CN108587946B - 含有枯草芽胞杆菌b2-3-2和枯草芽胞杆菌b19的复合菌剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

一种含有枯草芽胞杆菌B2‑3‑2和枯草芽胞杆菌B19的复合菌剂及其应用，枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)B2‑3‑2，于2017年12月21日保藏于北京中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.15114，枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)B19，于2017年12月21日保藏于北京中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.15113，复合菌剂以液体或固体型式按常规方法混合制成，1mL液体复合菌剂中含4.8～5.2×108cfu枯草芽胞杆菌B2‑3‑2、含4.8～5.2×108cfu枯草芽胞杆菌B19；1g固体复合菌剂中含2.48～2.52×109cfu枯草芽胞杆菌B2‑3‑2、含2.48～2.52×109cfu枯草芽胞杆菌B19。

Description

含有枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19的复合菌剂及 其应用
技术领域
本发明属于微生物肥料技术领域，具体涉及到枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19复合菌剂。
背景技术
随着可耕土地减少和设施栽培的发展，作物连作不可避免。但随之而来的连作障碍造成作物大面积减产甚至绝收。土传真菌病害和根结线虫危害是作物连作障碍的重要原因，生物防治在控制植物土传真菌病害和根结线虫危害方面具有重大的潜力。
微生物肥料简称菌肥，是指含有特定微生物活体的制品，应用于农业生产，通过其中所含微生物的生命活动，增加植物养分的供应量或促进植物生长，提高产量，改善农产品品质及农业生态环境。
微生物肥料包括微生物菌剂(即微生物接种剂)、生物有机肥和复合微生物肥料。过量施用化肥对土壤物理、化学及生物的变化、对地下水、农产品品质带来的问题已引起人们极大的关注。作物连作及解决连作障碍需要微生物肥料，农产品质量安全也需要微生物肥料，增施有机肥、菌肥已成为人们的共识。
微生物肥料可以增加土壤养分，改变土壤养分的存在状态利于作物吸收，产生多种活性物质促进作物生长，增强作物的抗病、抗虫和抗旱能力，土壤环境净化和土壤修复，参与土壤有机物降解、促进秸秆腐熟，改善农产品品质，提高农产品产量。
多菌种复合是当今菌肥领域广泛采用的技术。不同的菌种有不同的功能，不同功能的菌种复合，功能可以互补，但不是菌种越多越好。多菌种复合要考虑微生物之间的相互关系，生物之间的相互关系有共处、互生、共生、寄生、拮抗、竞争、捕食7种。菌种复合要求菌种之间要共处、互生、共生，不能是寄生、拮抗、竞争、捕食。多菌种复合还要考虑微生物的增代时间(繁殖一代所需要的时间)，相差太大，使用过程中繁殖慢的就丢失了。多菌种复合也要考虑生产设备数量的可行性。
某些细菌生长到后期，在其菌体内形成厚壁，折光性强，具有抗逆性的休眠体称为芽胞。由外到内结构依次为芽胞外壁－芽胞衣－皮层－核心，芽胞核心又分为芽胞壁，芽胞膜，芽胞质，芽胞核区。芽胞不是细菌的繁殖型。芽胞具有极强的抗热，抗辐射，抗化学药物和抗静水压，抗干燥等能力。用芽胞杆菌生产的菌肥产品保质期长，对化肥、农药和除草剂有一定的耐受性。
依据植物病原真菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和南方根结线虫(Meloidogyne incongnita(Kofold&White)Chitwood)与植物、动物及人体在细胞结构及组成方面的差异，以作用于植物病原真菌和南方根结线虫细胞的特异成分为靶位，筛选抗植物病原真菌和根结线虫而对植物、动物及人体安全的芽胞杆菌用做生产微生物肥料的菌种，且这些菌种防病、抗虫效果明显，将具有重要的理论和实际意义。
几丁质是植物病原真菌细胞壁的组成成分，也是根结线虫卵壳的组成成分，研究证实几丁质酶可以破坏南方根结线虫的虫卵，而对其有明显的防治效果。根结线虫二龄幼虫的体壁主要是由各类蛋白质、纤维交联而成，破坏二龄幼虫的体壁也可以杀死根结线虫。因此筛选蛋白酶高酶活菌株用于生物防治具有一定的研究意义。
已经证实产几丁质酶的芽胞杆菌对植物病原真菌和根结线虫都有很好的防治效果。从黄海沿岸海水养殖场淤泥样品中分离到耐盐、耐化肥及抗真菌作用较强的几丁质酶产生菌B2-3-2，经鉴定为枯草芽胞杆菌(Bacillus Subtilis)。产几丁质酶芽胞杆菌B2-3-2的耐盐性和耐化肥性能有正相关性，对尖孢镰刀菌ACCC30373等多种植物病原真菌有明显抑制作用，同时具有抗南方根结线虫活性，对植物种子萌发及幼苗生长安全(陶树兴,王婷婷,徐珊,徐姗娜,苏蕊，黄海沿岸及内陆盐湖几丁质酶产生菌的筛选及特性[J].陕西师范大学学报，2010年4期，73-78页；陶树兴、张娟妮、郭贤、柴霞、魏园媛、冯晓磊，枯草芽胞杆菌2-3-2的抗线虫作用和产酶条件与酶特性[J].陕西师范大学学报，2013年3期，45-49页。
丝氨酸蛋白酶是一类活性中心含有丝氨酸的蛋白酶，在医学方面、工业方面均有应用。近年来，产丝氨酸蛋白酶微生物在植物病原真菌和根结线虫生物防治中的应用引起关注。筛选丝氨酸蛋白酶高酶活菌株，对丰富相关菌种资源、开展基础研究及应用开发都具有重要的理论和实践意义。从多年连作大棚栽培的番茄根际土壤样品中分离到多株蛋白酶产生菌，用丝氨酸蛋白酶的特殊底物Na-苯甲酰-DL-精氨酸-对硝基酰胺盐酸盐(BApNA)和特异性抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)确定产丝氨酸蛋白酶菌株，获得丝氨酸蛋白酶产生菌株B19，PMSF对B19粗酶液的抑制率为91.20％。依据形态特征、生理生化特性和16SrDNA比对分析对菌株进行鉴定，结果菌株B19为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)。枯草芽胞杆菌B19对多种植物病原真菌有显著的抑制作用，它的无菌滤液对南方根结线虫二龄幼虫有较强的杀虫效应。枯草芽胞杆菌B19是一株具有抗植物病原真菌和杀根结线虫双重功效的生防菌株，有重要的应用价值(唐娜,陶树兴,梁健,冯晓磊,户引红,许真珍,熊平，产丝氨酸蛋白酶芽胞杆菌的鉴定及其生防作用[J].陕西师范大学学报(自然科学版)，2016年1期，81-86页)。
