括与以下具有至少80％同源性或同一性的序列：GATAGAGAGGCTGCTGTAGAATGCGCGCCTCGGTTGAGACGAAAGGCTTAACCAACTGTTCTTTAACAACTGAATCAAGCAATTCGTGTGGGTGCTTGTGAGGTAAGACTGATAGTCAACTGATTATCAGCATCACAAAGCAACACTCGTTAATTCGAGAGTTACCTTTCATTAATTTGAAAGTTTTGCGATTGCTGAGCCAAGTTTAGGGTTTTCTCAAAACCCAAGCAGTATTGAACTGAAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGATGAGAGGAGCTTGCTCCTTGATTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGTCCGGAAACGGGCGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCATTAACCTAATACGTTAGTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCGAGCTAGAGTACGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGGTTCCTTGAGAACTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATGCTGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCAGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCC(SEQ ID NO:1)。
在一些实施方式中，与SEQ ID NO:1具有至少80％同源性或同一性的多核苷酸序列是16S-核糖体RNA(16S-rRNA)序列。在一些实施方式中，SEQ ID NO:1是16S-rRNA的片段。在一些实施方式中，SEQ ID NO:1对应于本发明的分离细菌中的16S-rRNA的碱基46-395。在一些实施方式中，本发明的至少70％的分离的细菌包含与SEQ ID NO:1具有至少80％同源性或同一性的多核苷酸序列。在一些实施方式中，本发明的至少80％的分离的细菌包含与SEQ ID NO:1具有至少80％同源性或同一性的多核苷酸序列。在一些实施方式中，本发明的至少90％的分离的细菌包含与SEQ ID NO:1具有至少80％同源性或同一性的多核苷酸序列。在一些实施方式中，本发明的至少95％的分离的细菌包含与SEQ ID NO:1具有至少80％同源性或同一性的多核苷酸序列。在一些实施方式中，本发明的至少99％的分离的细菌包含与SEQ ID NO:1具有至少80％的同源性或同一性的多核苷酸序列。在一些实施方式中，本发明的100％的分离的细菌包含与SEQ ID NO:1具有至少80％的同源性或同一性的多核苷酸序列。
在一些实施方式中，至少80％同源性或同一性包括：至少85％同源性或同一性、至少90％同源性或同一性、至少95％同源性或同一性、至少99％同源性或同一性、或100％同源性或同一性。每种可能性代表本发明的单独实施方式。此外，与SEQ ID NO:1的同源性或同一性之间的任何值或范围也是可能的。
在一些实施方式中，本发明的分离的细菌是属于假单胞菌属的种类。在一些实施方式中，本发明的分离的细菌是属于固氮菌属的种类。在一些实施方式中，本发明的分离的细菌是属于疏螺旋体属(genus Borreliella)的种类。
在一些实施方式中，本发明的分离的细菌具有线虫趋化性诱导活性。如本文所用，术语“趋化性”是指生物体(例如，线虫)响应刺激的运动。在一些实施方式中，本发明的分离的细菌是线虫引诱剂。在一些实施方式中，与SEQ ID NO:1具有至少80％同源性或同一性的分离的细菌具有线虫趋化性诱导活性。在一些实施方式中，可以将突变或改变引入本发明的分离的细菌的基因组，只要它们不会负面地影响线虫趋化性诱导活性。在一些实施方式中，线虫趋化性诱导活性可能受到负面地影响，只要分离的细菌保持比植物根部更强的引诱剂。
在一些实施方式中，线虫趋化性诱导活性包括选自以下的一种或多种活性：诱导线虫运动、增加线虫运动速率、增加线虫运动频率、增加运动线虫的数量、增加线虫运动的持续时间、确定线虫运动的方向、和吸引或引诱线虫。
在一些实施方式中，本发明的分离的细菌具有比植物部分更大的线虫趋化性诱导活性。在一些实施方式中，本发明的分离的细菌比植物根部具有更大的线虫趋化性诱导活性。植物部分的非限制性实例包括但不限于叶、茎、果实、根部、枝条和汁液。在一些实施方式中，本发明的分离的细菌具有比本发明方法保护的植物或其部分更大的线虫趋化性诱导活性。
