CN107674850A - 一种杀根结线虫的莓实假单孢菌Sned811、代谢产物及应用 - Google Patents

一种杀根结线虫的莓实假单孢菌Sned811、代谢产物及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种毒杀番茄南方根结线虫的莓实假单孢菌Sned811，所述莓实假单孢菌Sned811的分类命名为莓实假单孢菌(Pseudomonas fragi)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14018，保藏日期为2017年4月12日。该菌株按常规液体发酵培养后的代谢产物可以开发出对番茄南方根结线虫具有较强毒杀作用的生物制剂，对番茄南方根结线虫具有较强毒杀作用，并对其卵囊的孵化具有明显抑制作用，是很有潜力的生防细菌，在防治农作物根结线虫伤害方面具有良好的应用前景。

Description

一种杀根结线虫的莓实假单孢菌Sned811、代谢产物及应用
技术领域
本发明属于微生物农药技术领域，具体涉及一种杀根结线虫的莓实假单孢菌Sned811、代谢产物及应用。
背景技术
根结线虫(Meloidogyne incognita)在世界各地的蔬菜中造成重大的产量损失，难以控制，线虫危害同时导致植物更易受其他真菌和细菌的复合侵染。有效的高毒高残留化学杀线剂对土壤生态系统，地下水和人类健康构成潜在威胁。目前，对化学杀线剂的不满已经刺激了无污染替代控制策略的研究。开发高毒高残留化学杀线剂的替代品是未来的主要事项之一。
土壤微生物种类、数量繁多，与土壤线虫和作物根系密切相关。其中有许多有益微生物可以抑制线虫，促进植物和其他有益微生物的生长。筛选RKN的微生物拮抗剂并探索这些微生物在RKN疾病中的作用是预防和控制RKN疾病的基础。到目前为止，对RKN抗性的研究主要集中在细菌和真菌上，细菌由于易于培养、定殖，且对植物寄生线虫的致死性强，因此对生防细菌的研究比较多。作为一类线虫害虫的重要天敌，有害的细菌表现出不同的作用方式：这些包括寄生虫；产生毒素，抗生素或酶；竞争营养；诱导植物的系统抗性；并促进植物健康。它们通过直接抑制线虫，促进植物生长，促进微生物拮抗剂的根际定殖和活性，对线虫起协同作用。
已报道的可防治植物寄生线虫的生防细菌主要类群有：Bacillius，Pseudomonas，Acinebacter，Chromobacterium，Enterobacter，Serratia，Burkholderia等，其中以Bacillus和Pseudomonas中的种类最多。多样的生境造就了假单胞菌拥有较广的生长温度、pH值范围和较多的营养代谢类型。研究表明，假单胞菌可促进种子萌发、根生长、矿物营养的积累、水分的利用和防治植物病害，使得假单胞菌作为生防菌具有广阔的应用前景。研究发现铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)和荧光假单孢菌(P.fluorescens)也具有防治根结线虫病的能力，而且荧光假单孢菌产生的一种胞外蛋白酶在防治南方根结线虫的过程中发挥了重要作用。Larrt等研究发现，P.aeruginosa PA01产生的氰化物是致死线虫唯一或主要的毒性因子。Jang等研究发现P.chlororaphis O6具有较强的杀线虫活性，推测是其产生的氰化物的起到重要作用。而利用莓实假单胞菌或莓实假单胞菌的代谢产物对番茄根部进行处理，来防治南方根结线虫的方法尚未有报道。
针对生产上存在这一问题，通过系统筛选获得一株细菌菌株，利用该菌株的代谢产物处理番茄根部，可对南方根结线虫具有较强毒杀作用，并对其卵囊的孵化具有明显抑制作用，从而解决了南方根结线虫病的问题。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种杀根结线虫的莓实假单孢菌Sned811、代谢产物及应用，该莓实假单孢菌Sned811经发酵培养后的代谢产物对农作物进行灌根处理后，能够抑制农作物根结线虫的危害，在制备杀死根结线虫的生物防治菌剂中具有良好的应用前景。
本发明的第一个目的是提供一种具有杀根结线虫活性的莓实假单孢菌Sned811，所述莓实假单孢菌Sned811的分类命名为莓实假单孢菌(Pseudomonas fragi)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14018，保藏日期为2017年4月12日。