已有的研究表明，土传真菌病害与根结线虫危害常常相伴发生且相互影响导致病害的加重(张绍升.植物线虫病害诊断与治理[M].福州:福建省科学技术出版社,1999:67-97)，单一防治真菌病害或根结线虫在实际生产中效果并不理想。
枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19单独作为农用微生物菌剂的效果已有报道(陶树兴,王婷婷,徐珊,徐姗娜,苏蕊，黄海沿岸及内陆盐湖几丁质酶产生菌的筛选及特性[J].陕西师范大学学报，2010年4期，73-78页；陶树兴、张娟妮、郭贤、柴霞、魏园媛、冯晓磊，枯草芽胞杆菌2-3-2的抗线虫作用和产酶条件与酶特性[J].陕西师范大学学报，2013年3期，45-49页；唐娜,陶树兴,梁健,冯晓磊,户引红,许真珍,熊平，产丝氨酸蛋白酶芽胞杆菌的鉴定及其生防作用[J].陕西师范大学学报(自然科学版)，2016年1期，81-86页)。但这两株枯草芽胞杆菌菌株复合后对植物病原真菌和南方根结线虫的拮抗效果如何，未见报道。
发明人通过实验证实，不同的枯草芽胞杆菌菌株在抗真菌和抗南方根结线虫方面具有功能多样性，有的菌株可以产生抗生素，另一些菌株则可以产生溶解真菌菌丝细胞和破坏线虫虫卵及幼虫体壁的水解酶。产几丁质酶和丝氨酸蛋白酶的菌株分别在农用微生物制剂方面应用已有报道，但在已公开的报道和专利中，尚未发现用产几丁质酶和产丝氨酸蛋白酶的两株枯草芽胞杆菌复合制作农用微生物菌剂及菌肥的报道和专利。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题在于克服上述现有微生物制剂的缺点，提供一种抗尖孢镰刀菌所致作物病害、抗南方根结线虫危害效果显著的含有枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19的复合菌剂。
本发明所要解决的另一个技术问题在于为含有枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19的复合菌剂提供一种抗尖孢镰刀菌所致病害的新用途。
本发明所要解决的还有一个技术问题在于为含有枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19的复合菌剂提供一种抗南方根结线虫危害的新用途。
解决上述技术问题所采用的技术方案是：含有枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19的复合菌剂，枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)B2-3-2，于2017年12月21日保藏于北京中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.15114，枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)B19，于2017年12月21日保藏于北京中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.15113。上述的复合菌剂由枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19以液体或固体型式按常规方法混合制成，在1mL的液体复合菌剂中，含有4.8～5.2×108cfu枯草芽胞杆菌B2-3-2，含有4.8～5.2×108cfu枯草芽胞杆菌B19；在1g的固体复合菌剂中，含有2.48～2.52×109cfu枯草芽胞杆菌B2-3-2，含有2.48～2.52×109cfu枯草芽胞杆菌B19。
枯草芽胞杆菌B2-3-2，在马铃薯汁固体培养基上培养24小时，菌落特征为白色，光滑湿润，圆形且低凸，全缘，直径约为3mm，菌体大小0.5～0.8μm×2.3～2.9μm，短杆状，革兰氏染色为阳性，产芽胞。水解淀粉和明胶，不利用丙酸盐，厌氧条件下不生长，其他结果如表1所示。
表1枯草芽胞杆菌B2-3-2的部分特性
Figure BDA0001621848550000031
Figure BDA0001621848550000041
注：表中+表示阳性，-表示阴性。
枯草芽胞杆菌B2-3-2的16SrDNA碱基序列委托上海生工生物工程技术服务有限公司测定。采用双向测定法测得产枯草芽胞杆菌B2-3-2的16S rDNA序列全长为1511bp，序列如下：
Figure BDA0001621848550000042
枯草芽胞杆菌B19的菌体为杆状，宽0.7～0.8μm，长2～3μm，革兰氏染色为阳性，培养2天后菌体内形成芽胞，芽胞位于菌体的中间或位于菌体的一端，芽胞宽0.6～0.8μm，长1.0～1.5μm。枯草芽胞杆菌B19的生理生化特性见表2。
表2枯草芽胞杆菌B19的部分生理生化特征
Figure BDA0001621848550000043
Figure BDA0001621848550000051
枯草芽胞杆菌B19的16SrDNA碱基序列委托上海生工生物工程技术服务有限公司测定。采用双向测定法测得枯草芽胞杆菌B19的16S rDNA序列全长为1432bp，序列如下：
Figure BDA0001621848550000052
本发明的复合菌剂由枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19以液体或固体型式按常规方法混合制成，在1mL的液体复合菌剂中，优选含有4.9～5.1×108cfu枯草芽胞杆菌B2-3-2，含有4.9～5.1×108cfu枯草芽胞杆菌B19，在1g的固体复合菌剂中，优选含有2.49～2.51×109cfu枯草芽胞杆菌B2-3-2，2.49～2.51×109cfu枯草芽胞杆菌B19。
含有枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19的复合菌剂在抗尖孢镰刀菌所致作物病害中的用途。
含有枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19的复合菌剂在抗南方根结线虫危害中的用途。
