CN102964178A - 一种复合微生物杀菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种复合微生物杀菌剂及其制备方法和应用。所述的复合微生物杀菌剂按重量份计由复合菌剂10-20份、营养成分10-20份、酶活物质4-6份及杀菌剂载体54-78份组成。所述复合菌剂中含有生防促生菌和蛋白分解菌，所述生防促生菌为哈茨木霉、绿色木霉和地衣芽孢杆菌；所述蛋白分解菌为枯草芽孢杆菌。本发明还提供一种上述复合微生物杀菌剂的制备方法。本发明提供的复合微生物杀菌剂能迅速在植物根围定植生长并形成“保护罩”，以防止根部病原真菌的侵染，并在与病原菌互作和重寄生过程中产生抗生素和植物生长等物质，能显著预防、拮抗或直接杀死农作物多种病害，同时具有促根催芽作用，促进农作物健康生长，从而提高产量，改善品质。
Description
技术领域
本发明属农业微生物应用领域，具体涉及一种复合微生物杀菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
目前农业生产中，随着作物的长期重茬连作，土壤病菌长期积累，土传病害严重发生，加之化学农药、化肥的不当使用，导致土壤板结和盐碱化严重，农产品的产量大幅下降，甚至绝收，品质差，价格低，对农民影响很大。因此，如何发展和正确使用生物杀菌剂是发展有机、绿色农业的首选课题。
现有技术公开了多种微生物杀菌剂，如：
中国申请200910016337.0公开了一种哈茨木霉类复合菌培养物及其在植保方面的应用,该申请所提供的哈茨木霉MDCGTH 18复合菌培养物是利用拮抗性微生物进行生物防治,同时又具有诱导植物抗病性及增产功能,对山杨根腐病、苹果轮纹病、柑橘黄龙病、西瓜枯萎病、烟草青枯病、小麦赤霉病、全蚀病、根腐病、纹枯病、黄瓜白粉病、霜霉病、蔬菜灰霉病、枯萎病等多种疫病具有一定的防治效果。然而实际应用过程中发现，单独使用哈慈木霉菌作为防治因子防治植物病害时,容易受到自然环境条件因素的干扰,造成田间防治效果不理想、不稳定。
此外，本领域技术人员知道，生防菌与化学药剂混用,并非完全具有叠加作用。由于土壤生态的复杂性,在菌药互作过程中,化学药剂是否削弱了生防菌的定殖与存活,生防菌对化学药剂是否产生了加速分解作用,都将影响到二者防治效果的发挥,因此只有充分了解土壤、化学药剂、生防菌及病原菌之间的相互关系,才能明确菌药联合防治的作用机理。因此，如何找到一种理想的生防菌与化学药剂的复配方式，是本领域技术人员一直想要解决的技术难题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
为克服现有化学杀菌剂功效单一和长期施用致使病原菌抗性增强的缺点，本发明提供了一种复合微生物杀菌剂，所述复合微生物杀菌剂按重量份计由包括如下组分的原料制备而成：
复合菌剂10-20份；营养成分10-20份；酶活物质2-6份；杀菌剂载体54-78份。优选地，该复合微生物杀菌剂按重量份计由包括如下组分的原料制备而成：复合菌剂15份；营养成分15份；酶活物质4份；杀菌剂载体66份。
所述复合菌剂中主要含有生防促生菌和蛋白分解菌。
所述复合菌剂中的生防促生菌为哈慈木霉、绿色木霉和地衣芽孢杆菌；所述蛋白分解菌为枯草芽孢杆菌；
其中，所述复合菌剂中含有哈茨木霉4.5-7.5×108cfu/g、绿色木霉2-4×108cfu/g、地衣芽孢杆菌1-3×108cfu/g、枯草芽孢杆菌0.5-1.5×108cfu/g；优选为所述复合菌剂中含有哈茨木霉6×108亿cfu/g、绿色木霉3×108cfu/g、地衣芽孢杆菌2×108亿cfu/g、枯草芽孢杆菌1×108cfu/g。
本发明选择的四个菌种分别如下：
①哈茨木霉（Trichoderma harzianum）中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心ACCC 31707；
②绿色木霉（Trichoderma viride）中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心ACCC30552；
③枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心ACCC10118；
④地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心ACCC10618。
本发明的复合微生物杀菌剂，可以用来预防由腐霉菌、立枯丝核菌、镰刀菌、灰葡萄孢菌、黑根霉和柱孢霉等病原菌引起的植物病害。其主要有效成分为哈茨木霉菌，它广泛存在于自然界中。哈茨木霉菌是木霉菌中应用最早最广的一个菌种，哈茨木霉菌对植物根系的缠绕能力和定植能力强，对病害的防治能力强，可以在沙壤土和粘性土壤中良好的定植繁殖，应用更具适应性。本发明的复合微生物杀菌剂主要防治对象是立枯病、猝倒病和根腐病等真菌性根部病害，以及灰霉病等叶部病害。
本发明产品使用方便，适用于各种作物的根系，同时也可以适用于作物叶面及收获储藏期。推荐采用苗床处理，可以采用浸种、蘸根、淋施，也可以随肥水灌溉或单独灌根使用，或者叶面喷雾处理；使用该产品可以避免和减少化学杀菌剂的用量，减少化学药剂对环境的污染，降低病原菌的抗药性，进而降低病害的投入成本，经济环保；在根部使用该产品可以持续3个月以上，在叶部喷施可以持续7-15天，减少用药次数和劳动投入，持效期长。
本发明所述的复合微生物杀菌剂，所述营养成分包括氮、磷、钾养分，以及用腐植酸钾螯合的铁、硼、锌、铜、锰和钼微量元素；优选所述营养成分是将尿素、磷酸二氢钾和硫酸钾以及用腐植酸钾螯合的铁、硼、锌、铜、锰和钼即CTE，按照尿素：磷酸二氢钾：硫酸钾：CTE=2.83:3.27:1.78:10的重量比例混合均匀制得。所述螯合微量元素（Chelated trace elements，缩写为CTE），是按照腐植酸钾（Potassium humate缩写成PHU）：硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)：硫酸铜(CuSO4)：硫酸锰(MnSO4·H2O)：硫酸锌(ZnSO4·7H2O)：硼砂(Na2B4O7·10H2O)=20:1:1:1:1:0.5的重量比例均匀混合制得。
本发明所述的复合微生物杀菌剂，所述酶活物质为蛋白粉和活性酶，所述酶活物质是按照蛋白粉：活性酶为300:1-100:1，优选200:1的比例混合均匀制成。其中，所述的蛋白粉和活性酶可采用现有技术公开的各种可用于复合微生物杀菌剂的蛋白粉和活性酶。作为最佳实施方式，本发明优选蛋白粉由安阳市得天力食品有限责任公司提供的含蛋白质（干基）%≥50，水分%≤9.0，脂肪%≤2.0，细度100目筛上物≤1%的蛋白粉；活性酶即蛋白酶，优选由上海蓝基生物科技有限公司提供的蛋白酶。
本发明所述的复合微生物杀菌剂，所述杀菌剂载体为膨润土和/或海泡石粉。
