CN107299069A

CN107299069A - 农用微生物制剂及其在防治瓜类根结线虫和西瓜枯萎病方面的应用

Info

Publication number: CN107299069A
Application number: CN201710676684.0A
Authority: CN
Inventors: 陈继峰; 张晓雨; 刘洪源; 周艺凯; 钟贤宇; 孙佳宁; 侯贝; 刘宇翔
Original assignee: Zhengzhou University
Current assignee: Zhengzhou University
Priority date: 2017-08-09
Filing date: 2017-08-09
Publication date: 2017-10-27
Anticipated expiration: 2037-08-09
Also published as: CN107299069B

Abstract

本发明公开了一种农用微生物制剂，包括霉菌制剂或/和细菌制剂，其中霉菌制剂是在特殊配制的液体培养基中接种霉菌孢子，得到霉菌发酵液；再采用豆粕、玉米面、麸皮等制得霉菌菌剂制备培养基；将二者按比例混合并培养发酵，风干后粉碎即可；细菌制剂同样先配制液体培养基，并接种细菌后得到细菌发酵液；将其与细菌菌剂制备培养基按比例混合培养发酵，风干粉碎即可。本发明配制的微生物制剂绿色、安全，施加在土壤中后对防治土壤根结线虫和西瓜枯萎病发挥了有效作用，增强作物根系益菌群生长繁殖，抑制了有害菌群的生长，减少了病虫害发生；由于不再施加农药，不存在农药残留的问题，实现生产绿色健康农产品的要求；并且可使作物生长旺盛，增产增收。

Description

农用微生物制剂及其在防治瓜类根结线虫和西瓜枯萎病方面的应用

技术领域

本发明涉及微生物制剂，尤其是涉及一种农用微生物制剂，本发明还涉及该微生物制剂在防治瓜类根结线虫和西瓜枯萎病方面的应用。

背景技术

作物感染根结线虫，尤其是对于保护地栽培和反季节栽培的瓜果、蔬菜来说是一种很普遍的病虫害现象，如果根结线虫病害不能被有效抑制和解决，便会导致瓜果、蔬菜叶片颜色变淡或者发黄，植株根系受损，导致植株吸收养分能力下降，从而致使植株矮小、生长势弱、果子僵化、停止生长，降低产量，严重时会导致作物枯死和绝收。

目前，随着人类生活水平的提高以及对绿色食品的需求不断增加，生物农药备受瓜果、蔬菜种植者的青睐。阿维菌素是阿佛曼链霉菌或灰色链霉菌的微生物发酵产物，是大环内酯化合物，施用阿维菌素防治土壤根结线虫是当前生物农药市场中最受欢迎和具有竞争力的产品，曾为农业生产作出了巨大贡献。但是，一方面阿维菌素属于一种新型抗生素类生物农药，长期施用会导致作物出现抗药性；另一方面，由于阿维菌素只对幼虫或成虫有触杀作用，而对虫卵并无作用；并且，其中没有活菌存在，不能产生持续的抑制根结线虫的作用。因此，在生产上阿维菌素必须进行阶段性的使用或者同其他具有杀卵作用的农药同时使用才能达到良好的杀虫效果。然后，随着阿维菌素与农药的混合使用，又会对土壤微环境造成危害，降低土壤的可耕种性。

有一些地区的瓜果、蔬菜种植者为了防治根结线虫，甚至直接使用杀虫能力强的化学农药，化学农药不仅对土壤造成了污染，对种植在土壤上的瓜果蔬菜也造成了污染，因此才有了种瓜者不吃自己种的瓜，种菜者不吃自己种的菜的情景发生。

西瓜枯萎病俗称死秧病，是一种维管束系统遭到破坏的土传病害，是对西瓜危害最严重的病害之一。该病是由尖孢镰刀菌西瓜专化型[Fusarium oxysporumschlechlendahl f. sp. Melon]侵染所致，病菌在土壤和未腐熟的带菌肥料中越冬，在离开寄主情况下可存活5~6年，部分病菌可存活10年以上。该病主要靠含菌土壤传播，病株率高达70%左右。西瓜枯萎病在各个时期均可发生，以结果期发病最重，严重时甚至可造成绝产。