本发明采用将枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19两株枯草芽胞杆菌单独培养，混合制成复合微生物液体或固体菌剂，在实验室和大田进行了与单菌株、抗尖孢镰刀菌和抗南方根结线虫对比实验，实验结果表明，将枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19混合成复合菌剂，对尖孢镰刀菌和南方根结线虫的拮抗作用都比单一菌株显著增强。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1
本实施例的含有枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19的复合菌剂，枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)B2-3-2，于2017年12月21日保藏于北京中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.15114，枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)B19，于2017年12月21日保藏于北京中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.15113。该复合菌剂由枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19以液体型式按常规方法制成，在1mL的液体复合菌剂中，含有4.8～5.2×108cfu枯草芽胞杆菌B2-3-2，含有4.8～5.2×108cfu枯草芽胞杆菌B19。在1mL的液体复合菌剂中，优选含有4.9～5.1×108cfu枯草芽胞杆菌B2-3-2，含有4.9～5.1×108cfu枯草芽胞杆菌B19。
以生产1000L枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19液体复合菌剂为例，其制备方法如下：
1、制备斜面菌种
称取牛肉膏0.3g、蛋白胨1g、氯化钠0.5g、溶于100mL蒸馏水，加热至沸腾，加入琼脂2g，加热使琼脂完全融化，定容，用10％氢氧化钠溶液调节pH为7.2～7.5，分装直径为18mm、高度为180mm的试管，装量为试管高度的1/5，加绵塞，包扎，121℃灭菌25分钟，放置斜面，制成斜面培养基。按无菌操作取1环枯草芽胞杆菌B2-3-2接入斜面培养基，置于培养箱中，28℃、培养3天，形态典型，无杂菌，无噬菌体，制备成枯草芽胞杆菌B2-3-2斜面菌种。按相同的方法操作，制备成枯草芽胞杆菌B19斜面菌种。
2、制备摇瓶菌种
将马铃薯去皮，称1000g切成小块，放入蒸馏水中煮沸30分钟，过滤，定容，制成20％土豆汁5000mL，加入蔗糖100g，磷酸氢二钾10g，硫酸镁5g，维生素B1 50mg，加热，加蒸馏水定容至5000mL，用10％氢氧化钠溶液调节pH为7.2～7.5，分装500mL三角瓶，每瓶100mL，8层纱布扎口，121℃灭菌30分钟，制备成马铃薯汁液体培养基。将枯草芽胞杆菌B2-3-2斜面菌种每支用9mL无菌水洗下，取1mL接入三角瓶马铃薯汁液体培养基中，置于振荡培养箱中，28℃、168r/min振荡培养12小时，形态典型，无杂菌，无噬菌体，制备成枯草芽胞杆菌B2-3-2摇瓶菌种，转移至灭过菌的接种瓶中备用。按相同的方法操作，制备成枯草芽胞杆菌B19摇瓶菌种，转移至灭过菌的接种瓶中备用。
3、种子罐扩大培养
在种子罐中加水65L，加入玉米粉1.6kg、蔗糖0.25kg、豆饼粉1.3kg、磷酸氢二钾0.13kg、硫酸镁0.02kg、碳酸钙0.2kg、酵母膏0.13kg，用氢氧化钠调节pH为7.3～7.5，加豆油0.25L，121℃灭菌30min，冷却至30℃，接入枯草芽胞杆菌B2-3-2摇瓶菌种3L，28℃、罐压0.05Mpa、通入空气，发酵液与空气的体积比为1：0.8，搅拌，培养8～12小时，形态典型，无杂菌，无噬菌体，制备成枯草芽胞杆菌B2-3-2种子液。按相同的方法操作，制备成枯草芽胞杆菌B19种子液。
4、制备发酵液
在发酵罐中，加入水500L、豆饼粉6kg、玉米粉1.3kg、红糖1.3kg、磷酸氢二钾0.65kg、硫酸镁0.07kg、碳酸钙0.35kg、酵母膏0.35kg、硫酸锰10g，用氢氧化钠调节pH为7.3～7.5，加入豆油1L，121℃灭菌30分钟，冷却至30℃，接入50L枯草芽胞杆菌B2-3-2种子液，在28℃、罐压0.05Mpa、通入空气，发酵液与空气的体积比为1：0.9，搅拌，培养时间48-60小时，形态典型、无噬菌体、有效活菌数≥10亿cfu/mL，杂菌率≤10％，制备成枯草芽胞杆菌B2-3-2发酵液。按相同的方法操作，制备成枯草芽胞杆菌B19发酵液。
5、制备液体复合菌剂
测定枯草芽胞杆菌B2-3-2发酵液和枯草芽胞杆菌B19发酵液的活菌数，有效活菌数≥10亿cfu/mL，将枯草芽胞杆菌B2-3-2发酵液和枯草芽胞杆菌B19发酵液混合，加无菌水至1000L，使得在1mL的发酵液中含有4.9～5.1×108cfu枯草芽胞杆菌B2-3-2，含有4.9～5.1×108cfu枯草芽胞杆菌B19，制备成液体复合菌剂，将液体复合菌剂分装入1000mL的塑料瓶中，加入液体石蜡封住液面，加封口膜热封，将瓶盖旋紧，贴标，经检验，产品质量指标应符合国家标准GB20287-2006农用微生物菌剂的规定，制备成液体复合菌剂。所制备的液体复合菌剂按照国家农用微生物菌剂GB20287-2006技术指标进行了测试，结果见表3。
表3枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19的液体复合菌剂检测结果
序号 项目 GB20287-2006技术指标 检测结果
1 有效活菌数(cfu)，亿/g(mL) ≥ 2.0 10.0
2 霉菌杂菌数，个/g(mL) ≤ 3.0×10<sup>6</sup> 1.0×10<sup>3</sup>
3 杂菌率(％) ≤ 10.0 3.0
4 水分(％) ≤ - -
5 细度(％) ≥ - -
6 pH值 5.0～8.0 6.8
7 保质期(月) ≥ 3 12
由表3可见，枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19液体复合菌剂中有效活菌数(cfu)是国家农用微生物菌剂技术指标的5倍。
所制备的枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19液体复合菌剂按照国家农用微生物菌剂GB20287-2006无害化指标进行了测试，测试结果见表4。