在一些实施方式中，更大的活性是多至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、550％、600％、650％、700％、750％、800％、850％、900％、950％或1,000％的活性。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，更大的活性是多至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、550％、600％、650％、700％、750％、800％、850％、900％、950％或1,000被吸引的线虫。每种可能性代表本发明的单独实施方式。
在一些实施方式中，植物是茄子。在一些实施方式中，植物是烟草植物。在一些实施方式中，植物是可以被线虫感染的植物。在一些实施方式中，植物是可以被线虫攻击的植物。在一些实施方式中，植物是吸引线虫的植物。可以受线虫影响并吸引线虫的植物的实例包括但不限于玉米、黄豆、大豆、大麦、啤酒花、小麦、beats、茄子、番茄、稻米和烟草。在一些实施方式中，植物部分没有本发明的细菌。在一些实施方式中，植物部分是没有本发明细菌的表面。在一些实施方式中，植物部分包含处于灭活状态的本发明的细菌。灭活细菌的方法是常见的并且对于普通技术人员来说是显而易见的。细菌灭活方法的非限制性实例包括但不限于加热、冷冻和解冻、裂解、破碎、中和、溶解等。
如本文所用，术语“线虫”是指属于线虫门的线虫(roundworm)。在一些实施方式中，线虫是根结线虫。在一些实施方式中，线虫属于根结线虫属。在一些实施方式中，属于根结线虫属的线虫选自：高粱根结线虫(M.acronea)、阿登根结线虫(M.ardenensis)Santos、花生根结线虫(M.arenaria)、甘蓝根结线虫(M.artiellia)、短尾根结线虫(M.brevicauda)、奇氏根结线虫(M.chitwoodi)、咖啡根结线虫(M.coffeicola)、短小根结线虫(M.exigua)、M.fruglia、M.gajuscus、北方根结线虫(M.hapla)、南方根结线虫(M.incognita)、爪哇根结线虫(M.javanica)、象耳豆根结线虫(M.enterolobii)(即玛雅根结线虫(mayaguensis))、抗禾谷类根结线虫(M.naasi)、美洲山核桃根结线虫(M.partityla)和泰晤士根结线虫(M.thamesi)。在一个实施方式中，线虫是南方根结线虫。
组合物
根据一些实施方式，提供了包含假单胞菌属的分离的细菌菌株的组合物，其中至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％的分离的细菌包含与以BioSample登录号SAMN15770455保藏在NCBI的基因组的具有至少95％同源性或同一性、至少96％同源性或同一性、至少97％同源性或同一性、至少98％同源性或同一性、至少99％同源性或同一性，或100％同源性或同一性，或它们之间的任何值和范围的基因组。每种可能性代表本发明的单独实施方式。
根据一些实施方式，提供了包含假单胞菌属的分离的细菌菌株的组合物，其中80-90％、85-95％、95-97％、90-98％、90-99％或92-100％的分离的细菌包含与以BioSample登录号SAMN15770455保藏在NCBI的基因组具有90-99％同源性或同一性、91-98％同源性或同一性、92-100％同源性或同一性、94-98％同源性或同一性、91-97％同源性或同一性、或95-100％的同源性或同一性的基因组。每种可能性代表本发明的单独实施方式。
在一些实施方式中，本发明涉及包含本发明细菌的组合物。在一些实施方式中，组合物中至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的分离的细菌是本发明的分离的细菌。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，组合物中至少90％的分离的细菌是本发明的分离的细菌。在一些实施方式中，组合物包含本发明的细菌和可接受的载体。在一些实施方式中，可接受的载体是农业可接受的载体。如本文所用，“农业相容性载体”或“农业可接受的载体”是指除水之外的任何材料，其可以添加到植物、植物部分(如本文上文所公开)或其种子中而不会引起或具有对种子或从种子长出的植物等的不利影响。
在一些实施方式中，组合物进一步包含农业或环境可接受的载体。
农业载体可以是土壤或植物生长培养基。可以使用的其他农业载体包括水、肥料、植物油、湿润剂或其组合。可选地，农业载体可以是固体，例如硅藻土、壤土、二氧化硅、藻酸盐、粘土、膨润土、蛭石、种壳、其他植物和动物产品，或组合，包括颗粒、团粒或悬浮液。任何上述成分的混合物也被考虑作为载体，例如但不限于pesta(面粉和高岭土)、琼脂或在壤土、沙子或粘土中的面粉基团粒。
在一些实施方式中，可接受的载体是农业合适的和/或环境可接受的载体。这样的载体可以是动物、植物或待处理的环境可以耐受的任何材料。在一些实施方式中，“环境相容性载体”或“环境可接受的载体”是指任何材料，其可以添加到本发明的分离的细菌菌株或包含它们的组合物(例如，本发明的组合物)中而不引起或具有如本文所述的对环境或除诱导植物损害的线虫或植物寄生线虫(PPN)之外的任何种类或生物体的不利影响。此外，载体必须使得组合物在保护植物免受线虫(例如PPN)、吸引线虫(例如PPN)或两者时保持有效。