目前，在西瓜枯萎病防治方面，瓜农普遍使用的仍然是农药，虽然在防治西瓜枯萎病方面取得了一些成就，也为瓜农带来不少的收益，但是，一方面随着社会不断的发展和进步，人们的健康意识也在不断提高，对有机瓜果的需求越来越多，而农药的强烈药效在防治西瓜枯萎病的同时，会导致在瓜果上有所残留，对人类身体健康造成危害；另一方面，农药的大量使用不仅会产生抗药性，同时会给土壤带来严重的负担，造成土壤环境污染，使得土壤地力下降，增加能量消耗。

环境友好型微生物制剂的使用，不仅可以达到甚至超过农药对西瓜枯萎病的防治效果，而且可以提高土壤酶活性，改善土壤微环境，促进根系生长，有利于植株生长发育、产量与质量的提高。

针对现有农业生产的需要，制备一种安全无毒的生物制剂以有效防治土壤根结线虫和西瓜枯萎病对现代农业生产具有很好的现实意义。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术存在的缺陷而提供一种绿色安全的农用微生物制剂，本发明还提供该微生物制剂在防治瓜类根结线虫和西瓜枯萎病方面的应用。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的农用微生物制剂，包括霉菌制剂或/和细菌制剂，其中：

霉菌制剂的配制方法为：

第一步，称量去皮马铃薯20份，加适量去离子水100℃煮沸10min，过滤得到溶剂100份；添加葡萄糖2份搅拌均匀后封口121℃灭菌，冷却后得到液体培养基；

第二步，取第一步配制的液体培养基在无菌操作台上按8.33×10²-1.25×10³个/mL的接种量接种一接种环的霉菌孢子，封口包装后放入28℃摇床内培养4天，得到霉菌发酵液，继续放置5天，使液面形成一层孢子后待用，以便于后期接种菌剂制备培养基时形成更多的孢子；

第三步，准确称量豆粕10份，玉米面40份，麸皮20份，锯末30份，添加去离子水50~70份，搅拌均匀后，封口121℃灭菌，冷却后得到霉菌菌剂制备培养基；

第四步，将第三步制备的霉菌菌剂制备培养基中加入第二步制备的霉菌发酵液20份，接种后搅拌均匀，封口放入28℃培养箱中培养一周，接种之后2天搅拌一次，待发酵完成（大约7天时间，固体菌剂中的孢子数达到1.5×10¹²~2.2×10¹²）后放在阴凉处风干，之后粉碎成粉末状，得到成品霉菌制剂

细菌制剂的配制方法为：

第一步，准确称量牛肉膏0.5份，蛋白胨1份，氯化钠0.5 份，加去离子水100份，搅拌均匀后封口121℃灭菌，冷却后得到液体培养基；

第二步，取第一步配制的液体培养基在无菌操作台上按1.35×10³-2.03×10³个/mL的接种量接种一接种环的细菌，封口包装后放入36℃摇床内培养24小时，得到细菌活菌数为5.5×10⁸CFU/g的细菌发酵液；

第三步，准确称量豆粕18份，玉米面30份，麸皮32份，锯末20份，添加去离子水50~70份，搅拌均匀后，封口121℃灭菌，冷却后得到细菌菌剂制备培养基；

第四步，将第三步制备的细菌菌剂制备培养基中加入第二步制备的细菌发酵液20份，搅拌均匀后封口放入36℃培养箱中培养24h（固体菌剂培养基中芽孢数达到1.0×10¹⁰~1.56×10¹⁰），发酵成功后将其放在阴凉处风干，粉粹形成粉末状，得到成品细菌制剂。