本发明所述的复合微生物杀菌剂，其中的复合菌剂由包括如下步骤的方法制备得到：
细菌混合孢子粉的制备：
将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的原始菌种在无菌条件下分别依次进行斜面培养、摇床培养、发酵罐培养后，将得到的发酵液按1:3-4:5比例的重量进行混合，经过浓缩干燥制备成细菌混合孢子粉，优选上述两种发酵液的重量比为1:2；
真菌混合孢子粉的制备：
将哈茨木霉、绿色木霉的原始菌种在无菌条件下分别依次进行斜面培养、摇床培养、发酵罐培养、固体发酵产孢后，将得到的完全产孢的培养基分别浸在清水中制成孢子悬浮液，从而得到哈茨木霉孢子悬浮液、绿色木霉孢子悬浮液，然后将得到的哈茨木霉孢子悬浮液、绿色木霉孢子悬浮液分别浓缩干燥制备成真菌孢子粉；然后按照3:2-4:1的重量比混合配制成真菌混合孢子粉，优选上述两种孢子粉的重量比为2:1；
将上述制得的细菌混合孢子粉和真菌混合孢子粉按照1:5-1:2的重量比混合，从而制备得到复合菌剂，优选上述两种孢子粉的重量比为1:3。
作为本发明的一种优选实施方式，所述复合菌剂由包括如下步骤的方法制备得到：
细菌混合孢子粉的制备：
①斜面培养：将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的原始菌种在无菌条件下分别接种于斜面培养基上，在29±1℃条件下培养36-48h；
②摇床培养：将上述步骤①培养的菌种在无菌条件下分别接种于液体培养基，在pH6.5-7.0、温度为30℃条件下，140-160r/min摇床培养36-48h；
③发酵罐培养：将上述步骤②培养的菌种在无菌条件下分别接种于发酵罐培养基，在pH7.5-8.0、罐压0.5kg、温度为30℃、通风量1:0.8-1.1条件下，培养48-56h后，菌数大于1.0×1010/mL，80%菌体转成芽孢时下罐，得到发酵液；
④将步骤③中得到的发酵液按1:2的重量比混合，经过浓缩干燥制备成细菌混合孢子粉；
真菌混合孢子粉的制备：
①将哈茨木霉、绿色木霉的原始菌种在无菌条件下分别接种于斜面培养基上，在28±1℃条件下培养48h；
②摇床培养：将上述步骤①培养的菌种在无菌条件下分别接种于液体培养基，在pH6.5-6.8、温度为30℃条件下，160-200r/min摇床培养24h；
③发酵罐培养：将上述步骤②培养的菌种在无菌条件下分别接种于发酵罐培养基，在pH6.5-6.8、罐压0.5kg、温度为27-28℃、通风量为1:0.7，在培养48h后，菌丝体约占总体积的20%时终止发酵，进行固体发酵产孢；
④固体发酵产孢：将上述步骤③经过发酵罐培养后的菌丝体接种到固体发酵培养基上，培养48h，90%菌体转成芽孢；
⑤将上述步骤④中完全产孢的培养基分别浸在清水中制成孢子悬浮液，从而得到哈茨木霉孢子悬浮液、绿色木霉孢子悬浮液；
⑥将上述步骤⑤中得到的哈茨木霉孢子悬浮液、绿色木霉孢子悬浮液分别浓缩干燥制备成真菌混合孢子粉；然后，按照2：1的重量比混合配制成真菌混合孢子粉；
将上述制得的细菌混合孢子粉和真菌混合孢子粉按照1:3的重量比混合，从而制备得到复合菌剂。
上述细菌混合孢子粉的制备中，步骤①中选用的斜面培养基的配方如下：葡萄糖15g、鱼蛋白胨5g、酵母膏5g、水1000mL、琼脂15g；
步骤②中的液体培养基配方如下：葡萄糖10g、牛肉膏5g、酵母粉5g、淀粉10g、豆饼粉5g、K2HPO40.5g、MgSO40.2g、水1000mL；
步骤③中的发酵罐培养基配方如下：玉米粉26kg、豆饼粉16kg、硫酸铵4kg、葡萄糖8kg、酵母粉2.5kg、蛋白胨1.7kg、加水至600kg；
上述真菌混合孢子粉的制备中，步骤①中选用的斜面培养基的配方如下：葡萄糖20g、土豆汁200g、琼脂20g、水1000mL；
步骤②中的液体培养基配方如下：白糖20g、酵母膏0.5g、淀粉20g、磷酸二氢钾0.5g、硫酸镁0.2g、氯化钠0.2g、水1000mL；
步骤③中的发酵罐培养基配方如下：淀粉12kg、豆饼粉1.2kg、玉米粉3kg、白糖12kg、酵母膏0.3kg、硫酸镁0.12kg、氯化钠0.12kg、加水至600kg；
步骤④中的固体发酵培养基配方如下：固体料：棉籽壳25%、玉米粉10%、麸皮65%；固体料与水的重量比为1:0.8。
采用上述培养基，本发明能够准确快速获得稳定足额含量的孢子粉，保证本发明产品生产得以顺利进行。同时采用本培养基材料简单易行，成本低廉，技术容易操作。
此外，本发明还提供一种制备上述复合微生物杀菌剂的制备方法。
具体地是将按照重量份计的10-20份复合孢子粉、10-20份营养成分、2-6份酶活物质、54-78份杀菌剂载体混合搅拌均匀制备得到。
优选地，其是将按照重量份计的15份复合孢子粉、15份营养成分、4份酶活物质、66份杀菌剂载体混合搅拌均匀制备得到。
本发明还提供上述复合微生物杀菌剂在农作物生产中的应用。所述复合微生物杀菌剂为粉剂或颗粒剂。具体的制剂为本领域技术人员所掌握，本发明对此不作特别限定。本领域技术人员可以预见采用本发明所述的复合微生物杀菌剂与合适的辅料可以制备出具有显著杀菌效果的粉剂或者颗粒剂。
该复合微生物杀菌剂可在翻耕时拌土撒施，也可进行沟施、穴施，浸种、蘸根、淋施，也可以随肥水灌溉或单独灌根使用，或者叶面喷雾处理。
本发明所述复合微生物杀菌剂能迅速在植物根围定植生长并形成“保护罩”，以防止根部病原真菌的侵染，同时在与病原菌互作和重寄生过程中产生抗生素和植物生长等物质，能显著预防、拮抗或直接杀死农作物多种病害，特别是对重茬植地的根腐病、立枯病、霜霉病、枯萎病等土传病害有特效，同时具有促根催芽作用，促进农作物健康生长，从而提高产量，改善品质。
采用上述技术方案，本发明的优点是：
1、本发明的微生物种类搭配合理，哈茨木霉和绿色木霉组合，在植物根围生长并形成“保护罩”，产生的拮抗、杀菌作用互补性更强；地衣芽孢杆菌能产生多种蛋白酶和拮抗物质以及细胞分裂素和脱落酸等；枯草芽孢杆菌和哈茨木霉搭配后，能增强产品的蛋白酶活性和拮抗农作物病原菌的能力，起到生防促生作用。
2、本发明的有效菌制备方法先进科学，简便可行，孢子数含量高，存活时间长。加入酶活物质能使孢子在植物根际迅速定植生长，加入营养成分能为孢子在根际快速定殖提供能量。
3、本发明的复合微生物杀菌剂技术处在国际领先前沿。优势作用在于能在植物根围、叶围迅速生长，抢占植物体表面位点，形成一个“保护罩”。在与病原菌互作的过程中形成重寄生作用，分泌胞外酶溶解细胞壁，穿透寄主菌丝，吸取营养，进而将病原菌杀死。同时分泌一部分抗生素和植物生长调节物质，增强植物的长势和抗病能力。
4、本发明的复合微生物杀菌剂是粉状或颗粒状剂型，能溶于水。施用方法简便实用，即可翻耕时撒施，又可穴施、沟施，浸种，蘸根，淋施，也可以随肥水灌溉或单独灌根使用，或者叶面喷雾处理。