在一些实施方式中，所述组合物进一步包含支持物。在一些实施方式中，支持物是人工支持物。如本文所用，术语“人工支持物”是指被配置为保持或粘附于本发明的细菌的任何人造材料。在一些实施方式中，细菌在粘附到支持物上或在支持物内时维持线虫趋化性诱导活性。支持物可以配置为具有大的入口孔和较小的出口孔。支持物可以被配置为允许线虫进入其中并防止线虫离开。在一些实施方式中，支持物被配置为诱捕被本发明的细菌吸引的线虫。支持物可以被配置为具有迷宫结构或组织。在一些实施方式中，支持物外侧的入口开口较大，而靠近分离的细菌的支持物内侧较小。在一些实施方式中，支持物外侧的入口开口较小，而靠近分离的细菌的支持物内侧较大。这种结构允许线虫由于它们对细菌的吸引力而进入，然后难以从诱捕中离开。昆虫或蠕虫诱捕物的形状和结构，包括其制备方法，在本领域中是众所周知的。
在一些实施方式中，支持物是固体支持物。在一些实施方式中，支持物是凝胶。在一些实施方式中，凝胶是生物凝胶。在一些实施方式中，支持物包括多于一个隔室。在一些实施方式中，支持物是已经修饰的天然存在的物质。在一些实施方式中，修饰是为了粘附或含有分离的细菌。在一些实施方式中，支持物是天然存在的，但已经人工装载了分离的细菌。在一些实施方式中，支持物是已经分离的天然存在的物质。在一些实施方式中，本发明的支持物和分离的细菌在自然界中不一起存在。
支持物可以由多种材料制成，例如适合于容纳或粘附细菌的材料。这些的实例包括但不限于塑料、金属、木材、玻璃、橡胶、木炭、生物炭、切碎的植物材料、珍珠岩、蛭石和煤灰。
在一些实施方式中，组合物包含本发明的分离的细菌和支持物，其中分离的细菌与支持物结合。在一些实施方式中，分离的细菌在支持物内。在一些实施方式中，分离的细菌可逆地与支持物结合。在一些实施方式中，分离的细菌不可逆地与支持物结合。在一些实施方式中，分离的细菌不能从支持物扩散或脱离。
如本文所用，术语“结合”包括附接、粘附或两者。
在一些实施方式中，组合物具有杀线虫活性。如本文所用，术语“杀线虫活性”是指杀死线虫的能力。在一些实施方式中，组合物用作杀线虫剂。在一些实施方式中，线虫在细菌处饿死。在一些实施方式中，线虫在组合物中饿死。在一些实施方式中，线虫在诱捕物中饿死。在一些实施方式中，杀线虫活性来自于到达组合物后饿死的线虫。在一些实施方式中，组合物对寄生线虫具有活性。在一些实施方式中，组合物对植物寄生线虫具有活性。在一些实施方式中，组合物对根结线虫具有活性。
在一些实施方式中，包含本发明细菌的组合物诱捕线虫。在一些实施方式中，组合物固定线虫。在一些实施方式中，组合物防止或抑制线虫接触植物部分。在一些实施方式中，组合物防止或抑制线虫穿透到植物部分。在一些实施方式中，组合物降低到达植物部分的线虫的数量。在一些实施方式中，组合物使被其吸引的线虫饿死。在一些实施方式中，包含本发明细菌的组合物杀死被吸引到其上的线虫。
在一些实施方式中，抑制是与对照相比，降低至少5％、至少15％、至少25％、至少35％、至少50％、至少75％、至少85％、至少90％％、至少95％、至少100％或它们之间的任何范围或值。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，与对照相比，抑制5-10％、7-15％、15-25％、20-35％、30-50％、45-75％、60-85％、70-90％、80-95％或90-100％。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，降低线虫的数量是在到达植物部分的线虫数量中降低至少5％、10％、15％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％，或它们之间的任何范围或值。每种可能性代表本发明的单独实施方式。
在一个实施方式中，对照包含组合物，该组合物包含灭活形式的如上文公开的本发明细菌。
在一些实施方式中，包含本发明的分离的细菌的组合物或其使用方法降低了线虫的存活率。在一些实施方式中，组合物或其使用方法使线虫存活率与对照相比，降低至少5％、至少15％、至少25％、至少35％、至少50％、至少75％，至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、至少100％，或它们之间的任何范围或值。在一些实施方式中，组合物或其使用方法使线虫存活率与对照相比，降低5-10％、7-15％、15-25％、20-35％、30-50％、45-75％、60-85％、70-90％、80-95％或90-100％。每种可能性代表本发明的单独实施方式。
在一些实施方式中，组合物进一步包含一种或多种线虫引诱剂。线虫引诱剂的非限制性实例包括但不限于环状核苷酸(例如cAMP和cGMP)、阴离子(例如Cl-、Br-和I-)、阳离子(例如Na+、Li+、K+、Mg2+)和碱性pH值。在一些实施方式中，线虫引诱剂不是生物的。在一些实施方式中，线虫引诱剂不是生物体。
在一些实施方式中，组合物进一步包含杀线虫分子。在一些实施方式中，杀线虫分子选自：多肽、多核苷酸(例如RNA多核苷酸)、化学品和小分子。线虫毒剂在本领域中是众所周知的并且可以并入本发明的组合物中以增强它们在保护植物方面的功效。可选地，由于此类毒物通常对包括人类在内的其他生物体有毒，因此本发明的组合物非常有益，因为它们在没有此类另外毒素的情况下发挥作用。