表4枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19液体复合菌剂的无害化指标测试结果
无害化检测项目 GB20287-2006技术指标 检测结果
粪大肠菌群数，个/g(mL) ≤ 100 无
蛔虫卵死亡率，％ ≥ 95 100
砷及其化合物(以As计)，mg/kg ≤ 75 6
镉及其化合物(以Cd计)，mg/kg ≤ 10 0.8
铅及其化合物(以Pb计)，mg/kg ≤ 100 1.3
铬及其化合物(以Cr计)，mg/kg ≤ 150 11
汞及其化合物(以Hg计)，mg/kg ≤ 5 0.05
由表4可见，枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19的液体复合菌剂中，无害化指标远低于国家农用微生物菌剂标准规定。
实施例2
本实施例的含有枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19的复合菌剂，由枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19以固体型式按常规方法混合制成，在1g的固体复合菌剂中，含有2.48～2.52×109cfu枯草芽胞杆菌B2-3-2，含有2.48～2.52×109cfu枯草芽胞杆菌B19。在1g的固体复合菌剂中，优选含有2.49～2.51×109cfu枯草芽胞杆菌B2-3-2，2.49～2.51×109cfu枯草芽胞杆菌B19。
以生产1000kg枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19固体复合菌剂为例，其制备方法如下：
1、制备斜面菌种
称取牛肉膏0.3g、蛋白胨1g、氯化钠0.5g，溶于100mL蒸馏水中，加热至沸腾，加入琼脂2g，加热使琼脂完全融化，定容，用10％氢氧化钠溶液调节pH为7.2～7.5，分装直径为18mm、高度为180mm的试管，装量为试管高度的1/5，加绵塞，包扎，121℃灭菌25分钟，放置斜面，制成斜面培养基。按无菌操作取1环枯草芽胞杆菌B2-3-2接入斜面培养基，28℃、培养3天，形态典型，无杂菌，无噬菌体，制备成枯草芽胞杆菌B2-3-2斜面菌种。按相同的方法操作，制备成枯草芽胞杆菌B19斜面菌种。
2、制备摇瓶菌种
将马铃薯去皮，称100g切成小块放入蒸馏水中煮沸30分钟，过滤，定容，制成20％马铃薯汁500mL，加入蔗糖10g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，维生素B1 5mg，加热，加蒸馏水定容至500mL，用10％氢氧化钠溶液调节pH为7.2～7.5，分装500mL三角瓶，每瓶100mL，8层纱布扎口，121℃灭菌30分钟。将斜面菌种用9mL无菌水洗下，取1mL接入三角瓶培养基中，于28℃,168rpm振荡培养12小时，形态典型，无杂菌，无噬菌体，制备成枯草芽胞杆菌B2-3-2摇瓶菌种，备用。按相同的方法操作，制备成枯草芽胞杆菌B19摇瓶菌种，备用。
3、制备浅盘菌种
称取麸皮5kg、豆饼粉2kg、花生壳粉2kg、玉米粉1kg混匀成混合物，将蔗糖0.1kg、磷酸氢二钾0.01kg、硫酸镁0.005kg用水溶解后加入混合物中，用氢氧化钠调节pH为7.2～7.5，分装到聚丙烯塑料袋中，每袋800g，扎紧袋口，121℃灭菌40分钟，在无菌室内将已灭菌的培养料倒入已灭菌的长48cm、宽42cm、高5cm的搪瓷盘中，打散，按接种量为2％接入枯草芽胞杆菌B2-3-2摇瓶菌种，盖两层灭菌后的湿纱布，置于培养箱中，28℃培养72小时，制成枯草芽胞杆菌B2-3-2浅盘菌种。按相同的方法操作，制备成枯草芽胞杆菌B19浅盘菌种。
4、厚层通风发酵
将麸皮300kg、豆饼粉100kg、花生壳粉100kg加入旋转蒸煮锅中，混匀成混合物，再将蔗糖5kg、磷酸氢二钾0.5kg、硫酸镁0.25kg用水溶解后加入混合物中，用氢氧化钠调节pH为7.2～7.5，121℃灭菌30分钟，冷至60℃，按接种量1.5％接入枯草芽胞杆菌B2-3-2浅盘菌种，旋转蒸煮锅使混匀，将物料转入发酵池中，28℃通风发酵72小时，热风吹干或者气流干燥使水分≤10％制备成枯草芽胞杆菌B2-3-2的固体发酵物。按相同的方法操作，制备成枯草芽胞杆菌B19的固体发酵物。
5、制备固体复合菌剂
测定枯草芽胞杆菌B2-3-2固体发酵物和枯草芽胞杆菌B19固体发酵物的活菌数，用灭菌烘干的培养基调节有效活菌数≥50亿cfu/g，使得在1g的固体发酵物中含有2.48～2.52×109cfu枯草芽胞杆菌B2-3-2，1g的固体发酵物中含有2.48～2.52×109cfu枯草芽胞杆菌B19，称取500kg枯草芽胞杆菌B2-3-2固体发酵物和500kg枯草芽胞杆菌B19固体发酵物混合，粉碎过120目筛，分装入塑料袋内，密封，经检验，产品质量指标应符合国家标准GB20287-2006农用微生物菌剂的规定，制备成固体复合菌剂。所制备枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19固体复合菌剂按照国家农用微生物菌剂GB20287-2006技术指标进行了测试，结果见表5。
表5枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19固体复合菌剂检测结果
序号 项目 GB20287-2006技术指标 检测结果
1 有效活菌数(cfu)，亿/g(mL) ≥ 2.0 50.0
2 霉菌杂菌数，个/g(mL) ≤ 3.0×10<sup>6</sup> 2.0×10<sup>5</sup>
3 杂菌率，％ ≤ 20.0 12.0
4 水分，％ ≤ 35.0 9.6
5 细度，％ ≥ 80 95
6 pH值 5.5～8.5 7.0
7 保质期，月 ≥ 6 18
所制备的枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19的固体复合菌剂按照国家农用微生物菌剂GB20287-2006无害化指标进行了测试，测试结果见表4。无害化指标远低于标准规定。无害化指标见表6。
表6枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19的固体复合菌剂的无害化指标测试结果
Figure BDA0001621848550000091
Figure BDA0001621848550000101