5、本发明的复合微生物杀菌剂在生产上应用效果好：用本发明的复合微生物杀菌剂对几种蔬菜进行处理,通过对蔬菜不同生育期的农艺性状、经济性状、产量和病害发展情况的考察,研究其生物防治效果及促生作用。结果表明,本发明的复合微生物杀菌剂对黄瓜枯萎病和黄瓜白粉病有很好的生物防治效果,并能有效控制芹菜病毒病的发展,且对供试植株安全；同时对蔬菜有显著的促生作用,能增加植株的株高、地茎、叶片数,有效提高蔬菜的品质和产量;灰霉病是草莓栽培中最普遍的一种病害,主要发生在果实、花瓣、萼片及枝叶等部位上,特别是保护地草莓,在果实趋成熟时最易发病。如果遇到连续阴雨天气,发病最为严重,造成严重损失。利用本发明的复合微生物杀菌剂防治保护地草莓灰霉病效果显著。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1 复合微生物杀菌剂
本实施例所述复合微生物杀菌剂的组成：
复合菌剂10kg营养成分10kg；酶活物质2kg；杀菌剂载体78kg。
上述复合菌剂中含有：哈茨木霉4.5×108cfu/g；绿色木霉2×108cfu/g；枯草芽孢杆菌0.5×108cfu/g；地衣芽孢杆菌1×108cfu/g；有效菌总含量≥8×108cfu/g。
其中，上述复合菌剂由以下步骤制得：
细菌混合孢子粉的制备：
①斜面培养：将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的原始菌种在无菌条件下分别接种于斜面培养基上，在29±1℃条件下培养48h；
②摇床培养：将上述步骤①培养的菌种在无菌条件下分别接种于液体培养基，在pH6.5、温度为30℃条件下，160r/min摇床培养36h；
③发酵罐培养：将上述步骤②培养的菌种在无菌条件下分别接种于发酵罐培养基，在pH8.0、罐压0.5kg、温度为30℃、通风量1:0.8条件下，培养56h后，菌数大于1.0×1010/mL，80%菌体转成芽孢时下罐，得到发酵液；
④将步骤③中得到的枯草芽孢杆菌发酵液和地衣芽孢杆菌发酵液按1:2的重量比混合，经过浓缩干燥制备成细菌混合孢子粉；
在上述细菌混合孢子粉的制备中，步骤①中选用的斜面培养基的配方如下：葡萄糖15g、鱼蛋白胨5g、酵母膏5g、水1000mL、琼脂15g。
上述步骤②中的液体培养基配方如下：葡萄糖10g、牛肉膏5g、酵母粉5g、淀粉10g、豆饼粉5g、K2HPO40.5g、MgSO40.2g、水1000mL。
上述步骤③中的发酵罐培养基配方如下：玉米粉26kg、豆饼粉16kg、硫酸铵4kg、葡萄糖8kg、酵母粉2.5kg、蛋白胨1.7kg、加水至600kg。
真菌混合孢子粉的制备：
①将哈茨木霉、绿色木霉的原始菌种在无菌条件下分别接种于斜面培养基上，在29±1℃条件下培养48h；
②摇床培养：将上述步骤①培养的菌种在无菌条件下分别接种于液体培养基，在pH6.6、温度为30℃条件下，160r/min摇床培养24h；
③发酵罐培养：将上述步骤②培养的菌种在无菌条件下分别接种于发酵罐培养基，在pH6.6、罐压0.5kg、温度为28℃、通风量为1:0.7，在培养48h后，菌丝体约占总体积的20%时终止发酵，进行固体发酵产孢；
④固体发酵产孢：将上述步骤③经过发酵罐培养后的菌丝体接种到固体发酵培养基上，培养48h，90%菌体转成芽孢；
⑤将上述步骤④中完全产孢的培养基分别浸在清水中制成孢子悬浮液，从而得到哈茨木霉孢子悬浮液、绿色木霉孢子悬浮液；
⑥将上述步骤⑤得到的哈茨木霉孢子悬浮液、绿色木霉孢子悬浮液分别浓缩干燥制备成真菌混合孢子粉；然后，按照4.5:2的重量比混合配制成真菌混合孢子粉。
在上述真菌混合孢子粉的制备中，步骤①中选用的斜面培养基的配方如下：葡萄糖20g、土豆汁200g、琼脂20g、水1000mL，pH自然。
上述步骤②中的液体培养基配方如下：白糖20g、酵母膏0.5g、。淀粉20g、磷酸二氢钾0.5g、硫酸镁0.2g、氯化钠0.2g、水1000mL。
上述步骤③中的发酵罐培养基配方如下：淀粉12kg、豆饼粉1.2kg、玉米粉3kg、白糖12kg、酵母膏0.3kg、硫酸镁0.12kg、氯化钠0.12kg、加水至600kg。
上述步骤④中的固体发酵培养基配方如下：
固体料：棉籽壳25kg、玉米粉10kg、麸皮65kg。固体料与水的重量比为1:0.8。
将上述制得的细菌混合孢子粉和真菌混合孢子粉按照1.5:6.5的重量比混合，从而制备得到复合微生物杀菌剂。
本实施例中，酶活物质为蛋白粉和活性酶，具体为由安阳市得天力食品有限责任公司提供的含蛋白质（干基）%≥50，水分%≤9.0，脂肪%≤2.0，细度100目筛上物≤1%的蛋白粉；活性酶由上海蓝基生物科技有限公司提供。
所述营养成分是将尿素、磷酸二氢钾和硫酸钾以及用腐植酸钾螯合的铁、硼、锌、铜、锰和钼等（简称螯合微量元素Chelated traceelements，缩写为CTE），按照尿素：磷酸二氢钾：硫酸钾：CTE=2.83:3.27:1.78:10的重量比例混合均匀制得。所述螯合微量元素（Chelated trace elements，缩写为CTE），是按照腐植酸钾（Potassiumhumate缩写成PHU）：硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)：硫酸铜(CuSO4)：硫酸锰(MnSO4·H2O)：硫酸锌(ZnSO4·7H2O)：硼砂(Na2B4O7·10H2O)=20:1:1:1:1:0.5的重量比例均匀混合制得。
所述杀菌剂载体为膨润土和海泡石粉，二者用量的重量比为2:1。
实施例2 复合微生物杀菌剂的构成
与实施例1相比，区别点仅在于本实施例所述复合微生物杀菌剂的组成为：
复合菌剂20kg；营养成分20kg；酶活物质4kg；杀菌剂载体56kg。
上述复合菌剂的构成：
哈茨木霉7.5×108cfu/g；绿色木霉4×108cfu/g；枯草芽孢杆菌1.5×108亿cfu/g;地衣芽孢杆菌3×108亿cfu/g;有效菌总含量≥12×108cfu/g。
其中，上述复合菌剂由以下步骤制得：
细菌混合孢子粉的制备：
①斜面培养：将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的原始菌种在无菌条件下分别接种于斜面培养基上，在29±1℃条件下培养36h；
②摇床培养：将上述步骤①培养的菌种在无菌条件下分别接种于液体培养基，在pH7、温度为30℃条件下，140r/min摇床培养48h；
③发酵罐培养：将上述步骤②培养的菌种在无菌条件下分别接种于发酵罐培养基，在pH7.5、罐压0.5kg、温度为30℃、通风量1:1.1条件下，培养48h后，菌数大于1.0×1010/mL，80%菌体转成芽孢时下罐，得到发酵液；
④将步骤③中得到的枯草芽孢杆菌发酵液和地衣芽孢杆菌发酵液按4:5的重量比混合，经过浓缩干燥制备成细菌混合孢子粉；
真菌混合孢子粉的制备：
①将哈茨木霉、绿色木霉的原始菌种在无菌条件下分别接种于斜面培养基上，在28±1℃条件下培养48h；
②摇床培养：将上述步骤①培养的菌种在无菌条件下分别接种于液体培养基，在pH6.8、温度为30℃条件下，200r/min摇床培养24h；