使用方法
根据一些实施方式，提供了用于将线虫吸引到表面的方法，其包括使表面与具有线虫趋化性诱导活性的细菌接触，从而将线虫吸引到表面。
如本文所用，术语“表面”包括细菌可以沉积在其上的任何区域或材料。在一些实施方式中，表面是天然表面。在一些实施方式中，表面是人造或人工表面。
根据一些实施方式，提供了用于保护植物免受线虫诱导的损害的方法，方法包括：使包含线虫的生长培养基与包含具有线虫趋化性诱导活性的细菌和支持物的组合物接触，其中细菌与支持物结合或在支持物内，从而保护植物免受线虫诱导的损害。
根据一些实施方式，提供了用于降低植物寄生线虫(PPN)的致病性的方法，其包括使包含PPN的生长培养基与有效量的本发明的分离的细菌菌株或包含其的组合物接触。
在一些实施方式中，降低PPN的致病性包括降低PPN的存活率。
在一些实施方式中，降低存活率包括直接或间接降低存活率。在一些实施方式中，直接降低存活率包括杀死或破坏PPN。在一些实施方式中，间接降低存活率包括不直接捕食、杀死或破坏PPN，而是间接降低它们的存活率或生存力，例如，如本文所公开的，由于陷在人工固体支持物中而饿死。
在一些实施方式中，降低PPN的致病性包括：降低每单位重量的植物或其部分的PPN的卵、囊或两者的平均数量，降低植物根部的根瘤指数(root galling index)，降低PPN对植物或其部分的穿透率，减少穿透植物或其部分的PPN的数量，或其任何组合。
如本文所用，保护植物免受线虫诱导的损害包括治疗遭受线虫诱导的损害的植物、防止植物中的线虫诱导的损害、或两者。
如本文所用，术语“治疗”线虫诱导的损害或疾病包括减轻其至少一种症状、降低其严重性或抑制其进展。治疗不一定意味着疾病或损害完全治愈。为了有效治疗，有用的本文组合物仅需要降低疾病或损害的严重性、降低与之相关的症状的严重性、或提供对植物健康的改善。在一些实施方式中，治疗线虫诱导的损害包括将植物中的线虫吸引远离植物。
如本文所用，线虫诱导的损害或疾病的术语“防止”包括延迟、防止、抑制或阻止疾病或损害的发作。如根据当前描述的主题所使用的，术语“防止”涉及预防过程，其中植物或其部分在生长培养基中生长，该生长培养基在疾病/损害诱导或发作之前暴露于当前描述的组合物。术语“抑制”用于描述如此病症，其中疾病/损害已经开始但尚未意识到该病症的明显症状。在任何一种情况下，术语预防可应用于包括防止和抑制。在一些实施方式中，防止线虫诱导的损害包括将生长培养基中的线虫吸引远离植物。
在一些实施方式中，根据所公开的方法保护植物包括降低线虫对植物根部的穿透率、降低穿透根部的线虫的数量、降低线虫的孵化卵的数量、降低线虫的卵孵化率、将线虫吸引至包含本发明的细菌的组合物、杀死线虫或其任何组合。
如本文所用，术语“生长培养基”是指设计用于支持植物生长的任何固体、液体或半固体。在一些实施方式中，生长培养基是土壤或泥土。在一些实施方式中，生长培养基包含线虫。在一些实施方式中，生长培养基被线虫侵染。在一些实施方式中，生长培养基适合支持线虫。
在一些实施方式中，植物在生长培养基中生长。在一些实施方式中，至少植物根部在生长培养基中生长。在一些实施方式中，植物根部在生长培养基中生长。在一些实施方式中，根据所公开的方法保护的植物根部在生长培养基内。
在一些实施方式中，本发明的组合物是线虫的比植物或植物根部更强的引诱剂。在一些实施方式中，本发明的组合物是植物或植物根部的至少两倍好的引诱剂。在一些实施方式中，本发明的组合物是植物或植物根部的至少十倍好的引诱剂。普通技术人员将理解，通过将线虫吸引到组合物中，使它们远离植物，从而使植物没有线虫造成的损害或降低线虫造成的损害。与将放置在植物本身或其根部上的线虫杀死细菌不同，本发明的组合物放置在距植物一定距离处以使线虫离开植物。
在一些实施方式中，根据所公开的方法保护植物是通过使用于培养植物的生长培养基与本发明的组合物接触。在一些实施方式中，接触生长培养基不包括接触根部或植物。在一些实施方式中，接触的距离足以使线虫吸引至本发明的组合物而不是植物。在一些实施方式中，接触生长培养基的距离为距植物根部至少0.1cm、至少0.2cm、至少0.5cm、至少1cm、至少5cm、至少10cm、至少50cm、至少1m、至少1.5m、至少2m。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，接触生长培养基的距离为距植物根部0.1-0.5cm、0.4-1cm、0.5-5cm、1-15cm、5-50cm、40-100cm、50-150cm或1-2m。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，接触生长培养基的距离最多为5cm、10cm、20cm、30cm、40cm、50cm、60cm、70cm、80cm、90cm、100cm、150cm、200cm、250cm、300cm、400cm、500cm、600cm、700cm、750cm、800cm、900cm、1,000cm、1,500cm、2,000cm、2,500cm、3,000cm、3,500cm、4,000cm、4,500cm、或5,000cm或它们之间的任何范围或值。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，接触生长培养基的距离最多为2-5m。