由表6可见，枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19的固体复合菌剂中的无害化指标远低于国家标准规定。
实施例3
实施例1的含有枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19的液体复合菌剂和实施例2的含有枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19的固体复合菌剂用于抗尖孢镰刀菌所致作物病害。
使用时将含有枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19的液体复合菌剂2L加入500L水中，在667m2(1亩)蔬菜地的蔬菜根部浇施，也可采用将含有枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19的液体复合菌剂2L加入2000L水中，采用滴灌的方法在蔬菜的根部滴入。将含有枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19的固体复合菌剂2kg加入500L水中，在667m2(1亩)蔬菜地的蔬菜根部浇施，也可采用将含有枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19的固体复合菌剂2kg加入2000L水中，采用滴灌的方法在蔬菜的根部滴入。
实施例4
实施例1的含有枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19的液体复合菌剂和实施例2的含有枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19的固体复合菌剂用于抗南方根结线虫危害。
使用时将含有枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19的液体复合菌剂2L加入500L水中，在667m2(1亩)蔬菜地的蔬菜根部浇施，也可采用将含有枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19的液体复合菌剂2L加入2000L水中，采用滴灌的方法在蔬菜的根部滴入。将含有枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19的固体复合菌剂2kg加入500L水中，在667m2(1亩)蔬菜地的蔬菜根部浇施，也可采用将含有枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19的固体复合菌剂2kg加入2000L水中，采用滴灌的方法在蔬菜的根部滴入。
为了验证本发明的有益效果，发明人采用实施例1的含有枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19的液体复合菌剂，进行了实验室效果实验以及液体复合菌剂和固体复合菌剂的大田试用实验，数据分析采用SPSS-17.0软件进行方差分析。各种试验情况如下：
1、枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19的组合实验
实验材料：牛肉浸膏、蛋白胨、琼脂，北京双旋微生物培养基制品厂生产；蔗糖：分析纯，湘中地质实验研究所；浓盐酸，分析纯，西安化学试剂厂生产。其它试剂：NaCl，CaCO3，MgSO4·7H2O，KH2PO4，K2HPO4,均为国产分析纯试剂。
实验仪器：BL-50A型立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂生产；101A-2型电热鼓风干燥箱，上海实验仪器厂有限公司生产；SW-CJ-1CU型超净工作台，苏净集团安泰公司生产；SPX-250B-D型恒温培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂生产；SPX-250B-D振荡培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂生产；TU-1810紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司生产；BP221S型电子天平，德国Sartorius AG公司生产；HH-8B型数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司生产；HR1型全自动菌落分析仪，杭州讯数科技有限公司生产；5415R台式冷冻高速离心机，德国Eppendorf公司生产；E600型NikonECLIPSE相差显微镜、SZX-ILLK200型解剖显微镜，日本Nikon公司生产；镀铬游标卡尺,0-125mm×0.02，西安工具厂制造；通风橱,北京希玛欧美佳实验设备有限公司生产；0.22μm微孔滤膜,迈博瑞生物膜技术有限公司生产；牛津杯(Φ6×7.8×10mm),上海东方药品科技实业有限公司生产；96孔板，USA costar生产。
实验菌株：枯草芽胞杆菌B2-3-2(菌株保藏号CGMCC No.15114)：从黄海沿岸海水养殖场底泥样品中分离获得的几丁质酶产生菌，耐盐、耐化肥，抗真菌作用较强，对南方根结线虫也有拮抗作用。枯草芽胞杆菌B19(菌株保藏号CGMCC No.15113)：从多年连作大棚栽培的番茄根际土壤中分离获得的丝氨酸蛋白酶产生菌，对多种植物病原真菌有显著的抑制作用，它的无菌滤液对南方根结线虫二龄幼虫有杀虫效应。
尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)ACCC30373,购于中国农业微生物菌种保藏管理中心，南方根结线虫(Meloidogyne incongnita(Kofold&White)Chitwood)2龄幼虫：由中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供。
培养基：枯草芽胞杆菌的斜面培养基用牛肉膏蛋白胨培养基，枯草芽胞杆菌对尖孢镰刀菌的抑制作用和抗南方根结线虫作用测定用马铃薯汁培养基，两种培养基用常规方法配制。
(1)枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19的拮抗实验
平板法：在牛肉膏蛋白胨琼脂平板的左侧划竖线，接种一株枯草芽胞杆菌B2-3-2，在紧邻竖线处向右划横线接种枯草芽胞杆菌B19，28℃培养3天，观察两菌株有无拮抗区。结果显示，两菌株的菌苔完全融合，两个菌株之间无拮抗作用。
