CN104263660A - 一种生防木霉f18及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生防木霉F18及其制备方法和应用，所述生防木霉F18的生物菌种保藏编号为：CGMCCNo.9486，保藏日期为：2014年8月5日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。制备方法包括以下步骤：菌丝培养、原生质体的制备、原生质体融合和融合子的筛选。本发明具有降解多菌灵和抑菌作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种生防木霉F18及其制备方法和应用，具体涉及一种通过原生质体融合技术获得的具有降解多菌灵和抑菌作用的生防木霉F18，属于生物技术领域。
背景技术
多菌灵（Carbendazim）是一种高效广谱的苯并咪唑类杀菌剂，广泛应用于大田、经济作物、蔬菜和果实的病害防治，还可用于造纸、橡胶、纺织、皮革等工业的防霉，同时也是其他杀菌剂例如苯菌灵、甲基托布津的活性组成部分。我国是多菌灵生产和使用大国，2011年多菌灵生产首次突破4万吨的产量，占我国杀菌剂总量的1/4。多菌灵在我国农业生产上得到广泛应用的同时，由于用量大、半衰期长，引起的环境污染问题也日趋严重。多菌灵施用后能较长时间的残留在土壤中，对土壤中的微生物群落产生影响，并且通过迁移和食物链的作用对植物、鸟类、哺乳动物甚至是人类产生毒害作用。
为解决多菌灵农残污染问题，人们开始研究多菌灵降解菌株，目前报道的降解菌株多为细菌，如红平红球菌、假单孢菌等。例如，2011年黄玉杰分离到一株红平红球菌djl-11，48h内对多菌灵的降解率达到99.15%，从中克隆了多菌灵降解相关基因（黄玉杰，张新建，任艳，李纪顺，张广志，杨合同.多菌灵降解菌的分离、鉴定及其降解特性研究.山东科学.2011.24（2）：28-34）。国外Gunjan Pandey等从诺卡氏菌中克隆了多菌灵降解相关基因。虽然这些菌株对多菌灵的降解效率较高，但由于菌株本身对植物病原菌没有拮抗作用，功能单一，导致其市场应用前景受到限制 (Gunjan Pandey, Susan J.Dorrian, Robyn J.Russell, Clint Brearley, Steven Kotsonis, John G.Oakeshott. Cloning and Biochemical Characterization of a Novel Carbendazim (Methyl-1H-Benzimidazol-2-ylcarbamate)-Hydrolyzing Esterase from the Newly Isolated Nocardioides sp. Strain SG-4G and Its Potential for Use in Enzymatic Bioremediation. Applied and Environmental Microbiology. 2010)。
木霉菌是一类重要的植物病害生防菌，木霉LTR-2菌剂（山东省科学院中日友好生物技术研究中心研制），不仅能够抑制多种病原真菌，还可以诱导并激发植物自身免疫功能，已在农业部登记为新农药。但是一般情况下木霉菌株对多菌灵敏感，因此多菌灵在土壤中的残留影响了木霉的生防效果。筛选和选育高效降解多菌灵的生防木霉菌，将实现生防和降解多菌灵功能的有机结合。目前，木霉菌的改良技术主要有物理/化学诱变育种，原生质体融合，插入突变及基因转化等。Papavizas等曾用紫外线诱变木霉菌，获得了对苯菌灵等杀菌剂有抗性的菌株（Papavizas G C. Genetic manipulation to improve the effectiveness of biocontrol fungi for disease control. Ser Ecol Appl Microbio. NewYork, 1987: 193-212）。