本发明所用的霉菌为淡紫拟青霉，米曲霉，康宁木霉，哈茨木霉，球孢白僵菌，绿色木霉,黑曲霉菌；细菌为枯草芽孢杆菌，荧光假单胞菌，多粘类芽孢杆菌。

本发明配制的霉菌制剂可以为单一菌种，也可以多菌种混合，同样，本发明配制的细菌制剂也可以为单一菌种，也可以多菌种混合，效果均好；

而本发明配制的霉菌制剂和细菌制剂也可以单独使用，同时也可以混合使用，当二者混合使用时，霉菌制剂和细菌制剂的混合比例为1~2:1。

当霉菌选用淡紫拟青霉，米曲霉，康宁木霉，哈茨木霉，球孢白僵菌，绿色木霉；细菌选用枯草芽孢杆菌或荧光假单胞菌时，本发明配制的农用微生物制剂（包括霉菌制剂和细菌制剂）可以在防治瓜类根结线虫方面得以应用。

当霉菌选用黑曲霉，米曲霉，康宁木霉或哈茨木霉；细菌选用枯草芽孢杆菌或多粘类芽孢杆菌时，本发明配制的农用微生物制剂（包括霉菌制剂和细菌制剂）可以在防治西瓜枯萎病方面得以应用。

本发明的优点在于绿色、安全，施加在土壤中后可对防治土壤根结线虫发挥有效的作用，增强作物根系有益菌群的生长繁殖，克制有害菌群的生长，减少病虫害发生；不施加农药，不存在农药残留的问题，能实现生产绿色健康的农产品的要求；并且可以使作物生长旺盛，增产增收。

本发明根据微生物菌群能有利于活跃土壤中有益菌群的特性，并结合各种微生物之间的相互作用而研制的农用微生物制剂，能够有效制约或减少土壤中的根结线虫的生长；本发明使用的霉菌属于内寄生性真菌，这些真菌侵入线虫体内通常借助于粘性孢子产生芽管，穿过线虫角质膜，侵入后产生的菌丝分枝遍及整个虫体，吸取线虫体内物质，着生孢子的菌丝又从死亡的线虫体内伸出，继续侵染其他线虫；本发明使用的细菌通常以内生孢子粘附于线虫的体表，进而侵入线虫体内，随着线虫的发育，细菌也不断的在其体内增殖，发育到成虫时，线虫体内也充满了细菌，从而导致线虫被彻底的摧毁，释放大量的细菌于土壤中继续侵染其他线虫；从而能有效、长期的防治瓜类根结线虫。本发明使用的霉菌和细菌还能与植物根系建立互惠共生体，从而促进共生植物的生长，增强植株的抗逆性，提高作物产量。

同时，本发明使用的霉菌和细菌主要有重寄生、拮抗和竞争作用的生防机制，能与西瓜根系建立互惠共生体从而促进西瓜的生长，增强植株的抗逆性，抑制枯萎病病原菌的生存，从而有效防止西瓜枯萎病的发生。采用本发明生物制剂不仅不会对土壤环境造成危害，反而能够增加土壤有机质含量，改善土壤微环境，提高土壤的理化性质和生物活性。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明微生物制剂的制备方法及其使用方法进行详细介绍。

一、本发明微生物制剂在防治瓜类根结线虫方面的研究

实施例1

称取200 g去皮马铃薯切条放入1400mL去离子水中，100℃煮沸10 分钟，用三层纱布过滤并定容1000 mL作为溶剂；称取20 g葡萄糖加入溶剂中搅拌均匀后，分装于三角瓶中，封口包装放入121℃的灭菌锅内灭菌20 分钟，待冷却后即为制备好的霉菌液体培养基；

将霉菌液体培养基于无菌操作台上接种一接种环霉菌孢子——淡紫拟青霉，封口包装放入28℃的摇床内培养4天，得到霉菌——淡紫拟青霉发酵液，放置5天，使液面形成一层孢子层后备用；

称取豆粕100 g，玉米面400 g，麸皮200 g，锯末300 g于发酵桶里搅拌均匀，再加入600mL的去离子水混合均匀，封口包装放入121℃的灭菌锅灭菌40 分钟，即得霉菌菌剂制备培养基。