除非另有说明，本文所述的任何浓度范围、百分比范围或比率范围应理解为包括该范围内的任何整数及其分数的浓度、百分比或比率，例如整数的十分之一和百分之一。
除非另有说明，本文所述的与任何物理特征(例如重量)相关的任何数字范围应理解为包括所述范围内的任何整数。
在整个本申请中，本发明的多种实施方式可以以范围格式呈现。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，并不应理解为对本发明范围的不灵活限制。因此，范围的描述应该被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，对例如1到6的范围的描述应该被认为具有具体公开的子范围，例如从1到3、从1到4、从1到5、从2到4、从2到6、从3到6等，以及该范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的宽度如何，这都适用。
每当一个数值范围在本文中被指出，它意味着包括在指示范围内的任何引用的数字(分数或整数)。短语“范围在”第一指示数字和第二指示数字之间和“范围为/从”第一指示数字“到”第二指示数字在本文中可互换使用并且意在包括第一和第二指示数字以及它们之间的所有分数和整数。
在讨论中，除非另有说明，修饰本发明实施方式的一个或多个特征的条件或关系特征的形容词如“基本上”和“大约”应理解为表示条件或特征被定义为在对于预期应用的实施方式的操作可接受的公差内。除非另有说明，否则说明书和权利要求书中的词语“或”被认为是包含性的“或”而不是排他性的或，并且表示它所结合的项目中的至少一个或任何组合。
应当理解，如上文和本文其他地方使用的术语“一个”和“一种”是指所列举的部件中的“一个或多个”。除非另有明确说明，否则本领域普通技术人员将清楚单数的使用包括复数。因此，术语“一个”、“一种”和“至少一个”在本申请中可互换使用。
为了更好地理解本教导并且决不限制教导的范围，除非另有说明，所有表示数量、百分比或比例的数字以及说明书和权利要求书中使用的其他数值都应被理解在所有情况下都被术语“大约”修饰。因此，除非另有说明，以下说明书和所附权利要求中阐述的数值参数是近似值，其可以根据寻求获得的期望特性而变化。至少，每个数值参数至少应该根据报告的有效数字的数量并通过应用普通的舍入技术来解释。
在本申请的说明书和权利要求书中，动词“包括”、“包含”和“具有”及其词形变化中的每一个用于表示动词的一个或多个宾语不一定是动词的一个或多个主语的部件、元件或部分的完整列表。
如本文所用的其他术语意在由它们在本领域中众所周知的含义来定义。
本发明的另外目的、优点和新颖特征在检查以下实施例后对于本领域普通技术人员将变得显而易见，这些实施例并非旨在是限制性的。另外，如上文所述和如在所附权利要求部分中所要求保护的本发明的多种实施方式和方面中的每一个在以下实施例中找到实验支持。
应当理解，为了清楚起见，在单独实施方式的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方式中组合地提供。相反地，为简洁起见，在单个实施方式的上下文中描述的本发明的多种特征也可以单独提供或以任何合适的子组合或适合于本发明的任何其他描述的实施方式来提供。在多种实施方式的上下文中描述的某些特征不应被认为是那些实施方式的必要特征，除非该实施方式在没有这些要素的情况下是无效的。
实施例
材料和方法
细菌分离菌
2018年5月，从位于Hatzeva的Yair研发站收集了被南方根结线虫侵染的茄子的根部系统。用超纯水清洗根部，并在1％(v/v)的次氯酸钠中浸泡5分钟。用超纯水再次洗涤后，用消毒的手术刀从外部刮下成熟的结，解剖并放入15ml磷酸盐缓冲盐水(PBS；BiologicalIndustries)中并剧烈搅拌。然后将四十(40)μlPBS涂抹在牛肉膏蛋白胨琼脂(BEPA)板上(牛肉膏3g/L；蛋白胨10g/L；NaCl 5g/L；琼脂20g/L；pH 7.0)，其和两个2.5L AnaeroGen大气生成小袋(Thermo Scientific)与空白琼脂-BEPA板一起在缺氧条件下(5L模块化温育箱(billups-rothenberg))37℃培养72小时以验证培养基的无菌性。72小时后，将检测到的每种独特菌落形式的一个菌落分离到新鲜的BEPA板上，然后将该板在相同条件下再次温育另外的72小时。将分离的纯克隆舀入5ml液体牛肉膏蛋白胨培养基中，使其温育另外72小时。如本文以下所述，进一步使用液体培养物。所有细菌操作均在2型生物罩(MRC)中进行。
幼年阶段2(J2)分离
为了在12孔板中分离J2幼虫用于每个吸引测定，用超纯水彻底清洗三个茄子的根部系统，用手术刀切碎并放置在bearman托盘中过夜，如前所述(Williamson和
Figure BDA0003620980160000151
(2017))。然后将bearman托盘滤液通过1号Whatman纸过滤。将J2重悬于1ml超纯水中，并在解剖显微镜下检查J2群落的纯度。根结线虫的J2比其他线虫的J2至少小3倍，这能够确认提取的群落仅包含根结线虫。