Harman（1993）等通过原生质体融合技术选出比亲本菌株防治效果更好的融合子T22（Harman G E. The genetic nature and biocontrol ability of progeny from protoplast fusion in Trichoderma . Biotechnology in plant disease control. Wiley Liss Press. 1993, 237-255）。然而，上述所获得的木霉菌株只是在生防方面或者抗药性方面得到了改良，功能相对比较单一。如果生防木霉菌株在抗药的同时，又具有农药残留降解作用，这样对受农药残留污染的土壤环境具有一定的生物修复效果。因此，选育兼具降解多菌灵能力和生防能力的菌株，应用到生产上可以减少化学杀菌剂的使用，同时降解土壤中的多菌灵，从源头上有效控制多菌灵农药残留的污染，从农业生产环节保障食品安全。
原生质体融合技术通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。木霉原生质体融合育种技术不但可以改良菌种遗传形状、提高有用代谢产物产量，还可以综合不同菌株代谢特征，在工业生产和遗传育种上展示出美好的应用前景。通过该技术选育的菌株，克服了转基因技术中生物安全性问题。同时在选育过程中，可以打破菌株的种属界限，实现远缘菌株之间的融合，并且实现定向育种，因此，在微生物育种方面具有较好的应用前景。
发明内容
本发明通过对分离获得的可降解多菌灵的哈茨木霉Tr1(生物菌种保藏编 号为CGMCC No.5210)和分离获得的绿色木霉LTR-2(生物菌种保藏编号为CGMCC No.1498)进行原生质体融合，然后通过抗药性标记筛选，获得4株融合子，通过对多菌灵的降解试验以及生防效果检测，最终获得一株高效降解多菌灵的生防木霉F18，分类命名为木霉Trichoderma sp.，其生物菌种保藏编号为：CGMCC No.9486，保藏日期为：2014年8月5日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
木霉Tr1在PDA平板上菌落初期气生菌丝呈白色致密丛束状，边缘松散，呈发散状生长，背面初期无色，后期出现菌丝产孢区，颜色从浅绿渐至深绿色。分生孢子梗从菌丝侧枝生出，呈十字轮生排列，顶生分生孢子，分生孢子光滑，亚球形至卵形。通过一系列培养形状及分子生物学检测方法，经鉴定为哈茨木霉(Trichoderma harzianum)。该菌可抑制植物真菌的生长，但长势较慢。该菌显著特征能够降解多菌灵，14D内对多菌灵的降解率达到了55.47％。
木霉LTR-2在PDA平板上生长迅速，菌丝层较厚，致密丛束状，初期为白色，平坦，后期因产生分生孢子而呈深绿色，产孢区常排列成同心轮纹状。绿色木霉LTR-2菌株具有较高的酶活性，用于植物抗生素的制备及土传植物病害的生物防治制剂的配制。该菌对多菌灵敏感，在多菌灵浓度为10μg/ml的培养基中均不生长。
制备上述生防木霉F18的方法，具体步骤如下：
（1）菌丝培养：将哈茨木霉Tr1和绿色木霉LTR-2分别接种在PDA平板上，28℃培养3-5天，用无菌水制备哈茨木霉Tr1和绿色木霉LTR-2的分生孢子悬浮液，最终悬浮液浓度为1×106个/mL，按照占PD液体培养基体积的1%的接种量将孢子悬浮液分别转接到PD液体培养基中，28℃摇床培养20h；
其中，
PD培养基：马铃薯200g，煮后取汁，葡萄糖15g，去离子水1L，115℃灭菌30min。
PDA培养基：PD培养基1L，琼脂10g，115℃灭菌30min。
（2）原生质体的制备：
① 取灭菌后的50mL的离心管，称重，计为W1；
② 将PD液体培养基中培养好的哈茨木霉Tr1和绿色木霉LTR-2的菌丝分别用3层无菌擦镜纸过滤，然后用无菌水冲洗3次，再用渗透压缓冲液冲洗3次；
③ 将冲洗后的菌丝体转入50mL的离心管中，称重，计为W2，菌丝体的湿重为W2-W1；
④ 加入酶裂解液，菌丝体与酶裂解液的重量体积比(45-55)mg:1mL；优选的，重量体积比为50mg:1mL；
⑤ 在30℃，50rpm的条件下进行酶解1.5-2h(1.5h)，吸取酶解液，置于显微镜下观察，并用血球计数板计算原生质体数；