待霉菌菌剂制备培养基冷却至室温后，在无菌操作台上接种200 mL的霉菌—淡紫拟青霉发酵液，接种后搅拌均匀，封口包装放入28℃的培养箱培养一周，接种之后2天搅拌一次，待发酵完成（一般需要经过7天）后放在阴凉处风干并粉碎至粉末状，得到霉菌——淡紫拟青霉生物制剂T1。

实施例2

称取5 g牛肉膏，10 g蛋白胨，5 g氯化钠于量杯中，加去离子水至1000 mL，搅拌均匀并将pH调至7.0~7.2，分装于锥形瓶中，封口包装放入121℃的灭菌锅灭菌20分钟，待冷却即得细菌液体培养基；

将灭完菌并冷却好的液体培养基在无菌操作台上接种细菌——枯草芽孢杆菌，封口包装放入36℃的摇床内培养24小时，得到细菌——枯草芽孢杆菌发酵液；

称取豆粕180 g，玉米面300 g，麸皮320 g，锯末200 g于发酵桶里搅拌均匀，再加入600mL的去离子水混合均匀，封口包装放入121℃的灭菌锅灭菌40分钟，既得细菌菌剂制备培养基；

将冷却至室温的细菌菌剂制备培养基在无菌操作台上接种400 mL的细菌——枯草芽孢杆菌发酵液，搅拌均匀后封口包装放入36℃的培养箱培养24小时，发酵成功后放在阴凉处风干并粉碎至粉末状既得细菌——枯草芽孢杆菌生物制剂T2。

实施例3

采用实施例2中的方法制备细菌液体培养基。将细菌液体培养基于无菌操作台上接种细菌——荧光假单胞菌，封口包装放入36℃的摇床内培养24小时，得到细菌——荧光假单胞菌发酵液；

采用采用实施例2中的方法制备细菌菌剂制备培养基。冷却至室温后的细菌菌剂制备培养基于无菌操作台上接种400 mL的细菌——荧光假单胞菌发酵液，搅拌均匀后封口包装放入36℃的培养箱培养24小时，发酵成功后于阴凉处风干并粉碎成粉末状，得到细菌——荧光假单胞菌生物制剂T3。

实施例4

霉菌液体培养基制备方法同实施例1。将霉菌液体培养基于无菌操作台上接种霉菌——康宁木霉，封口包装放入28℃的摇床内培养4天，得到霉菌——康宁木霉发酵液，放置5天，使液面形成一层孢子后待接种霉菌菌剂制备培养基。

霉菌菌剂制备培养基制备方法同实施例1。冷却至室温后于无菌操作台上接种200mL的霉菌—康宁木霉发酵液，搅拌均匀后封口包装放入28℃的培养箱培养一周，接种后2天搅拌一次，发酵完成后放在阴凉处风干并粉碎至粉末状，得到霉菌—康宁木霉制剂。

在无菌操作台上，往新制备的霉菌液体培养基（制备方法同实施例1）中接种霉菌——绿色木霉，封口包装放入28℃的摇床内培养4天，得到霉菌——绿色木霉发酵液，放置5天，使液面形成一层孢子后待接种霉菌菌剂制备培养基。

在新制备的霉菌菌剂制备培养基（制备方法同实施例1）上接种200 mL的霉菌——绿色木霉发酵液，搅拌均匀后封口包装放入28℃的培养箱培养一周，接种后2天搅拌一次，发酵完成后放在阴凉处风干并粉碎至粉末状，得到霉菌——绿色木霉制剂。

将制备的霉菌——康宁木霉制剂和霉菌——绿色木霉制剂按1︰1之重量份混合均匀，得到生物制剂T4。

实施例5

将制备的细菌——枯草芽孢杆菌生物制剂T2和霉菌——绿色木霉制剂按1︰2之重量份混合均匀，得到生物制剂T5。

实施例6

将新制备的霉菌液体培养基（制备方法同实施例1）在无菌操作台上接种霉菌——哈茨木霉，封口包装放入28℃的摇床内培养4天，得到霉菌——哈茨木霉发酵液，放置5天，使液面形成一层孢子层后接种霉菌菌剂制备培养基。