细菌分离菌鉴定
对于分类学鉴定，使用DNeasy血液和组织DNA提取试剂盒(Qiagen)从分离菌菌落中提取DNA，并使用引物BacSSU_FAM27f(5'-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'；SEQ ID NO:2)和BacSSU_1407R(5'-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'；SEQ ID NO:3)通过PCR反应扩增16S-rRNA基因。按照所提供的说明书，在SimpliAmp热循环仪(ABI)上使用KAPA HiFi HotStartReadyMix PCR试剂盒(Kapa Biosystems)以三个重复进行PCR反应(95℃–3min，一个循环；98℃–20s、57℃–15s、72℃–21s，33个循环；72℃–1min，一个循环)。PCR产物用AgencourtAMPure XP纯化并在ABI PRISM BigDye Terminator测序仪上直接测序。使用整个blast核苷酸数据库对1,380bp长的扩增产物进行在线blast分析。
吸引测定
吸引测定在两个12孔板中进行，每个孔包含1ml Pluronic P-127Tris MES缓冲凝胶，如前所述制备(Williamson和
Figure BDA0003620980160000161
(2017))，并与大约200只J2幼虫混合。将移液管吸头所含的分离菌与茄子根部片段一起放入孔中，彼此相距20mm，并比较每个吸引的J2幼虫的数量(图1)。对每种测试的细菌分离菌进行八次重复。作为对照，将根部片段与含有无菌BEPA培养基的移液管吸头一起放入孔中，并如上所述比较吸引。测定持续10分钟，之后计数到达根面的所有J2幼虫以及聚集在含细菌的移液管吸头中的J2幼虫。
卵孵化抑制测定
为了测试细菌分泌物对卵孵化的抑制作用，将单个卵块放置在12孔板的每个孔的中间，在1ml的pluronic凝胶内。卵暴露于四种处理：(1)含有双蒸馏水(DDH)的Biocasle胶囊(Menashe和Kurzbaum，2014)，(2)含有无菌培养基的Biocasle胶囊，(3)含有过滤培养基的Biocasle胶囊(参见吸引测定2)和(4)在其培养基中含有细菌Biocasle胶囊(参见吸引测定2)。每个处理在六个孔中重复。在24小时和48小时后对孵化进行计数。
实施例1
细菌分离菌1吸引J2幼虫
在分离过程中鉴定出六种独特的菌落形式，其中两种似乎是细菌，而不是真菌。本发明人将它们命名为分离菌1和6，并在吸引测定中进一步测试它们。在吸引测定中，当与分离菌6或对照(不含细菌分离菌)共同温育时，根部片段吸引了5到17只J2幼虫。在含有分离菌1的所有重复中，在检查的时间范围内，超过70只J2幼虫被吸引到含有细菌的吸头。没有观察到J2幼虫被吸引到含有分离菌6或无菌培养基二者之一的移液管吸头。下文总结了测定结果(表1)。
表1.第一吸引测定-结果
Figure BDA0003620980160000171
设计第二吸引测定以比较分离菌的吸引与其滤液的吸引。为了产生滤液，如上所述，将细菌在BEPA培养基中培养三天。然后通过0.45微米孔径的过滤器过滤培养基。测定如上进行，使用罗勒属植物根部(basil roots)，进行4次处理，每个处理4次重复：(i)根部对比分离菌，(ii)根部对比滤液，(iii)根部对比无菌培养基和(iv)仅根部。将测定板温育过夜，然后根据(如Thies等人(2002年))对根部进行染色，并使用解剖显微镜对根部和吸头上的J2进行计数。结果总结在表2中。
表2.第二吸引测定2-结果
Figure BDA0003620980160000172
根据结果，滤液和细菌二者对J2的吸引至少是根部片段的两倍。这表明可以独立利用由细菌分泌的活性化合物。
实施例2
细菌分离菌1是新的和独特的假单胞菌种
使用细菌分离菌1的DNA提取物作为模板和如上所述的一组引物通过PCR扩增16S-rRNA基因。对产物进行纯化和测序，随后对序列同源性进行生物信息学分析。
为了确定该分离菌是否为新种类，使用在线版本的BLAST从GenBank中检索了318个最相似的序列。这些序列代表了220个种类。使用MAFFT以1,000次最大迭代比对序列，并使用TrimA1中的gappyout算法修剪得到的比对。使用FastTree 2.1重建系统发育树，使用GTR取代模型。该数据用于基于不同位置的比例(图2A)或树枝距离(图2B)计算种内距离的分布(图2)。两种方法都显示分离菌与其最近的测序亲属(GenBank登录号NR_151929.1)之间的距离显著大于种类内预期的距离(分别为P值<0.0227和P值<0.0045)。因此，新分离的细菌是新种类，其包含与其最接近的亲属相差1.7％的SSU序列。
此外，发明人已经进行了广泛的遗传距离分析。为了计算本发明的新细菌分离菌的基因组装配与最接近的已发表基因组之间的遗传距离，发明人使用blastn的在线版本以SEQ ID NO:1为查询内容，查询了NCBI RefSeq基因组数据库。在基因组条目CP016162中发现了最佳匹配，然后将其完全下载，并使用程序Mummer4与本文公开的分离菌的基因组装配的支架进行比对。包括所有长度超过10,000bp的支架，并成功比对了4,230,689bp的累积长度。支架和参考序列之间的加权平均同一性为93％。