⑥ 镜检结果显示有大量原生质体形成后，利用3层无菌擦镜纸过滤酶解液中的菌丝，然后用渗透压缓冲液冲洗3次，将虑液和冲洗液混合后4℃，4000rpm离心15min，弃上清，将沉淀用STC溶液洗涤，然后用STC溶液将沉淀悬浮，调整悬浮液中原生质体的浓度，使其为1×106cfu/mL。
其中，
渗透压缓冲液：0.7mol/L KCl，0.1mol/L PBS，pH5.8。
上述渗透压缓冲液中0.1mol/L PBS溶液：取A液92mL，B液8mL，混匀，加入100ml去离子水，即为0.1mol/L PBS；
A液：NaH2PO4 H2O 27.6g，加蒸馏水溶解，定容至1L；
B液：Na2HPO47H2O 53.6g，加蒸馏水溶解，定容至1L。
酶裂解液：溶菌酶和蜗牛酶分别溶于渗透压缓冲液中，配成浓度为5mg/mL的酶液，0.22μm分别过滤除菌，使用前按照体积比为2:1混匀使用。
STC溶液：0.6M 山梨糖醇，0.01M Tris-Cl，0.01M CaCl2，pH 7.5，115℃高压灭菌30min。
（3）原生质体融合
分别取哈茨木霉Tr1和绿色木霉LTR-2的原生质体各500μl，混匀，4℃，4000rpm离心15min，弃上清，向原生质体中缓慢滴加2.6mL 40% PEG8000溶液，30℃培养30min，4℃,4000rpm离心10min，弃上清，向原生质体中加入2mL STC溶液，重悬浮，将悬浮液涂布到再生培养基平板上，28℃培养至平板上长出菌落。
其中，
40% PEG溶液：40% PEG8000，10mmol/L Tris-Cl，10mmol/L CaCl2，pH 7.5。
再生培养基：PDA培养基，0.3mol/L KCl，0.3mol/L环己六醇。
（4）融合子的筛选
通过抗药性筛选、多菌灵降解筛选、平板对峙培养、稳定性检测，获得生防木霉F18。
木霉融合子F18的菌剂制备方法如下：
采用固体PDA培养基，将该木霉融合子F18接种在PDA平板上，28℃下培养48h后，将培养好的木霉菌种转接到液体PDA培养基中，28℃摇床培养72h。将液体培养好的木霉菌株按照1%（v/w）的接种量转接到小麦培养基中，27-30℃扩大培养3d。清洗已培养好的木霉菌株，制成7×109个/ml的木霉孢子悬浮菌液。
上述所得到的木霉孢子悬浮液可按照常规工艺流程制成商品微生物制剂（微生物制剂选自可湿性粉剂、微乳剂、悬浮剂、水剂、乳油、水悬乳剂。），获得的菌剂用于本发明中盆栽防病试验及室内模拟多菌灵污染土壤的修复试验。
菌剂制备中小麦培养基具体配方实例如下：
称取1000g麦粒，清洗干净后，加10L清水浸泡过夜，第二天煮沸至不发硬为止，同时用手感觉麦粒不发粘，分装广口玻璃瓶40瓶，121℃，20min高压灭菌，两次。
应用本发明所述木霉（Trichodermasp.）融合子F18发酵菌液制得的微生物制剂，可用于防治植物真菌病害，同时对受到多菌灵污染的土壤进行生物修复。
木霉等菌种的育种通常采用杂交育种、紫外诱变育种、分子育种等手段进行，其中杂交育种、紫外诱变育种效率低，易导致负突变、遗传形状不稳定等缺点，分子育种是通过基因导入，从而培育出一定要求的育种方法，存在生物安全性问题。原生质体融合是新发展起来的一种细胞工程技术，是在没有细胞壁阻碍的条件下，由PEG（聚乙二醇）助融，使两个亲株整套基因相互接触、互换、组合，得到多种类型的重组子，从而获得新的优秀菌株的技术。该技术具有重组频率高、受结合型限制小、遗传物质传递完整且不需要完全了解作用机制等优点。本发明主要是通过营养缺陷型、抗药性标记及荧光染色标记等筛选融合子，工作过程繁琐，工作量较大。本发明是已获得一株可降解多菌灵的亲本菌株基础上，通过菌丝的生长、形态、色素，原生质体的灭活时间等，确定另外一株亲本作为灭活菌株，然后通过菌丝形态、多菌灵降解特性及拮抗作用进行了融合子的筛选，本发明具有实用性，避免了亲本特性的改变。
附图说明
图1为木霉Tr1原生质体图；
图2为木霉融合子F18及其亲本菌株在含多菌灵的抗药平板上的生长状况。其中，LTR-2作为亲本菌株，对多菌灵敏感，在含药平板上不生长。Tr1在含药平板上生长良好；
图3为亲本菌株Tr1及木霉融合子F18对多菌灵降解效果柱形图；
图4为木霉融合子F18对病原真菌Rhizoctorzia solani Rs21的菌丝缠绕现象图；