③发酵罐培养：将上述步骤②培养的菌种在无菌条件下分别接种于发酵罐培养基，在pH6.8、罐压0.5kg、温度为27℃、通风量为1:0.7，在培养48h后，菌丝体约占总体积的20%时终止发酵，进行固体发酵产孢；
④固体发酵产孢：将上述步骤③经过发酵罐培养后的菌丝体接种到固体发酵培养基上，培养48h，90%产孢；
⑤将上述步骤④中完全产孢的培养基分别浸在清水中制成孢子悬浮液，从而得到哈茨木霉孢子悬浮液、绿色木霉孢子悬浮液；
⑥将上述步骤⑤得到的哈茨木霉孢子悬浮液、绿色木霉孢子悬浮液分别浓缩干燥制备成真菌混合孢子粉；然后，按照4:1的重量比混合配制成真菌混合孢子粉。
将上述制得的细菌混合孢子粉和真菌混合孢子粉按照1:2的重量比混合，从而制备得到复合微生物杀菌剂。
实施例3
与实施例1相比，区别点仅在于本实施例所述复合微生物杀菌剂的组成为：
复合菌剂15kg；营养成分15kg；酶活物质4kg；杀菌剂载体66kg。
上述复合菌剂的构成：
哈茨木霉6×108cfu/g；绿色木霉3×108cfu/g；枯草芽孢杆菌1×108亿cfu/g;地衣芽孢杆菌2×108亿cfu/g;有效菌总含量≥12×108cfu/g。
其中，上述复合菌剂由以下步骤制得：
细菌混合孢子粉的制备：
①斜面培养：将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的原始菌种在无菌条件下分别接种于斜面培养基上，在29±1℃条件下培养36h；
②摇床培养：将上述步骤①培养的菌种在无菌条件下分别接种于液体培养基，在pH6.8、温度为30℃条件下，150r/min摇床培养42h；
③发酵罐培养：将上述步骤②培养的菌种在无菌条件下分别接种于发酵罐培养基，在pH7.8、罐压0.5kg、温度为30℃、通风量1:1条件下，培养48h后，菌数大于1.0×1010/mL，80%菌体转成芽孢时下罐，得到发酵液；
④将步骤③中得到的枯草芽孢杆菌发酵液和地衣芽孢杆菌发酵液按1:2的重量比混合，经过浓缩干燥制备成细菌混合孢子粉；
真菌混合孢子粉的制备：
①将哈茨木霉、绿色木霉的原始菌种在无菌条件下分别接种于斜面培养基上，在28±1℃条件下培养48h；
②摇床培养：将上述步骤①培养的菌种在无菌条件下分别接种于液体培养基，在pH6.6、温度为30℃条件下，180r/min摇床培养24h；
③发酵罐培养：将上述步骤②培养的菌种在无菌条件下分别接种于发酵罐培养基，在pH6.6、罐压0.5kg、温度为27℃、通风量为1:0.7，在培养48h后，菌丝体约占总体积的20%时终止发酵，进行固体发酵产孢；
④固体发酵产孢：将上述步骤③经过发酵罐培养后的菌丝体接种到固体发酵培养基上，培养48h，90%产孢；
⑤将上述步骤④中完全产孢的培养基分别浸在清水中制成孢子悬浮液，从而得到哈茨木霉孢子悬浮液、绿色木霉孢子悬浮液；
⑥将上述步骤⑤得到的哈茨木霉孢子悬浮液、绿色木霉孢子悬浮液分别浓缩干燥制备成真菌混合孢子粉；然后，按照2:1的重量比混合配制成真菌混合孢子粉。
将上述制得的细菌混合孢子粉和真菌混合孢子粉按照1:3的重量比混合，从而制备得到复合微生物杀菌剂。
实施例4
与实施例3相比，区别点仅在于本实施例所述复合微生物杀菌剂的组成为：
复合菌剂20kg；营养成分20kg；酶活物质6kg；杀菌剂载体54kg。
上述复合菌剂的构成：
哈茨木霉7.5×108cfu/g；绿色木霉4×108cfu/g；枯草芽孢杆菌1.5×108亿cfu/g;地衣芽孢杆菌3×108亿cfu/g;有效菌总含量≥12×108cfu/g。
为了进一步验证本发明所述的复合微生物杀菌剂的优越性能，发明人对此展开了一系列研究试验，篇幅所限，此处仅例举个别实施例的试验数据，本领域技术人员能够理解以本发明其他实施例重复下述试验，也能够得到相同或相近的试验结论。
试验例1 复合微生物杀菌剂防治番茄茎基腐病效果试验
生物防治作物病虫害，既保护了环境，维护了生态平衡，又避免了因使用农药对农产品造成的污染，促进了生态农业的可持续发展，因而已经成为现代农业发展的总趋势。本发明所述的复合微生物杀菌剂（即HT安德克，下同）中的木霉菌是一种有益微生物，广泛存在于土壤中。如何更好地利用它，是目前值得探讨的课题之一。发明人2009年在浏阳市生态农业园的保护地番茄上进行了HT安德克防治茎基腐病效果试验，现将试验情况总结如下：
一、供试材料
1.试验地试验地设在浏阳市农业科技园邱锡光的日光温室内。该温室全年种植秋延迟、早春两茬番茄，已连续种植5年，目前番茄茎基腐病发生频繁，为害严重，一般年份减产10%以上，严重年份达到30%。
2.试验药剂：
供试药剂：本发明实施例1（又名HT安德克制剂）（有效菌总含量≥8×108cfu/g）；由湖南泰谷生物科技股份有限公司生产；对照杀菌剂：50%福美双可湿性粉剂，由济南艾格福生产实业有限公司生产。
二、田间设计与试验方法
设HT安德克制剂（即实施例1）、福美双、清水对照共3个处理组，随机区组排列，重复3次，小区面积为10m2。每个小区定植株数为45株。番茄共留3穗果，打顶。
试验方法：一是育苗期将HT安德克制剂与番茄种子按重量比1∶5进行拌种，50%福美双稀释100倍液拌种；二是在番茄定植时穴施，HT安德克制剂每穴施1克，50%福美双可湿性粉剂用300倍液灌根；三是在番茄生长期间，将HT安德克制剂与追肥一起补施于田间，每667m2用HT安德克制剂3-5kg+尿素5-7kg+细黄土10-20kg,充分混匀施入。50%福美双可湿性粉剂用500倍液灌根。对照清水均采取灌根处理。
三、结果与分析
1.病情调查调查出苗率、成苗率及感病指数。每个小区固定10株，分别记载每级病株数。0级：无病斑；1级：茎基部病斑占总面积的1%～30%；2级：茎基部病斑占总面积的31%～50%；3级：茎基部病斑占总面积的50%以上。最后统计病情指数。
2.试验结果
①不同处理组对出苗率和成苗率的影响。
在番茄育苗试验中，采用HT安德克制剂处理的番茄出苗率高达95.2%，比清水对照组提高21.4%，幼苗叶片浓绿，茎秆粗壮，成苗率达100%；采用福美双处理组的出苗率为93.4%，成苗率为89.5%。
移栽后成苗死亡率：采用HT安德克处理组的为0.39%，用50%福美双可湿性粉剂处理组的为17.4%，而清水对照为34.2%（详见表1）。
表1 不同处理组对番茄苗期的影响
| 处理组 | 出苗率% | 成苗率% | 移栽后死亡率% |
| HT安德克 | 95.2 | 100 | 0.39 |
| 福美双 | 93.4 | 89.54 | 17.4 |
| 清水对照 | 78.4 | 74.2 | 34.2 |
②对番茄根系的影响。在番茄第二穗果膨大时，挖根调查，采用HT安德克处理组的植株，不定根数量明显增多，从定点调查的10株来看，单株不定根的总量平均是清水对照的9.6倍，且不定根粗壮、有光泽，而清水对照不定根数量少且细、颜色暗淡。