总之，发明人已经分离并鉴定了在茄子结中发现的新的和独特的假单胞菌种类，它对根结线虫J2幼虫的吸引比茄子根部本身高一个数量级，并建议将其作为生物防治用途的候选者。
实施例3
细菌及其分泌物抑制致病线虫卵的孵化
本发明人进一步检查了细菌本身或其分泌物是否抑制致病线虫卵的孵化。实际上，本发明人表明，在温育24小时后，与对照(例如，DDH或无菌培养基处理，图3(校正的p值<0.01))相比，观察到用活细菌的孵化显著降低。在48小时后，与相关对照(例如，DDH和无菌培养基处理，校正p值分别<0.01和<0.03)相比，观察到用活细菌和用细菌滤液二者的孵化显著降低(见图3)。
尽管已经结合其具体实施例描述了本发明，但很明显，许多替代、修改和变化对于本领域技术人员来说将是显而易见的。因此，旨在涵盖落入所附权利要求的精神和广泛范围内的所有这些替代、修改和变化。
序列表
<110> 死海和阿拉瓦科学中心
<120> 吸引线虫的细菌及其使用方法
<130> DSA-P-002-PCT
<150> 62/896,640
<151> 2019-09-06
<160> 3
<170> PatentIn 版本3.5
<210> 1
<211> 1327
<212> DNA
<213> 假单胞菌属某种
<400> 1
gatagagagg ctgctgtaga atgcgcgcct cggttgagac gaaaggctta accaactgtt 60
ctttaacaac tgaatcaagc aattcgtgtg ggtgcttgtg aggtaagact gatagtcaac 120
tgattatcag catcacaaag caacactcgt taattcgaga gttacctttc attaatttga 180
aagttttgcg attgctgagc caagtttagg gttttctcaa aacccaagca gtattgaact 240
gaagagtttg atcatggctc agattgaacg ctggcggcag gcctaacaca tgcaagtcga 300
gcggatgaga ggagcttgct ccttgattta gcggcggacg ggtgagtaat gcctaggaat 360
ctgcctggta gtgggggata acgtccggaa acgggcgcta ataccgcata cgtcctacgg 420
gagaaagcag gggaccttcg ggccttgcgc tatcagatga gcctaggtcg gattagctag 480
ttggtgaggt aatggctcac caaggcgacg atccgtaact ggtctgagag gatgatcagt 540
cacactggaa ctgagacacg gtccagactc ctacgggagg cagcagtggg gaatattgga 600
caatgggcga aagcctgatc cagccatgcc gcgtgtgtga agaaggtctt cggattgtaa 660
agcactttaa gttgggagga agggcattaa cctaatacgt tagtgttttg acgttaccga 720
cagaataagc accggctaac ttcgtgccag cagccgcggt aatacgaagg gtgcaagcgt 780
taatcggaat tactgggcgt aaagcgcgcg taggtggttc gttaagttgg atgtgaaagc 840
cccgggctca acctgggaac tgcatccaaa actggcgagc tagagtacgg tagagggtgg 900
tggaatttcc tgtgtagcgg tgaaatgcgt agatatagga aggaacacca gtggcgaagg 960
cgaccacctg gactgatact gacactgagg tgcgaaagcg tggggagcaa acaggattag 1020
ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg tcaactagcc gttgggttcc ttgagaactt 1080
agtggcgcag ctaacgcatt aagttgaccg cctggggagt acggccgcaa ggttaaaact 1140
caaatgaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg 1200
cgaagaacct tacctggcct tgacatgctg agaactttcc agagatggat tggtgccttc 1260
gggaactcag acacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt 1320