本发明的第二个目的是提供一种由所述的莓实假单孢菌Sned811制备成的杀根结线虫代谢产物。
本发明的第三个目的是提供该杀根结线虫代谢产物的制备方法，将莓实假单孢菌Sned811的试管菌种活化后，接种至试管培养基中进行种子培养，然后将得到的种子液接种于液体发酵培养基中进行发酵培养，得到杀根结线虫代谢产物；
所述液体发酵培养基的配方为：以质量百分比计，酵母浸膏0.1～0.2％、蛋白胨0.5～0.6％、牛肉浸膏0.3～0.4％、蔗糖1～2％，余下为蒸馏水，pH为6.8～7.0。
优选地，所述发酵培养的条件为：25～28℃，120～150r/min摇床发酵2～3d。
优选地，每升所述试管培养基的配方为：牛肉膏3g，蛋白胨5g，蔗糖10g，琼脂17-20g，余下为蒸馏水。
本发明的第四个目的是提供上述莓实假单孢菌Sned811在制备杀死根结线虫的生物防治菌剂中的应用。
本发明的第五个目的是提供上述代谢产物在制备杀死根结线虫的生物防治菌剂中的应用。
本发明的第六个目的是提供一种生物防治菌剂，包含上述的杀根结线虫代谢产物作为有效活性成分。
优选地，所述生物防治菌剂为番茄根部处理剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果具体如下：
本发明提供了一种具有杀根结线虫活性的莓实假单孢菌Sned811，还提供了由该莓实假单孢菌Sned811制成的具有杀根结线虫活性的代谢产物，它们对南方根结线虫具有较强毒杀作用，可用于番茄的根部处理，不仅对南方根结线虫二龄幼虫具有较强毒杀作用，同时对南方根结线虫卵囊的孵化具有很明显抑制作用，解决了根结线虫防治的难题。采用其制成的用于杀死根结线虫的生物防治菌剂，在防治农作物根结线虫伤害方面具有良好的应用前景。
生物材料保藏信息说明
1、莓实假单孢菌Sned811，已于2017年4月12日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.14018，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，分类命名为莓实假单孢菌(Pseudomonas fragi)。
附图说明
图1为本发明实施例中莓实假单孢菌Sneb811代谢产物对南方根结线虫二龄幼虫的致死率测定；
图2为本发明实施例中莓实假单孢菌Sneb811代谢产物对南方根结线虫卵囊孵化的抑制率测定。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。本发明以下实施例中，若没有特殊说明，所用试剂皆可在市场上购买得到，若没有特殊说明，所涉及的方法皆为常规方法。
本发明提供了一种具有杀根结线虫的莓实假单孢菌Sneb811，具体是从中国辽宁省沈阳市沈阳农业大学试验田中筛选出的对南方根结线虫具有较强毒杀作用，并对其卵囊的孵化具有明显抑制作用的细菌菌株。
我们对该莓实假单孢菌Sneb811的16S rDNA序列进行PCR扩增及测序，结果如下：
GGCATGCGGCAGCTACACATGCAGTCGAGCGGTAGAGAGAAGCTTGCTTCTCTTGAGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATACCTAGGAATCTGCCTGATAGTGGGGGATAACGTTCGGAAACGGACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCTACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTTACCTAATACGTGATTGTCTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTTGAATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCAAGCTAGAGTATGGTAGAGGGTAGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGGAGTCTTGAACTCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATCCAATGAACTTTCTAGAGATAGATTGGTGCCTTCGGGAACATTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTAATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGGAGGACGGTACCACGGTGATCTGCA。