③对茎基腐病发病率的调查。番茄打顶后：用HT安德克处理的小区，植株生长旺盛，没有出现早衰现象，定点调查10株，茎基腐病发病率仅为8.15%，感病指数为1.92，采用福美双处理的发病率、感病指数分别为52.8%、38.9，而清水对照发病率、感病指数则分别为71%、54.1（详见表2）。
表2 不同处理组成株发病率
| 处理组 | 定点调查植株 | 茎基腐病发病率% | 感病指数 |
| HT安德克 | 10 | 8.51 | 1.92 |
| 福美双 | 10 | 52.8 | 38.9 |
| 清水对照 | 10 | 71 | 54.1 |
④不同处理组对番茄产量的影响。用HT安德克处理的小区平均产量为123.7千克，用福美双处理的为94.5千克，清水对照为87.3千克，用HT安德克处理的产量比清水对照高出41.7%，用福美双处理的比清水对照高出8.2%。
四、结论与分析
采用杀菌剂防治番茄病害，随着有害菌抗性的增强，难以收到理想的防治效果；同时常年使用杀菌剂，造成土壤中有益菌数量逐年减少，土传性病害呈现加重的趋势。而HT安德克制剂（即本发明实施例1）通过竞争作用、重寄生作用、抗生作用、诱导植物抗性作用、水解酶启动植物的防御反应、保护酶增强植物抗病性、毒性蛋白作用、协同拮抗作用等机制，对多种植物病原菌具有拮抗作用，具有保护和治疗双重功效，同时对土壤中其他有益菌没有影响。从以上试验情况就可以看出，HT安德克在防治保护地番茄茎基腐病的同时，促进了植株根系的生长，提高了植株的综合抗性。
试验例2 复合微生物杀菌剂防治保护地草莓灰霉病的试验
1 材料与方法
1.1 供试菌株和材料
以温室大棚中感病草莓果实上分离的灰霉菌B22为拮抗对象,用本发明实施例2所述的复合微生物杀菌剂（湖南泰谷生物科技有限公司）分离到的复合菌体为拮抗体（称为哈慈木霉复合菌体，下同）,40%多菌灵可湿性粉剂(江苏新沂农药厂)作对照,培养基为PDA平板。
1.2 对峙培养试验
制备PDA平板,将分离到的哈慈木霉复合菌体和分离到的草莓灰霉菌B22点接在相对的平板边缘,放入恒温培养箱中,保持250C，重复3次（即平板对峙法培养处理组1、2、3）。定量观察,并记录菌落生长半径及相互作用。
1.3 重寄生作用
在对峙培养试验中,在两菌落的交接处形成对峙界面,挑取界面处的菌丝涂片,在光学显微镜下观察两种菌丝的交接情况。
1.4 温室大棚防治试验
在长沙市芙蓉区黄兴镇黄兴村的草莓温室大棚内进行田间试验,该大棚钢管结构,长100m,宽8m,棚内定植红颜草莓。设哈慈木霉复合菌体孢子悬浮液孢子含量为5×106个/ml、3×106个/ml、2×106个/ml,40%多菌灵500倍液和空白对照5个处理组。每个小区面积为4m2。采用喷雾施药,重点喷施病果、病叶。每次药液量控制在55kg/667m2,于2月26日灰霉病发生初期喷施1次,7-8d后再喷施第2次。喷药前7d及第2次施药后7d各调查1次病情。每个处理组调查100片病叶和100个病果,并记录病情指数。
2 结果与分析
2.1 竞争作用
对峙培养3d后,检测菌落生长半径。统计数据表明:灰霉菌B22菌落平均半径为1.1cm,哈慈木霉复合菌菌落半径的平均值为7cm。而在相同条件下纯培养时B22和哈慈木霉复合菌的菌落半径分析为6.8cm和7.8cm。这说明哈慈木霉复合菌对灰霉菌的生长有较大的影响,哈慈木霉复合菌生命力较强,生长快,能够与灰霉菌竞争营养,从而抑制了灰霉菌的生长。随着时间的延长,哈慈木霉复合菌菌落加大,到第5d后哈慈木霉复合菌长满培养皿,而灰霉菌却停止生长或逐渐死亡。
2.2 重寄生作用
对峙培养3d后,两菌落的交界处形成对峙界面,在显微镜下观察到病菌B22菌丝被哈慈木霉复合菌体菌丝以缠绕生长、紧贴生长和穿入病菌菌丝内生长等方式重复寄生,吸取营养,使灰霉菌B22菌丝逐渐失活、内容物减少、菌丝断裂,直至完全解体。气生菌丝逐渐消失,最后整个菌落被哈慈木霉复合菌体的绿色孢子所掩盖(详见表3)。从对峙培养4-5d后的两菌落交界面处取样做徒手涂片,在显微镜下观察到:灰霉菌B22的孢子量很少,主要是哈慈木霉复合菌体的菌丝、孢子和解体的B22菌丝。统计结果表明:哈慈木霉复合菌体在交界面处孢子占89%以上,在接种病菌B22处哈慈木霉复合菌体孢子占79%以上(详见表4)。
表3 灰霉菌被哈慈木霉复合菌体抑制情况
| 处理组 | 被掩盖率(%) | 气生菌丝消失率(%) |
| 平板对峙法培养处理组1 | 87.2 | 90.8 |
| 平板对峙法培养处理组2 | 90.1 | 91.2 |
| 平板对峙法培养处理组3 | 88.5 | 89.7 |
表4 哈慈木霉复合菌体孢子在灰霉菌菌丝处生长情况
2.3 温室大棚防治试验
施药前和施药后草莓枝叶和果实上的灰霉菌病情指数及防效见表5。
表5 哈慈木霉复合菌体防治草莓灰霉病效果
由表5可见哈慈木霉复合菌体孢子悬浮液孢子含量为5×106个/ml和3×106个/ml,对草莓灰霉病的防效差异不大,与多菌灵500倍液防效基本相当。
3 讨论
由对峙培养试验和小规模田间防治试验表明:哈慈木霉复合菌体对草莓灰霉菌B22有显著地抑制作用,其竞争作用和重寄生作用是控制灰霉菌的重要的拮抗机制。由于哈慈木霉复合菌体的菌丝在灰霉菌菌丝上寄生,竞争营养,致使灰霉菌菌丝失活,并逐渐停止生长,最终导致彻底解体、死亡。通过温室大棚的田间试验表明:哈慈木霉复合菌体对草莓灰霉病的防治效果与多菌灵基本相当。但由于哈慈木霉复合菌体为生物制剂,无毒无污染,在草莓种植中值得推广和应用。
试验例3 复合微生物杀菌剂对蔬菜的生防促生效果试验
1 材料与方法
1.1 供试材料
①黄瓜品种:湘黄瓜4号,长沙市蔬菜园艺研究所生产提供。
②番茄品种:红太郎,湖南衡阳市蔬菜研究所生产提供。
③芹菜品种:高优西芹,湖南省农科院蔬菜所生产提供。
④HT安德克:（本发明实施例3所制的复合微生物杀菌剂的商品名称，下同）湖南泰谷生物科技有限公司研制生产。
⑤对照药剂A:95%敌克松可湿性粉由上海金桥化工有限公司生产提供。
⑥对照药剂B：50%三唑酮超微乳剂由云南省化工研究院生产提供。
1.2 试验方法
①HT安德克对黄瓜植株的促生试验
在长沙市芙蓉区黄兴镇黄兴村蔬菜示范基地进行,选择常年种植黄瓜的田块进行。选用3个面积分别为190、200和200m2的大棚,分别设为HT安德克,95%敌克松可湿性粉剂,清水对照3个处理组。每个处理组3次重复,共9个小区,小区面积为60~70m2。每个小区的施肥及灌水等管理均匀一致。HT安德克和95%敌克松可湿性粉的施用方式均为灌根,共3次,HT安德克孢子浓度为1.66×107cfu/mL,95%敌克松可湿性粉200~400倍液。采取随机定点取样方法在不同的生育期进行农艺性状调查,并在移栽30d后调查黄瓜枯萎病的发生情况。
②HT安德克对番茄幼苗的促生试验
试验在浏阳市古港镇农业科技园和佳农业科技发展有限公司设施大棚进行。试验田为30m2的苗床,采用种子拌土的方式播种,设3个处理组,每个处理组3次重复,处理组1为HT安德克处理组,HT安德克与沙土的比例为1:100;处理组2为50%三唑酮超微乳剂药剂对照,药剂与沙土的比例为1:75;处理组3为对照,只用沙土拌种。每个处理组的肥水等农业管理措施均匀一致。分别在番茄出苗后7和14d进行株高、地茎长度及鲜重调查。