aagtccc 1327
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 2
agtttgatcm tggctcag 18
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 3
gacgggcggt gtgtrc 16

Claims (32)

1.一种假单胞菌属的分离的细菌菌株，其包含与以BioSample登录号SAMN15770455保藏在NCBI的基因组具有至少94％同源性或同一性的基因组。
2.根据权利要求1所述的分离的细菌菌株，其包含与以BioSample登录号SAMN15770455保藏在NCBI的所述基因组具有100％同源性或同一性的基因组。
3.根据权利要求1或2所述的分离的细菌菌株，其包含与SEQ ID NO:1具有至少90％同源性或同一性的多核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的分离的细菌菌株，其包含与SEQ ID NO:1具有100％同源性或同一性的多核苷酸序列。
5.根据权利要求3或4的分离的细菌菌株，其中与SEQ ID NO:1具有至少90％同源性或同一性的所述多核苷酸序列是16S-rRNA序列。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的分离的细菌菌株，其特征在于具有线虫趋化性诱导活性、线虫卵孵化抑制活性、杀线虫活性或其任何组合。
7.一种组合物，其包含根据权利要求1至6中任一项所述的分离的细菌菌株和农业或环境可接受的载体。
8.根据权利要求7所述的组合物，其进一步包含人工支持物。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述分离的细菌菌株与所述人工支持物结合或在所述人工支持物内。
10.根据权利要求8或9所述的组合物，其中所述人工支持物被配置为诱捕被所述分离的细菌菌株吸引的线虫。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述线虫属于根结线虫属。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述线虫是南方根结线虫。
13.一种将线虫吸引到表面的方法，其包括使所述表面与具有线虫趋化性诱导活性的细菌接触，从而将所述线虫吸引到所述表面。
14.一种保护植物免受线虫诱导的损害的方法，其包括：使包含线虫的生长培养基与包含具有线虫趋化性诱导活性的细菌和人工支持物的组合物接触，其中所述细菌与所述人工支持物结合或在所述人工支持物内，从而保护所述植物免受线虫诱导的损害。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述细菌属于假单胞菌属。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中所述细菌是根据权利要求1至6中任一项所述的分离的细菌菌株。
17.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中所述细菌是根据权利要求1至6中任一项所述的分离的细菌菌株。
18.根据权利要求13至17中任一项所述的方法，其中所述线虫是植物寄生线虫(PPN)。
19.根据权利要求13至18中任一项所述的方法，其中所述线虫属于根结线虫属。
20.根据权利要求19的方法，其中属于根结线虫属的所述线虫是南方根结线虫。
21.根据权利要求13至20中任一项所述的方法，其中所述组合物是根据权利要求7至12中任一项所述的组合物。
22.根据权利要求14至21中任一项所述的方法，其中所述组合物是比所述根部是所述线虫的引诱剂更强的所述线虫的引诱剂。
23.根据权利要求22的方法，其中所述组合物是所述根部至少两倍的引诱剂。
24.根据权利要求14至23中任一项所述的方法，其中所述保护所述植物包括降低所述线虫对所述根部的穿透率、降低穿透所述根的线虫的数量、降低所述线虫的孵化卵的数量、降低所述线虫卵的卵孵化率或其任何组合。
25.根据权利要求13至24中任一项所述的方法，其中具有线虫趋化性诱导活性的所述细菌将所述线虫诱捕在所述组合物中。
26.根据权利要求13至25中任一项所述的方法，其中所述组合物降低所述线虫的存活率。
27.根据权利要求13至26中任一项所述的方法，其中所述组合物杀死所述线虫。
28.根据权利要求14至27中任一项所述的方法，其中所述人工支持物被配置为诱捕被所述细菌吸引的线虫。
29.根据权利要求13至28中任一项所述的方法，其中所述组合物具有杀线虫活性。
30.根据权利要求14至29中任一项所述的方法，其中所述保护包括将所述线虫吸引至所述组合物。
31.根据权利要求14至30中任一项所述的方法，其中所述接触所述生长培养基不包括接触所述植物的根部。
32.根据权利要求14至31中任一项所述的方法，其中所述接触所述生长培养基是在距所述植物的根部至少0.1cm的距离处。
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