在霉菌菌剂制备培养基（制备方法同实施例1）中接种200 mL的霉菌—哈茨木霉发酵液，搅拌均匀后封口包装放入28℃的培养箱培养一周，接种后2天搅拌一次，发酵完成后放在阴凉处风干粉碎至粉末状，得到霉菌——哈茨木霉制剂。

将制备的霉菌——哈茨木霉制剂、细菌——枯草芽孢杆菌生物制剂T2和细菌——荧光假单胞菌生物制剂T3按2︰0.5︰0.5之重量份混合均匀，得到生物制剂T6。

实施例7

将制备的霉菌——淡紫拟青霉生物制剂T1和细菌——枯草芽孢杆菌生物制剂T2按2︰1之重量份混合均匀，得到生物制剂T7。

实施例8

将制备的细菌——枯草芽孢杆菌生物制剂T2和细菌——荧光假单胞菌生物制剂T3按1︰1之重量份混合均匀，得到生物制剂T8。

实施例9

在新制备的霉菌液体培养基（制备方法见实施例1）中接种一接种环霉菌—球孢白僵菌，封口包装放入28℃的摇床内培养4天，得到霉菌——球孢白僵菌发酵液，放置5天，使液面形成一层孢子层后接种霉菌菌剂制备培养基。

在新制备的霉菌菌剂制备培养基（制备方法见实施例1）中接种200 mL的霉菌——球孢白僵菌发酵液，搅拌均匀后封口包装放入28℃的培养箱培养一周，接种后2天搅拌一次，发酵完成后放在阴凉处风干并粉碎成粉末状，即得霉菌——球孢白僵菌制剂；

将制备的霉菌——淡紫拟青霉生物制剂T1和霉菌—球孢白僵菌制剂按1︰1之重量份混合均匀，得到生物制剂T9。

实施例10

1、选用重茬多年的保护地，根结线虫危害严重的瓜果大棚为实验用地和易感染的根结线虫的南瓜苗作为实验对象。

2、将试验地分成小区，每小区面积为10 m²：设2个对照，不施加任何药剂的为阴性对照CK1，施加质量分数为0.2%阿维菌素乳油的为阳性对照CK2；其余9小区施加本发明实施例1~9制备的生物制剂T1~ T9。实验重复3次。

3、育苗定植时分别施加10 mL的质量分数为0.2%阿维菌素乳油和5 g 的本发明微生物制剂，与南瓜苗周围的土壤充分混匀，定植后两周在南瓜根系周围20 厘米左右追加一次0.2%阿维菌素乳油和本发明微生物制剂分别100 mL和100 g，与根系周围的土壤充分混匀。

4、试验过程中对照和处理采取相同田间管理，缓苗后，每隔一段时间测量不同处理的蔓长、茎粗及株高，瓜果中可溶性固形物含量，发病率、根上单位厘米的根结数，根际土壤中（50克）根结线虫的数量及虫口密度减少率以评价微生物制剂对根结线虫的田间防治效果。

本发明生物制剂防治根结线虫的防治效果见下表1和表2。

表1 施用本发明制剂对南瓜生长的影响（栽后32天）

根据表1可以得出：从茎粗、株高和蔓长来看，施加本发明制备的微生物制剂促进南瓜的生长能力高于CK2（质量分数为0.2%阿维菌素乳油）。

表2 施用本发明制剂对南瓜根结线虫防治效果和南瓜生长以及品质的影响（栽后78天）

注：表2中计算公式：发病率（%）=（有根结的须根数/总须根数）× 100

虫口密度减少率(%)=(对照区虫口密度一处理区虫口密度)／对照区虫口密度×100

由表2可以得出：从茎粗、株高和蔓长来看，施加本发明制备的微生物制剂可以促进南瓜的生长，其主要生长指标均高于质量分数为0.2%阿维菌素乳油（CK2）；施加本发明制备的微生物制剂的各个处理的南瓜中可溶性固形物含量不低于施加质量分数为0.2%阿维菌素乳油的。可溶性固形物含量的高低决定着南瓜中干物质的多少，甜度的高低，南瓜的甜度是南瓜品质的指标之一。说明施加本发明制剂不仅能够更好地促进南瓜的生长而且也利于其品质的提高。从单位厘米南瓜根系形成的根结数、50克根际土壤中根结线虫的数量、发病率以及虫口密度减少率来看，施加本发明制剂的各个处理（T1~T9）对于南瓜防治根结线虫的效果高于施加质量分数为0.2%阿维菌素乳油（CK2）。