③HT安德克对芹菜植株生长的影响
试验在长沙市芙蓉区黄兴镇黄兴村蔬菜示范基地进行。设4个处理组,3次重复,处理组1-3分别为含哈茨木霉复合菌体孢子粉的孢子浓度为1.66×108、1.66×107、1.66×106cfu/mL的HT安德克,处理组4为清水对照,每个处理组30m2。施用方式:在芹菜移栽7d后灌根处理,每隔7d施用1次,共3次。观察芹菜的长势和病虫害发生情况,并在收获时测定每个处理组的单株产量。
④HT安德克防治黄瓜白粉病试验试验在长沙市芙蓉区黄兴镇黄兴村蔬菜示范基地进行。采用随机区组设计,共5个处理组。处理组1-3分别为孢子浓度5.44×106、6.44×106、1.29×107cfu/mL的HT安德克;处理组4为50%三唑酮超微乳剂;处理组5为清水对照。施用方式为叶面喷施,小区面积为12m2,每个处理组4次重复。
2 结果与分析
2.1 不同处理组的黄瓜农艺性状比较
①不同生育期叶片数比较通过对黄瓜不同生育时期叶片数的调查显示,HT安德克能增加黄瓜叶片数,从而提高植株的光合作用(结果见表6)。其中,苗期用HT安德克处理的效果不明显,与对照处理组在5%水平差异不显著;始花期与收获前期HT安德克处理组的效果最好,差异显著;收获中期HT安德克处理组的效果较好,但差异不显著。
②不同生育期藤蔓长度比较苗期HT安德克处理组与清水对照相比促生作用明显(结果见表7),促生率53.6%,HT安德克的促生效果在始花期表现最好,促生率为最高的66.4%,且HT安德克处理组在这两个时期的促生作用与清水对照在5%水平差异显著;收获前期,HT安德克处理组的促生率为31.5%,与对照差异不显著;在黄瓜的收获中期,HT安德克的促生效果明显,促生率达到35.1%,与对照在1%水平显著。以上结果说明,HT安德克能提高黄瓜的地上部生物学产量,明显增大黄瓜藤蔓的节间距,有效增加黄瓜的坐果率。
表6 黄瓜不同生育期叶片数比较
表7 黄瓜不同生育期藤蔓长度比较
2.2 HT安德克对番茄幼苗的促生作用
经HT安德克（本发明实施例3）处理过的番茄幼苗生物量较清水对照有明显的增加。出苗7d后HT安德克对番茄幼苗株高、地茎及鲜重的促生率分别为14.20%、23.30%、18.79%(结果见表8)。出苗14d后HT安德克对番茄幼苗株高、鲜重的促生率为16.50%和22.40%,均高于出苗7d的促生效果(结果见表9)。对表格数据的分析得知,HT安德克在两个时段对番茄地茎的促进作用要高于对株高的促进作用,且在幼苗的生长前期表现得更为突出。
2.3 HT安德克对芹菜植株生长的影响
在芹菜收获时,以随机取样的方式从每个处理组中选取5个调查点,每点取5株芹菜测定单株鲜重。结果表明,HT安德克对芹菜产量有明显的促进作用,最高促生率可达28.7%(结果见表10),且HT安德克处理过的芹菜叶柄颜色较深,叶片宽大肥厚、茎杆脆嫩、品质好。观察发现,该试验田内芹菜病毒病发生严重,但是施用HT安德克的3个处理组长势较旺,植株粗壮,各个处理组的病株率明显低于清水对照(结果见表11)。
表8 不同处理组对番茄植株生长的影响(出苗7d)
表9 不同处理组对番茄植株生长的影响(出苗14d)
表10 HT安德克不同浓度对芹菜产量的影响
表11 HT安德克不同浓度对芹菜病毒病的影响
表12 HT安德克黄瓜枯萎病的防治效果
| 处理组 | 调查株数(株) | 发病株数(株) | 发病率(%) | 防效(%) |
| HT安德克 | 300 | 11 | 3.7 | 64.5 |
| 95%敌克松 | 300 | 8 | 2.7 | 74.2 |
| 清水对照CK | 300 | 31 | 10.3 | - |
2.4 HT安德克对黄瓜枯萎病的防治效果
移栽30d后通过对黄瓜枯萎病的发病情况调查发现,对照、HT安德克、敌克松3个处理组黄瓜枯萎病的发病率分别为10.3%、3.7%、2.7%(试验结果见表12)。结果表明,HT安德克对黄瓜枯萎病的相对防效达到64.5%,低于95%敌克松可湿性粉剂防效的74.2%。
2.5 HT安德克对黄瓜白粉病的防治效果
第3次施药后7d进行黄瓜白粉病发病情况调查,分级标准按农业部农药检定所5农药田间药效试验准则6进行,按病情指数计算防治效果。结果显示:3个浓度的HT安德克处理组与50%三唑酮超微乳剂对黄瓜白粉病均有很好的防治效果。HT安德克处理组和50%三唑酮超微乳剂处理组与清水对照之间病情指数差异显著,HT安德克处理组与50%三唑酮超微乳剂处理组之间的病情指数差异不显著。其中HT安德克浓度为160g/667m2的处理组防效为69.92%,低于50%三唑酮超微乳剂处理组(80g/667m2)的74.60%;HT安德克浓度为190g/667m2与HT安德克浓度为380g/667m2处理组的防效均高于50%三唑酮超微乳剂,其中最高浓度HT安德克处理组相对于中浓度HT安德克处理组防治效果提高不明显,HT安德克防治黄瓜白粉病最佳剂量为190g/667m2(结果见表13)。
3 讨论
随着近年来对哈慈木霉生防机制的进一步研究,人们发现一些哈慈木霉菌通过促进植物的生长发育来提高植物的抗病能力。本试验研究了HT安德克对几种蔬菜的促生作用及生防效果。结果表明HT安德克对黄瓜、番茄、芹菜等多种蔬菜的生长有较强的促进作用,促生率可高达30%~50%,在一定程度上提高植株光合作用及吸收土壤养分的能力,从而提高蔬菜的品质及产量。HT安德克对黄瓜枯萎病及黄瓜白粉病具有良好的生物防治效果,与生产上常用的化学药剂的防效相当,且对植株安全。由于HT安德克的促进生长作用,芹菜长势旺盛,对病毒病的发展表现出很强的抑制作用。HT安德克的根际能力是其刺激植物生长和控制病害的重要因素,HT安德克的根际能力与其刺激植物生长作用之间的关系说明提高HT安德克占领或影响植物根际环境的能力在HT安德克的应用中十分重要。使用具有潜在根际能力的HT安德克来防治作物病害和提高作物产量很有经济前景。
表13 HT安德克对黄瓜白粉病的控制效果
实施例4复合微生物杀菌剂对辣椒病害的防治效果试验
1 材料与方法
1.1 HT安德克（本发明实施例3所得复合微生物杀菌剂的商品名，下同）：由湖南泰谷生物科技有限公司生产提供。
1.2 供试辣椒种子湘研9号：由湖南省农科院蔬菜研究所提供,经表面消毒后播种于灭菌培养皿(520cm)的灭菌土中,无菌水保湿,出苗后常规管理。试验于2009年3-6月在湖南农业大学植物保护学院温室进行。
1.3 供试培养基：乳酸杆菌培养选用改良MC培养基,放线菌培养选用高氏1号培养基、光合细菌培养基;酵母培养选用PDA培养基。