杯碟法：将枯草芽胞杆菌B2-3-2、枯草芽胞杆菌B19分别接入牛肉膏蛋白胨液体培养基(牛肉膏蛋白胨培养基中不加琼脂)中，置于振荡培养箱中，28℃、168r/min振荡培养72小时，8000r/min离心10分钟，除去菌体，取上清液分别用灭过菌的0.22μm微孔滤膜过滤，得两个菌株的无菌滤液。在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上加入100μL枯草芽胞杆菌B2-3-2悬液，涂布均匀制成待测平板，在每个平板上等距离放置4个无菌牛津杯，取枯草芽胞杆菌B19的无菌滤液200μL注入杯内；在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上加入100μL枯草芽胞杆菌B19悬液，涂布均匀制成待测平板，在每个平板上等距离放置4个无菌牛津杯，取枯草芽胞杆菌B2-3-2的无菌滤液200μL注入杯内。28℃培养24小时，观察有无抑菌区。结果平板上无抑菌圈，枯草芽胞杆菌B2-3-2与枯草芽胞杆菌B19两个菌株之间无拮抗作用。
(2)枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19及其混合物对尖孢镰刀菌的抑菌作用
将枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19制备成无菌滤液，制备方法与实验(1)相同，得两个菌株的无菌滤液。将培养好的枯草芽胞杆菌B2-3-2(实验时简称B2-3-2)和枯草芽胞杆菌B19(实验时简称B19)，活菌计数，用灭菌培养基调节菌数为9.8～10.2×108cfu/mL的枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19，混合成4.9～5.1×108cfu/mL B2-3-2与4.9～5.1×108cfu/mL B19、6.53～6.80×108cfu/mL B2-3-2与3.27～3.40×108cfu/mLB19、3.27～3.40×108cfu/mL B2-3-2与6.53～6.80×108cfu/mL B19，将混合菌液经8000r/min离心10分钟，除去菌体，取上清液分别用灭过菌的0.22μm微孔滤膜过滤，得枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19混合滤液。
将培养好的尖孢镰刀菌的斜面菌种用9mL灭菌纯水洗下孢子，制成孢子悬液，在马铃薯汁培养基平板上分别加入100μL孢子悬液，涂布均匀制成待测平板，在每个平板上等距离放置4个无菌牛津杯，取200μL无菌滤液注入杯内。置于培养箱28℃培养3天，测量抑菌圈大小。测定枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19及其混合滤液对尖孢镰刀菌的抑菌作用，并用SPSS-17.0软件进行方差分析。实验结果见表7。表7中同列相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。
表7两株枯草芽胞杆菌及其混合物对尖孢镰刀菌的抑菌作用
Figure BDA0001621848550000121
注：表中SE为均数标准误。
由表7可见，枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19菌株的混合菌液比单一菌株抗真菌活性要高，混合成4.9～5.1×108cfu/mL枯草芽胞杆菌B2-3-2与4.9～5.1×108cfu/mL枯草芽胞杆菌B19，抗尖孢镰刀菌的活性差异极显著。
(3)枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19及其混合物对南方根结线虫的拮抗作用
按实验(2)的方法制备枯草芽胞杆菌B2-3-2无菌滤液、枯草芽胞杆菌B19无菌滤液、枯草芽胞杆菌B2-3-2与枯草芽胞杆菌B19的混合无菌滤液，用96孔板在每孔加入10μL南方根结线虫二龄幼虫悬液，再分别加入190μL三种无菌滤液，置培养箱，28℃孵育16小时，观察南方根结线虫二龄幼虫存活情况，拍照，统计死亡率。校正死亡率(％)＝(处理组死亡率—对照组死亡率)/(1－对照组死亡率)×100％。统计枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19及其混合滤液对南方根结线虫二龄幼虫的杀虫作用，并用SPSS-17.0软件进行方差分析。实验结果见表8。表8中同列相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。
表8两株枯草芽胞杆菌及其混合物对南方根结线虫的拮抗作用
Figure BDA0001621848550000131
由表8可见，枯草芽胞杆菌B2-3-2与枯草芽胞杆菌B19的混合无菌滤液比单个菌株的抗虫活性显著提高。混合成4.9～5.1×108cfu/mL枯草芽胞杆菌B2-3-2与4.9～5.1×108cfu/mL枯草芽胞杆菌B19，抗南方根结线虫的活性差异极显著。
2、含有枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19的液体复合菌剂在大棚番茄试用
2017年3月10日在陕西省泾阳县云阳镇大李村的日光大棚进行了田间实验。实验土壤为垆土，肥力较高，经测定，土壤中有机质为14.5mg/Kg，碱解氮为79mg/Kg，速效磷为24.1mg/Kg，速效钾为183mg/Kg。
番茄品种为金牌国萃(陕西大唐种业有限公司)。
依据《微生物肥料田间试验技术规程及肥效评价指南(NY/T 1536-2007)》进行试验，实验小区面积为15m2，每个处理设3次重复。各个处理除施菌剂不同外，其余管理措施一致。
常规施肥为：每实验小区施腐熟有机肥45Kg做底肥，磷酸氢二铵2.25Kg、硫酸钾1.8Kg用于冲施。空白对照只冲水不施肥。在每实验小区移栽90株番茄苗，移栽第7天浇水一次，每株500mL，每小区用水45L，移栽第60天、80天、100天各浇肥一次，共浇3次，每次浇肥每小区用磷酸氢二铵0.75Kg、硫酸钾0.6Kg、兑水100L，浇于番茄根部。