实施例11

1、从南瓜根系根结上挑取卵囊，卵囊用0.2%次氯酸钠溶液消毒30s 后，用无菌水冲洗，将卵囊置于无菌水中孵化，把第2 天孵出的2龄幼虫配置成200条/mL左右的线虫悬浮液供试。

2、制备实施例1~9中的细菌、霉菌发酵液各50 mL，配制质量分数为0.2%的阿维菌素50 mL。

3、本实验选用24K孔板作为培养皿，并且每5格分为一组；本实验设9个处理，为2个对照。其中，施加本发明实施例1~9中的细菌、霉菌发酵液的为T1-T9，不施加任何药剂的为阴性对照CK1，施加质量分数为0.2%阿维菌素乳油的为阳性对照CK2。

4、使用移液枪吸取1 mL的线虫悬浮液于24K的孔板中，分别吸取2 mL的T1-T9和质量分数为0.2%的阿维菌素于孔板中。

5、在条件为25°C的培养箱下培养2天，分别于培养24小时，48小时后，在倒置显微镜下观察根结线虫的死亡数量。

6、各处理重复三次，以根结线虫死亡率的平均数作为评价依据。

表3 施用本发明制剂对根结线虫死亡率的影响

由表3可以得出：施用本发明制剂对根结线虫致死率高于质量分数为0.2%阿维菌素乳油。

总上所述，从表1、表2和表3各指标数据得出：本发明制备的微生物制剂能够有效抑制土壤中根结线虫的发生，对根结线虫的击倒率（致死率）明显高于农业生产上常用的阿维菌素。

本发明配制的微生物制剂也曾在山东潍坊寿光的反季节销售的蔬菜保护地里进行过西瓜、甜瓜、苦瓜、丝瓜的田间实验，实验证明，本发明制备的微生物制剂对土壤中的根结线虫均有较好地防治效果。

二、本发明微生物制剂在防治西瓜枯萎病方面的研究

实施例1

将霉菌液体培养基于无菌操作台上接种一接种环霉菌孢子——康宁木霉，封口包装放入28℃的摇床内培养4天，得到霉菌——康宁木霉发酵液，放置5天，使液面形成一层孢子层后备用；

待霉菌菌剂制备培养基冷却至室温后，在无菌操作台上接种200 mL的霉菌——康宁木霉发酵液，接种后搅拌均匀，封口包装放入28℃的培养箱培养一周，接种之后2天搅拌一次，待发酵完成（一般需要经过7天）后放在阴凉处风干并粉碎至粉末状，得到霉菌——康宁木霉生物制剂T11。

实施例2

采用实施例1中的方法制备霉菌液体培养基。将霉菌液体培养基于无菌操作台上接种霉菌——黑曲霉，封口包装放入28℃的摇床内培养4天，得到霉菌——黑曲霉发酵液，放置5天，使液面形成一层孢子后待接种霉菌菌剂制备培养基。；

采用实施例1中的方法制备霉菌菌菌剂制备培养基。冷却至室温后的霉菌菌剂制备培养基于无菌操作台上接种400 mL的霉菌——黑曲霉发酵液，搅拌均匀后封口包装放入28℃的培养箱培养一周，接种后2天搅拌一次，发酵完成后放在阴凉处风干并粉碎至粉末状，得到霉菌——黑曲霉制剂T21。

实施例3

霉菌液体培养基制备方法同实施例1。将细菌液体培养基于无菌操作台上接种霉菌——米曲霉，封口包装放入28℃的摇床内培养4天，得到霉菌——米曲霉发酵液，放置5天，使液面形成一层孢子后待接种霉菌菌剂制备培养基。；