将测得的上述16S rDNA序列于NCBI中http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi进行同源性搜索比对，并使用BLASTN 2.2.31系统在GenBank中进行同源性搜索，发现序列相似度最高的为Pseudomonas fragi菌株，序列相似度为99％，表明该菌株属于莓实假单孢菌。
基于相同的发明构思，本发明还提供了一种利用莓实假单孢菌Sned811制备成的杀根结线虫代谢产物，下面就以具体的示例对其进行详细的说明。
一、杀根结线虫代谢产物的制备
实施例1
本实施例一种利用莓实假单孢菌Sned811制备的杀根结线虫代谢产物，其制备方法具体如下：
将莓实假单孢菌Sned811的试管菌种活化后，接种至试管培养基中进行种子培养，试管培养基的配方为牛肉膏蛋白胨培养基，即成分：牛肉浸膏3g，酵母浸膏1g，蛋白胨10g，蔗糖10g，琼脂17g，加蒸馏水至1000mL。种子培养条件为：28℃培养3d，获得试管种子液。
然后将得到的种子液接种于250mL三角瓶(每瓶装150mL)液体发酵培养基中进行发酵培养，得到杀根结线虫代谢产物。所述液体发酵培养基的配方为：以质量百分比计，酵母浸膏0.1％、蛋白胨0.5％、牛肉浸膏0.3％、蔗糖1％，余下为蒸馏水，pH为6.8～7.0。发酵培养的条件为：25～28℃，120r/min摇床发酵2d。
实施例2
本实施例一种利用莓实假单孢菌Sned811制备的杀根结线虫代谢产物，其制备方法具体如下：
将莓实假单孢菌Sned811的试管菌种活化后，接种至试管培养基中进行种子培养，试管培养基的配方为牛肉膏蛋白胨培养基，即成分：牛肉浸膏3g，酵母浸膏1g，蛋白胨10g，蔗糖10g，琼脂20g，加蒸馏水至1000mL。种子培养条件为：28℃培养3d，获得试管种子液。
然后将得到的种子液接种于250mL三角瓶(每瓶装150mL)液体发酵培养基中进行发酵培养，得到杀根结线虫代谢产物。所述液体发酵培养基的配方为：以质量百分比计，酵母浸膏0.2％、蛋白胨0.6％、牛肉浸膏0.4％、蔗糖2％，余下为蒸馏水，pH为6.8～7.0。发酵培养的条件为：25～28℃，150r/min摇床发酵3d。
需要说明的是，杀根结线虫代谢产物的制备还可以通过大型发酵罐进行规模生产，其产品为发酵液或发酵液的制成品。形成的发酵液或发酵液的制成品可以直接处理南方根结线虫二龄幼虫及卵囊。处理后的二龄幼虫死亡率较高，卵囊的孵化抑制率也很高，可以减轻由根结线虫病害所造成的危害。
二、莓实假单孢菌Sned811代谢产物的杀根结线虫活性试验
1、制备试验制剂
按前述实施例1提供的方法制备莓实假单孢菌Sned811的杀根结线虫代谢产物，待备用。
2、制备虫悬液
从受南方根结线虫侵染的番茄根系挑取南方根结线虫(M.incognita)卵囊，放入盛有无菌水的灭菌培养皿中，然后用0.5％的次氯酸钠溶液消毒3min，再用无菌水冲洗6次，部分卵囊直接备用，另一部分放入添加适量无菌水的皮氏培养皿里，25℃恒温培养，将收集到的虫悬液加无菌水稀释，稀释到镜检后为60条/500μL的浓度，待备用。
3、杀根结线虫活性试验方法
用移液枪吸取莓实假单孢菌Sneb811代谢产物1mL于灭过菌的1.5mL离心管中，1000r/min高速离心15min，用移液枪吸取500μL上清液于皮氏培养皿，加入500μL上述配备好的虫悬液，24h，48h后镜检，查看线虫死亡率，以液体培养基做阳性对照，以无菌水做阴性对照。另吸取20μL离心后的莓实假单孢菌Sneb811代谢产物上清液于96孔板中，每孔一粒卵囊，24h和48h后分别镜检观察线虫卵的孵化率。
4、实验结果