1.4 HT安德克处理组的不同土壤制备：称取1000g麦麸,分5份,每份200g,加水润湿,高压蒸汽灭菌器121℃,灭菌1h,24h后再灭菌1h,冷却后,取2份浇上等量的培养7d的HT安德克发酵液,无菌条件下拌匀,分装在10个灭过菌的小塑料桶中,用灭菌滤纸封住桶口。28℃发酵培养6d,揭掉滤纸盖,无菌晾干,用搅拌机搅碎,取1份HT安德克于160°C干热灭菌1h,备用,记为灭活HT安德克。取农田土,烘干,磨碎,过筛取粉末土,在其中加入营养土,部分于160°C干热灭菌1h。按表1分别配置灭菌土(记为+M-T)、灭菌土加HT安德克(记为+M+T)、灭菌土加灭活HT安德克(记为+M+S)、未灭菌土(记为-M-T)(对照),未灭菌土加HT安德克(记为-M+T)5个处理组,分别装入已灭菌的口径为10cm高为30cm的纸杯中,每个处理组3个重复,将各纸杯再置于无菌的光照培养箱中,浇上无菌水湿透,用无菌水保湿,备用。
表14 HT安德克处理组土壤的配方设计
1.5 植物生长相关的生物指标测定
辣椒出苗5d后,取大小一样的幼苗移栽至上述已配置好的纸杯中,每杯1株。用无菌水保湿,第20天检测辣椒地上部分鲜重、叶绿素含量。
1.6 不同处理组的供试土壤中有效微生物主要种群的数量变化检测
①配制菌悬液母液分别称取上述不同处理组的供试土壤各25g于含有225mL无菌水的带玻璃珠的灭菌玻璃瓶内,静置20min后在旋转式摇床上以200r.min-1充分振荡30min,经4层灭菌纱布过滤,滤液即为菌悬液母液。
②稀释菌悬液用1mL灭菌吸管吸取菌悬液母液1mL,沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌水的试管内,振摇试管,混合均匀,即为1:10的稀释液;取1:10的稀释液1mL注入含有9mL灭菌水的试管内混匀,即为1:100的稀释液;如此递增稀释6次,即依次得到菌悬液的10、102、103、104、105和106倍稀释液。
③倒皿培养分别取各菌悬液的104、105和106倍稀释液1mL于灭菌培养皿内,及时加入熔化后冷却至460C的乳酸杆菌培养基、酵母PDA培养基、放线菌培养基、光合细菌培养基,迅速混匀。每个稀释液均设3次重复。待培养基凝固后,翻转培养皿分别放置于不同的培养箱中进行培养。光合细菌培养基的培养皿放置于(36±1)°C培养箱中培养(48±2)h;酵母菌培养基于25-28°C培养箱中培养5d,乳酸杆菌培养基于(36±1)°C培养箱中培养(72±3)h;放线菌培养基于28-300C培养箱中培养5d。哈慈木霉复合菌体培养基于25°C培养箱中培养48h。
④菌落计数第4天对细菌进行观察记数;第3天对真菌进行观察记数;第6天对放线菌进行观察记数;第7天对光合细菌进行观察记数。单个菌落进行分离计数,并将分离到的菌落进行来源、稀释度、数目记录及统计分析。
土壤(干土)微生物数量/g=每皿平均数菌落×稀释倍数/干土质量分数
2 结果与分析
2.1 HT安德克处理土壤对辣椒生长势的影响
从试验结果可以看出,辣椒在处理组-M+T中的长势明显比在处理组-M-T中的长势好,辣椒在处理组+M+T中的长势也明显好于+M-T和处理组+M+S中辣椒的长势,说明土壤中HT安德克有利于植物的生长,处理组+M-T中辣椒的长势和处理组+M+S中辣椒的长势相当,说明灭活的HT安德克对辣椒的生长没有影响。
2.2 HT安德克处理土壤对辣椒生长指标的影响
辣椒移栽后20d,测其各项生长指标。结果显示:处理组-M+T的鲜重比处理组-M-T显著增加,增加的幅度达65.41%;处理组+M+T中辣椒鲜重显著高于处理组+M-T，+M+T的鲜重增加了22.26%,说明了HT安德克对辣椒的生长有促进作用。处理组+M-T中的辣椒鲜重和处理组+M+S相比,方差分析没有差异,说明只有活的HT安德克才具有这种促生作用(试验结果见表15)。
处理组-M+T的叶绿素的含量显著高于处理组-M-T的叶绿素的含量,处理组-M+T的叶绿素的含量比处理组-M-T增加了34104%;处理组+M+T的叶绿素含量显著高于处理组+M-T,增加幅度为2913%,说明HT安德克增加了辣椒的叶绿素含量。表明土壤中施加HT安德克后,由于增加了辣椒叶片的叶绿素含量,提高了辣椒光合效率,进而促进了辣椒的生长。处理组+M-T的叶绿素的含量和处理组+M+S相当,方差分析差异不显著,说明被灭活后的HT安德克对辣椒的叶绿素含量是没有影响的(试验结果见表15)。
表15 辣椒移栽施加HT安德克的土壤20d后地上鲜重、叶绿素含量及硝酸还原酶活性的变化
注:不同小写字母表示同一竖栏数据差异达0.05显著水平，下同。
从表15可以看出,处理组-M+T的硝酸还原酶的活性显著高于对照-M-T，增加幅度达53.9%,同时处理组-M+T辣椒的硝酸还原酶的活性显著高于处理组+M-T，增加幅度达68.12%。说明HT安德克能有效提高辣椒叶片硝酸还原酶的活性。硝酸还原酶和氮素的利用密切相关,这表明硝酸还原酶活性的增加和辣椒鲜重的增加密切相关。处理组+M-T中辣椒硝酸还原酶活性和处理组+M+S相当,说明灭活后的HT安德克不具有影响辣椒硝酸还原酶活性的能力。
从表15还可以看出,处理组-M+T中辣椒鲜重、叶绿素含量和硝酸还原酶的活性均显著高于处理组+M+T,增加幅度分别为18.42%、15.9%和26.28%,表明HT安德克和土壤中微生物存在着相互作用,这种相互作用有利于辣椒的生长。处理组+M-T和处理组+M+S的鲜重高于处理组-M-T,而处理组+M-T和处理组+M+S的叶绿素含量和硝酸还原酶的活性显著低于处理组-M-T,这说明无菌环境对植物的生长有利,但是这种环境在现实中并不存在。
2.3HT安德克处理土壤中有益微生物主要种群的数量变化
比较处理组-M-T和处理组-M+T可以看出,土壤中施加了HT安德克后,放线菌、乳酸杆菌和光合细菌数量显著增加,分别增加了64.71%、77.217%和58.62%,酵母的数量降低了52.94%。这说明HT安德克和土壤中各微生物之间存在着相互作用,虽然酵母的含量降低了,但这种相互作用提高了土壤中有益微生物整体数量。同时,处理组-M-T和处理组-M+T中细菌的总量没有差异,说明HT安德克和土壤微生物互作的实质是改变各微生物的含量,从而改变植物生存土壤的微生态环境,为植物的生长提供了良好的生长环境,从而促进了植物的生长(试验结果见表16)。
表16 不同HT安德克处理组合下土壤中主要有益微生物数量的变化
“—”表示在试验浓度范围内没有检测出。
3 小结与讨论
土壤中施加了本发明所述复合微生物杀菌剂，即HT安德克后,辣椒的长势明显优于未施加HT安德克的处理组,同时辣椒的鲜重和叶绿素的含量明显增加,辣椒叶片中硝酸还原酶活性明显提高,说明HT安德克提高了辣椒光合作用的能力、增加了辣椒对氮元素的利用效率,从而促进了辣椒生长的能力。试验中无菌土和加入灭活的HT安德克的无菌土对辣椒的鲜重、叶绿素含量及硝酸还原酶活性没有影响,说明只有活的HT安德克才具有促进辣椒的生长作用。处理组-M+T的长势明显好于-M-T,同时鲜重、叶绿素的含量及硝酸还原酶的活性都显著提高,表明HT安德克和土壤中的微生物之间存在着相互作用。土壤中有益微生物之间存在着复杂的相互关系。土壤中加入HT安德克以后,HT安德克改变了土壤微生物的含量,增加了土壤放线菌、乳酸杆菌、光合细菌的含量,乳酸菌以从细菌、酵母菌得到的糖类为基质产生乳酸,在厌氧条件下还可将蛋白质分解成氨基酸。乳酸具有很强的杀菌力,能抑制有害微生物的繁殖,以及有机物的急剧腐败分解。放线菌以氨基酸为基质,生成抗生物质。这种抗生物质能抑制病原菌,竞争有害霉菌及细菌赖以生存的物质而抑制其繁殖,创造有利于其他有益微生物的环境。光合细菌具有分解纤维素等有机物的能力,为其他微生物的生长提供养料,同时能抑制土壤病原微生物的作用。施加HT安德克后,既增加有益微生物数量,又使某些有害微生物难以单独大量增殖,从而起到抑制有害微生物、改善土壤微生态环境的作用。新的土壤生态环境有利于辣椒生长发育,土壤病害难以发生,从而促进辣椒的生长。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种复合微生物杀菌剂，其特征在于，所述复合微生物杀菌剂按重量份计由包括如下组分的原料制备而成：