霉菌菌剂制备培养基制备方法同实施例1。冷却至室温后的霉菌菌剂制备培养基于无菌操作台上接种400 mL的霉菌——米曲霉发酵液，搅拌均匀后封口包装放入28℃的培养箱培养一周，接种后2天搅拌一次，发酵完成后放在阴凉处风干并粉碎至粉末状，得到霉菌——米曲霉制剂T31。

实施例4

霉菌液体培养基制备方法同实施例1，将细菌液体培养基于无菌操作台上接种霉菌——哈茨木霉，封口包装放入28℃的摇床内培养4天，得到霉菌——哈茨木霉发酵液，放置5天，使液面形成一层孢子后待接种霉菌菌剂制备培养基。；

霉菌菌剂制备培养基制备方法同实施例1，冷却至室温后的霉菌菌剂制备培养基于无菌操作台上接种400 mL的霉菌——哈茨木霉发酵液，搅拌均匀后封口包装放入28℃的培养箱培养一周，接种后2天搅拌一次，发酵完成后放在阴凉处风干并粉碎至粉末状，得到霉菌——哈茨木霉制剂T41。

实施例5

将冷却至室温的细菌菌剂制备培养基在无菌操作台上接种400 mL的细菌——枯草芽孢杆菌发酵液，搅拌均匀后封口包装放入36℃的培养箱培养24小时，发酵成功后放在阴凉处风干并粉碎至粉末状既得细菌——枯草芽孢杆菌生物制剂T51。

实施例6

将制备的霉菌——黑曲霉制剂T21和细菌——枯草芽孢杆菌制剂T51按2:1之重量份混合均匀，得到生物制剂T61。

实施例7

将制备的霉菌——康宁木霉制剂T11和霉菌——黑曲霉制剂T21按1:1之重量份混合均匀，得到生物制剂T71。

实施例8

采用实施例5中的方法制备细菌液体培养基。将细菌液体培养基于无菌操作台上接种细菌——多粘类芽孢杆菌，封口包装放入36℃的摇床内培养24小时，得到细菌——多粘类芽孢杆菌发酵液；

采用实施例5中的方法制备细菌菌剂制备培养基。冷却至室温后的细菌菌剂制备培养基于无菌操作台上接种400 mL的细菌——多粘类芽孢杆菌发酵液，搅拌均匀后封口包装放入36℃的培养箱培养24小时，发酵成功后于阴凉处风干并粉碎成粉末状，得到细菌——多粘类芽孢杆菌生物制剂。

将制备的细菌——枯草芽孢杆菌制剂T51和细菌——多粘类芽孢杆菌制剂按1:1之重量份混合均匀，得到生物制剂T81。

实施例9

1、选用连种西瓜4年的温室大棚地块作为试验用地，选用易感病的216蜜宝西瓜苗作为试验对象。

2、将试验地分成小区，每小区面积为30 m²。其中2个小区作为对照地块，不施加任何药剂的的阴性对照CK1，和施加多菌灵药剂的阳性对照CK2；其余8个小区为施加本发明实施例1~8制备的生物制剂T11~ T81。

3、在育苗定植时，阳性对照CK2地块中每株定植穴中施加6 g多菌灵药剂，微生物制剂小区每穴分别施加6 g生物制剂T11、T21、T31、T41、T51、T61、T71、T81，与西瓜苗周围的土壤充分混匀，定植后每两周在西瓜苗根系周围20 cm左右范围内追加一次，用量每株100g，并与土壤充分混匀，共施加两次。

4、实施过程中对照小区和微生物制剂小区采用相同的管理措施。缓苗后，每隔一段时间测量不同处理地块瓜秧的蔓长、茎粗及叶长叶宽，枯萎病发病情况及西瓜品质，生长周期结束时测土壤中主要酶活性和土壤中各大类微生物数量。

5、对照小区和微生物制剂小区各重复三次，每小区种植10株西瓜苗，以发病率的平均数、西瓜生长指标、瓜中可溶性固形物含量、土壤主要酶活性、微生物数量等作为评价防治效果指标。