含有枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19的液体复合菌剂为：移栽第25天每小区用含有枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19的液体复合菌剂20mL兑水45L浇入番茄苗的根部，每株浇500mL，番茄苗移栽第80天，每小区用含有枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19的液体复合菌剂25mL兑水45L浇入番茄苗的根部，每株浇500mL。
基质对照为：含有枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19的液体复合菌剂经121℃灭菌90分钟，平板培养无活菌，用量和浇施时间与含有枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19的液体复合菌剂相同。
试验期间记录尖孢镰刀菌引起的枯萎病病病情指数和南方根结线虫病情指数，计算防治效果。
尖孢镰刀菌引起的枯萎病病情分为4级(尚双华.设施土壤氮素积累条件下番茄枯萎病发生的微生态机制研究[D].沈阳农业大学，2016:38)。
0级：地上、地下部均无症状，维管束不变色；1级：植株下部叶片出现轻微症状，纵剖茎杆维管束1/4以下变色；2级：下部1～2片叶黄化，纵剖茎杆维管束1/4～1/2以下变色；3级：下部1～2片叶枯死，纵剖茎杆维管束1/2～3/4以下变色；4级：整株萎蔫,倒伏或枯死。
南方根结线虫病情分5级(路雪君.湖南蔬菜根结线虫病的发生及抗南方根结线虫，番茄品种的筛选[D].湖南农业大学，2011:16)。
0级:所有的根上都没有根结；1级:1％～10％的根系上有根结；2级:11％～20％的根系上有根结；3级:21％～50％的根系上有根结；4级:51％～80％的根系上有根结；5级:81％～100％的根系上有根结。
病情指数＝[Σ(病级株数×该级代表数值)/(调查总株数×发病最重级的代表数值)]×100
防治效果＝[(对照病情指数－处理病情指数)/对照区病情指数]×100％
于2017年5月18日开始采收，7月5日采收完毕，统计产量，数据处理采用SPSS-17.0软件进行方差分析，试验结果及方差分析见表9。
表9含有枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19的液体复合菌剂田间试验结果
Figure BDA0001621848550000141
由表9可见，含有枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19的液体复合菌剂用于尖孢镰刀菌所致枯萎病防治效果、南方根结线虫防治效果以及番茄产量，混合成4.9～5.1×108cfu/mL B2-3-2与4.9～5.1×108cfu/mL B19结合常规施肥，优于9.8～10.2×108cfu/mLB2-3-2结合常规施肥，优于9.8～10.2×108cfu/mL B19结合常规施肥。
3、含有枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19的固体复合菌剂在大棚番茄试用
实验时间和地点与液体复合菌剂相同，经测定，土壤中有机质为14.3mg/Kg，碱解氮为78mg/Kg，速效磷为23.1mg/Kg，速效钾为181mg/Kg。
番茄品种、实验小区面积和重复数、每实验小区移栽番茄苗数量、常规施肥和浇水、空白对照、采收时间、试验期间尖孢镰刀菌所致枯萎病和南方根结线虫病情指数的记录方法、数据处理与实验2液体复合菌剂在大棚番茄试用相同。
番茄苗移栽第25天，浇施含有枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19的固体复合菌剂，每小区用含有枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19的固体复合菌剂20g兑水45L浇入番茄苗的根部，每株浇500mL，番茄苗移栽第80天，每小区用含有枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19固体复合菌剂25g兑水45L浇入番茄苗的根部，每株浇500mL。
基质对照为含有枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19固体复合菌剂经121℃灭菌90分钟，平板培养无活菌，用量和浇施时间与固体菌剂相同。于2017年5月18日开始采收，7月5日采收完毕。试验结果及方差分析见表10。
表10含有枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19固体复合菌剂田间试验结果
Figure BDA0001621848550000151
由表10可见，含有枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19固体复合菌剂用于尖孢镰刀菌所致枯萎病防治效果、南方根结线虫防治效果以及番茄产量，混合成2.49～2.51×109cfu/g B2-3-2与2.49～2.51×109cfu/g B19结合常规施肥，优于4.98～5.02×109cfu/g B2-3-2结合常规施肥，优于4.98～5.02×109cfu/g B19结合常规施肥。
序列表
<110> 西安德龙生物科技有限公司
<120> 含有枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19的复合菌剂及其应用
<141> 2018-04-09
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1511
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis
<400> 1
agagtttgat catggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60
ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa 120
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aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg 840
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tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt 1380
tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt 1440
gaggtaacct tttaggagcc agccgccgaa ggtgggacag atgattgggg tgaagtcgta 1500
acaaggtaac c 1511
<210> 2
<211> 1432
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis
<400> 2
ataatgcaag tcgagcggac agatgggagc ttgctccctg atgttagcgg cggacgggtg 60
agtaacacgt gggtaacctg cctgtaagac tgggataact ccgggaaacc ggggctaata 120
ccggatggtt gtttgaaccg catggttcaa acataaaagg tggcttcggc taccacttac 180
agatggaccc gcggcgcatt agctagttgg tgaggtaacg gctcaccaag gcaacgatgc 240
tagccgacct gagagggtga tcggccacac tgggactgag acacggccca gactcctacg 300
gaggcagcag tagggaatct tccgcaatgg acgaaagtct gacggagcaa cgccgcgtgg 360
agtgatgaag gttttcggat cgtaaagctc tgttgttagg gaagaacaag taccgttcga 420
atagggcggt accttgacgg tacctaacca gaaagccacg gctaactacg tgccagcagc 480
cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc cggaattatt gggcgtaaag ggctcgcagg 540
cggtttctta agtctgatgt gaaagccccc ggctcaaccg gggagggtca ttggaaactg 600
gggaacttga gtgcagaaga ggagagtgga attccacgtg tagcggtgaa atgcgtagag 660
atgtggagga acaccagtgg cgaaggcgac tctctggtct gtaactgacg ctgaggagcg 720
aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatgagtg 780
ctaagtgtta gggggtttcc gccccttagt gctgcagcta acgcattaag cactccgcct 840
ggggagtacg gtcgcaagac tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcgggc 900
tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt gacatcctct 960
acaatcctag agataggacg tccccttcgg gggcagagtg acaggtggtg catggttgcc 1020
ggtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaaa cttgatctta 1080
attgccagca ttcagttggg cactctaagg tgactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg 1140
ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg acctgggcta cacacgtgct acaatggaca 1200
gaacaaaggg cagcgaaacc gcgaggttaa gccaatccca caaatctgtt ctcagttcgg 1260
tcgcagtctg caactcgact gcgtgaagct ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc 1320
gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccacgag agtttgtaac 1380
acccgaagtc ggtgaggtaa ccttttagga gccagccgcc gaagggggac ga 1432

Claims (3)

1.一种含有枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19的复合菌剂，枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)B2-3-2，于2017年12月21日保藏于北京中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.15114，枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)B19，于2017年12月21日保藏于北京中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.15113，其特征在于：所述的复合菌剂由枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19以液体或固体型式按常规方法混合制成，在1mL的液体复合菌剂中，含有4.9~5.1×108cfu枯草芽胞杆菌B2-3-2，含有4.9~5.1×108cfu枯草芽胞杆菌B19；在1g的固体复合菌剂中，含有2.49~2.51×109cfu枯草芽胞杆菌B2-3-2，含有2.49~2.51×109cfu枯草芽胞杆菌B19。
2.权利要求1所述的含有枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19的复合菌剂在抗尖孢镰刀菌所致作物病害中的用途。
3.权利要求1所述的含有枯草芽胞杆菌B2-3-2和枯草芽胞杆菌B19的复合菌剂在抗南方根结线虫危害中的用途。
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