实施例1提供的莓实假单孢菌Sneb811代谢产物对南方根结线虫二龄幼虫的致死率测定结果如图1所示，对南方根结线虫卵囊孵化的抑制率测定结果如图2所示。由图1可以看出，莓实假单孢菌Sneb811代谢产物对南方根结线虫二龄幼虫的致死率高达91.67％以上，并且随着时间的推移，致死率仍在上升；由图2可以看出，莓实假单孢菌Sneb811代谢产物对南方根结线虫卵囊的孵化率也高达75％以上。
三、莓实假单孢菌Sned811代谢产物对南方根结线虫盆栽效果试验
为了验证其触杀的稳定性，特此进行了盆栽的防治效果试验，本试验在沈阳农业大学温室大棚进行盆栽效果试验，以未灌根番茄植株和NB液体培养液灌根的番茄植株为对照，试验重复两次。具体实验过程如下：
1、制备试验制剂
按前述实施例1提供的方法制备莓实假单孢菌Sned811的杀根结线虫代谢产物，待备用。
2、制备试验用种子
L-402，辽宁省农业科学院蔬菜研究所。
3、供试线虫
从受南方根结线虫侵染的番茄根系挑取南方根结线虫(M.incognita)卵囊，放入盛有无菌水的灭菌培养皿中，然后用0.5％的次氯酸钠溶液消毒3min，再用无菌水冲洗6次，部分卵囊直接备用，另一部分放入添加适量无菌水的皮氏培养皿里，25℃恒温培养，将收集到的虫悬液加无菌水稀释，稀释到镜检后为60条/500μL的浓度，待备用。
4、试验方法
待番茄植株长到四叶期时进行移栽，移栽到12×12cm的钵中，定植1-2天后，每盆接种2000天根结线虫，将莓实假单孢菌Sned811的发酵液原液采用液种1:20体积比进行稀释后灌根处理。以未灌根的番茄植株和NB液体培养基灌根的番茄植株为对照，在移栽后30d进行调查，测量番茄株高、根长、根鲜重和根结数。具体结果如表1所示：
表1：莓实假单孢菌Sned811的杀根结线虫代谢产物的盆栽试验结果
注：+RKN均代表接种番茄南方根结线虫；不同的字母表示显着差异(T检验P≤0.05)
由表1可以看出，使用实施例1提供的莓实假单孢菌Sned811的杀根结线虫代谢产物处理的番茄，根结数明显低于对照，番茄株高、根长、根鲜重与未处理的番茄存在明显差异，盆栽防效为83.65％。
上述实验表明，本发明提供的莓实假单孢菌Sned811及其代谢产物可以有效防治农作物的根结线虫伤害，效果显著，解决了根结线虫防治的难题。在防治农作物根结线虫伤害方面具有良好的应用前景，可以制成用于杀死根结线虫的生物防治菌剂，例如番茄根部处理剂等。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (9)

1.一种杀根结线虫的莓实假单孢菌Sned811，其特征在于，所述莓实假单孢菌Sned811的分类命名为莓实假单孢菌(Pseudomonas fragi)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14018，保藏日期为2017年4月12日。
2.一种利用权利要求1所述的莓实假单孢菌Sned811制备成的杀根结线虫代谢产物。
3.根据权利要求2所述的杀根结线虫代谢产物的制备方法，其特征在于，将莓实假单孢菌Sned811的试管菌种活化后，接种至试管培养基中进行种子培养，然后将得到的种子液接种于液体发酵培养基中进行发酵培养，得到杀根结线虫代谢产物；
所述液体发酵培养基的配方为：以质量百分比计，酵母浸膏0.1～0.2％、蛋白胨0.5～0.6％、牛肉浸膏0.3～0.4％、蔗糖1～2％，余下为蒸馏水，pH为6.8～7.0。
4.根据权利要求3所述的杀根结线虫代谢产物的制备方法，其特征在于，所述发酵培养的条件为：25～28℃，120～150r/min摇床发酵2～3d。
5.根据权利要求3所述的杀根结线虫代谢产物的制备方法，其特征在于，每升所述试管培养基的配方为：牛肉膏3g，蛋白胨5g，蔗糖10g，琼脂17-20g，余下为蒸馏水。
6.一种权利要求1所述的莓实假单孢菌Sned811在制备杀死根结线虫的生物防治菌剂中的应用。
7.一种权利要求2所述的代谢产物在制备杀死根结线虫的生物防治菌剂中的应用。
8.一种生物防治菌剂，其特征在于，包含权利要求2所述的杀根结线虫代谢产物作为有效活性成分。
9.根据权利要求8所述的生物防治菌剂，其特征在于，所述生物防治菌剂为番茄根部处理剂。
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