复合菌剂 10-20份；
营养成分 10-20份；
酶活物质 2-6份；
杀菌剂载体 54-78份。
2.根据权利要求1所述的复合微生物杀菌剂，其特征在于，所述复合菌剂中含有生防促生菌以及蛋白分解菌；所述生防促生菌为哈茨木霉、绿色木霉和地衣芽孢杆菌；所述蛋白分解菌为枯草芽孢杆菌。
3.根据权利要求2所述的复合微生物杀菌剂，其特征在于，所述复合菌剂中含有哈茨木霉4.5-7.5×108cfu/g、绿色木霉2-4×108cfu/g、地衣芽孢杆菌1-3×108cfu/g、枯草芽孢杆菌0.5-1.5×108cfu/g；优选为所述复合菌剂中含有哈茨木霉6×108亿cfu/g、绿色木霉3×108cfu/g、地衣芽孢杆菌2×108亿cfu/g、枯草芽孢杆菌1×108cfu/g。
4.根据权利要求1所述的复合微生物杀菌剂，其特征在于，所述营养成分包括氮、磷、钾养分，以及用腐植酸钾螯合的铁、硼、锌、铜、锰和钼微量元素；优选所述营养成分是将尿素、磷酸二氢钾、硫酸钾以及用腐植酸钾螯合的铁、硼、锌、铜、锰和钼即CTE，按照尿素：磷酸二氢钾：硫酸钾：CTE为2.83:3.27:1.78:10的重量比例混合均匀制得。
5.根据权利要求1所述的复合微生物杀菌剂，其特征在于，所述酶活物质为蛋白粉和活性酶，所述酶活物质是按照蛋白粉：活性酶为300:1-100:1的比例均匀混合制成；优选地所述酶活物质是按照蛋白粉：活性酶为200:1的比例均匀混合制成。
6.根据权利要求1所述的复合微生物杀菌剂，其特征在于，所述杀菌剂载体为膨润土和/或海泡石粉。
7.根据权利要求1所述的复合微生物杀菌剂，其特征在于，所述复合菌剂由包括如下步骤的方法制备得到：
细菌混合孢子粉的制备：
将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的原始菌种在无菌条件下分别依次进行斜面培养、摇床培养、发酵罐培养后，将得到的发酵液按1:3-4:5的重量比进行混合，经过浓缩干燥制备成细菌混合孢子粉；
真菌混合孢子粉的制备：
将哈茨木霉、绿色木霉的原始菌种在无菌条件下分别依次进行斜面培养、摇床培养、发酵罐培养、固体发酵产孢后，将得到的完全产孢的培养基分别浸在清水中制成孢子悬浮液，从而得到哈茨木霉孢子悬浮液、绿色木霉孢子悬浮液，然后将得到的哈茨木霉孢子悬浮液、绿色木霉孢子悬浮液分别浓缩干燥制备成真菌孢子粉；然后按照3:2-4:1的重量比混合配制成真菌混合孢子粉；
将上述制得的细菌混合孢子粉和真菌混合孢子粉按照1:5-1:2的重量比混合，从而制备得到复合菌剂。
8.根据权利要求7所述的复合微生物杀菌剂，其特征在于，所述复合菌剂由包括如下步骤的方法制备得到：
细菌混合孢子粉的制备：
①斜面培养：将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的原始菌种在无菌条件下分别接种于斜面培养基上，在29±1℃条件下培养36-48h；
②摇床培养：将上述步骤①培养的菌种在无菌条件下分别接种于液体培养基，在pH6.5-7.0、温度为30℃条件下，140-160r/min摇床培养36-48h；
③发酵罐培养：将上述步骤②培养的菌种在无菌条件下分别接种于发酵罐培养基，在pH7.5-8.0、罐压0.5kg、温度为30℃、通风量1:0.8-1.1条件下，培养48-56h后，菌数大于1.0×1010/mL，80%菌体转成芽孢时下罐，得到发酵液；
④将步骤③中得到的发酵液按1:2的重量比混合，经过浓缩干燥制备成细菌混合孢子粉；
真菌混合孢子粉的制备：
①将哈茨木霉、绿色木霉的原始菌种在无菌条件下分别接种于斜面培养基上，在28±1℃条件下培养48h；
②摇床培养：将上述步骤①培养的菌种在无菌条件下分别接种于液体培养基，在pH6.5-6.8、温度为30℃条件下，160-200r/min摇床培养24h；
③发酵罐培养：将上述步骤②培养的菌种在无菌条件下分别接种于发酵罐培养基，在pH6.5-6.8、罐压0.5kg、温度为27-28℃、通风量为1:0.7，在培养48h后，菌丝体约占总体积的20%时终止发酵，进行固体发酵产孢；
④固体发酵产孢：将上述步骤③经过发酵罐培养后的菌丝体接种到固体发酵培养基上，培养48h，90%菌体转成芽孢；
⑤将上述步骤④中完全产孢的培养基分别浸在清水中制成孢子悬浮液，从而得到哈茨木霉孢子悬浮液、绿色木霉孢子悬浮液；
⑥将上述步骤⑤中得到的哈茨木霉孢子悬浮液、绿色木霉孢子悬浮液分别浓缩干燥制备成真菌混合孢子粉；然后，按照2：1的重量比混合配制成真菌混合孢子粉；
将上述制得的细菌混合孢子粉和真菌混合孢子粉按照1:3的重量比混合，从而制备得到复合菌剂。
9.根据权利要求8所述的复合微生物杀菌剂，其特征在于，所述细菌混合孢子粉的制备中：
步骤①中选用的斜面培养基的配方如下：葡萄糖15g、鱼蛋白胨5g、酵母膏5g、水1000mL、琼脂15g；
步骤②中的液体培养基配方如下：葡萄糖10g、牛肉膏5g、酵母粉5g、淀粉10g、豆饼粉5g、K2HPO40.5g、MgSO40.2g、水1000mL；
步骤③中的发酵罐培养基配方如下：玉米粉26kg、豆饼粉16kg、硫酸铵4kg、葡萄糖8kg、酵母粉2.5kg、蛋白胨1.7kg、加水至600kg；
所述真菌混合孢子粉的制备中：
步骤①中选用的斜面培养基的配方如下：葡萄糖20g、土豆汁200g、琼脂20g、水1000mL；
步骤②中的液体培养基配方如下：白糖20g、酵母膏0.5g、淀粉20g、磷酸二氢钾0.5g、硫酸镁0.2g、氯化钠0.2g、水1000mL；
步骤③中的发酵罐培养基配方如下：淀粉12kg、豆饼粉1.2kg、玉米粉3kg、白糖12kg、酵母膏0.3kg、硫酸镁0.12kg、氯化钠0.12kg、加水至600kg；
步骤④中的固体发酵培养基配方如下：固体料：棉籽壳25%、玉米粉10%、麸皮65%；固体料与水的重量比为1:0.8。
10.权利要求1-9任一项所述的复合微生物杀菌剂在农作物生产中的应用，其特征在于，所述复合微生物杀菌剂为粉状或颗粒状剂型。
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