本发明生物制剂对西瓜枯萎病的防治效果及对西瓜生长、品质的影响见表2-1。

表2-1 施用本发明制剂对西瓜枯萎病防治效果和西瓜品质以及生长的影响

从表2-1可以得出：施加本发明的微生物制剂的各个处理，西瓜防治枯萎病的发病率均低于施加多菌灵药剂的；施加本发明制剂的各个处理的瓜果中可溶性固形物含量高于施加多菌灵药剂，可溶性固形物含量的高低决定着西瓜甜度的高低，西瓜的甜度是西瓜品质的重要指标之一，说明施加本发明制剂能够提高西瓜的品质；从茎粗、根长、株高、蔓长和根系活力来看，均优于施加多菌灵药剂的，说明施加本发明制剂能促进西瓜植株的生长，可以使瓜蔓健壮。

表2-2 使用本发明制剂对西瓜根际土壤中微生物数量的影响 CFU/g 10⁸

由表2-2可以看出：施加本发明制剂对增加西瓜根际微生物细菌、放线菌、酵母菌的数量，减少霉菌的数量，比施加多菌灵药剂效果好。土壤中细菌、放线菌和酵母菌有利于丰富土壤有益菌群的数量，而霉菌多为致病菌。通过施加本发明的制剂，能有效减少霉菌数量和增加细菌、放线菌及酵母菌数量，从而使土壤中有益菌增加，抑制有害菌西瓜枯萎病病原菌的存活而起到预防西瓜枯萎病的发生作用。

表2-3 施加本发明微生物制剂对土壤理化指标的影响

根据表2-3可以看出：施加本发明制剂对于增加土壤中各种酶活性以及有机质的含量，各项指标均高于施加多菌灵药剂的。

综上所述：施加本发明实施例1-8制备的微生物生物制剂的小区在抑制西瓜枯萎病方面效果都优于施加多菌灵地块。

从上述指标（表2-1、2-2、2-3）对比可以看出，本发明的微生物制剂能预防西瓜枯萎病病害、改善土壤微生物菌群，抑制土壤病原菌的繁殖，对作物的根腐、立枯等病害也能发挥有效的作用，同时在提高土壤活力、活化土壤有机与无机养分、提高肥效、促进土壤营养循环、长效吸收利用、增根壮苗，提高果实质量等方面也有帮助。

Claims

1.一种农用微生物制剂，其特征在于：包括霉菌制剂或/和细菌制剂，其中：

霉菌制剂的配制方法为：

第二步，取第一步配制的液体培养基在无菌操作台上按8.33×10²-1.25×10³个/mL的接种量接种一接种环的霉菌孢子，封口包装后放入28℃摇床内培养4天，得到霉菌发酵液，继续放置5天，使液面形成一层孢子后待用；

第四步，将第三步制备的霉菌菌剂制备培养基中加入第二步制备的霉菌发酵液20份，接种后搅拌均匀，封口放入28℃培养箱中培养一周，接种后2天搅拌一次，待发酵完成后放在阴凉处风干，之后粉碎成粉末状，得到成品霉菌制剂；

细菌制剂的配制方法为：

第四步，将第三步制备的细菌菌剂制备培养基中加入第二步制备的细菌发酵液20份，搅拌均匀后封口放入36℃培养箱中培养24h，发酵成功后放在阴凉处风干，粉粹形成粉末状，得到成品细菌制剂。

2.根据权利要求1所述的农用微生物制剂，其特征在于：所述霉菌为淡紫拟青霉，米曲霉，康宁木霉，哈茨木霉，球孢白僵菌，绿色木霉,黑曲霉菌；所述细菌为枯草芽孢杆菌，荧光假单胞菌，多粘类芽孢杆菌。

3.根据权利要求1所述的农用微生物制剂，其特征在于：所述霉菌制剂和细菌制剂的混合比例为1~2︰1。

4.权利要求1—3中任一项所述的农用微生物制剂在防治瓜类根结线虫方面的应用。

5.权利要求1—3中任一项所述的农用微生物制剂在防治西瓜枯萎病方面的应用。