图5为利用木霉融合子F18可湿性粉剂处理灭菌土后多菌灵每周含量；
图6为利用木霉融合子F18可湿性粉剂处理自然土后多菌灵每周含量。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1 一种生防木霉F18及其制备方法
一株高效降解多菌灵的生防木霉F18，其生物菌种保藏编号为：CGMCC No.9486，保藏日期为：2014年8月5日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
制备所述木霉F18的方法，具体步骤如下：
（1）菌丝培养：将哈茨木霉Tr1（木霉Tr1原生质体如图1所示）和绿色木霉LTR-2分别接种在PDA平板上，28℃培养3-5天，用无菌水制备哈茨木霉Tr1和绿色木霉LTR-2的分生孢子悬浮液，最终悬浮液浓度为1×106个/mL，按照占PD液体培养基体积的1%的接种量将孢子悬浮液分别转接到PD液体培养基中，28℃摇床培养20h；
其中，
PD培养基：马铃薯200g，煮后取汁，葡萄糖15g，去离子水1L，115℃灭菌30min。
PDA培养基：PD培养基1L，琼脂10g，115℃灭菌30min。
（2）原生质体的制备：
① 取灭菌后的50mL的离心管，称重，计为W1；
② 将PD液体培养基中培养好的哈茨木霉Tr1和绿色木霉LTR-2的菌丝分别用3层无菌擦镜纸过滤，然后用无菌水冲洗3次，再用渗透压缓冲液冲洗3次；
③ 将冲洗后的菌丝体转入50mL的离心管中，称重，计为W2，菌丝体的湿重为W2-W1；
④ 加入酶裂解液，菌丝体与酶裂解液的重量体积比(45-55)mg:1mL；
⑤ 在30℃，50rpm的条件下进行酶解1.5-2h，吸取酶解液，置于显微镜下观察，并用血球计数板计算原生质体数；
⑥ 镜检结果显示有大量原生质体形成后，利用3层无菌擦镜纸过滤酶解液中的菌丝，然后用渗透压缓冲液冲洗3次，将滤液和冲洗液混合后4℃，4000rpm离心15min，弃上清，将沉淀用STC溶液洗涤，然后用STC溶液将沉淀悬浮，调整悬浮液中原生质体的浓度，使其为1×106cfu/mL。
其中，
渗透压缓冲液：0.7mol/L KCl，0.1mol/L PBS，pH5.8。
上述渗透压缓冲液中0.1mol/L PBS溶液：取A液92mL，B液8mL，混匀，即为0.2mol/L PBS；
A液：NaH2PO4 H2O 27.6g，加蒸馏水溶解，定容至1L；
B液：Na2HPO47H2O 53.6g，加蒸馏水溶解，定容至1L。
酶裂解液：溶菌酶和蜗牛酶分别溶于渗透压缓冲液中，配成浓度为5mg/mL的酶液，0.22μm分别过滤除菌，使用前按照体积比为2:1混匀使用。
STC溶液：0.6M 山梨糖醇，0.01M Tris-Cl，0.01M CaCl2，pH 7.5，115℃高压灭菌30min。
（3）原生质体融合
分别取哈茨木霉Tr1和绿色木霉LTR-2的原生质体各500μl，混匀，4℃，4000rpm离心15min，弃上清，向原生质体中缓慢滴加2.6mL 40% PEG8000溶液，30℃培养30min，4℃,4000rpm离心10min，弃上清，向原生质体中加入2mL STC溶液，重悬浮，将悬浮液涂布到再生培养基平板上，28℃培养至平板上长出菌落。
其中，
40% PEG溶液：40% PEG8000，10mmol/L Tris-Cl，10mmol/L CaCl2，pH 7.5。
再生培养基：PDA培养基，0.3mol/L KCl，0.3mol/L环己六醇。
（4）融合子的筛选
① 抗药性筛选：将再生培养基上长出的菌落转接至含有多菌灵的PDA培养基平板上，进行融合子的筛选，最终获得12株融合子，其中融合子F18及其亲本菌株如图2所示。
② 多菌灵降解筛选：将步骤①中获得的融合子及木霉Tr1接种到PDA培养基上培养5d，用接种环挑取菌株的分生孢子于装有玻璃珠和50mL无菌水的三角瓶中，28℃ 200r/min振荡培养30min，打散其孢子，采用血球计数板对孢子悬浮液计数，确定分生孢子浓度为106cfu/mL。
按照无机盐培养基的5%的接种量接入孢子悬浮液，28℃摇床培养7d，以不接菌的无机盐培养基为对照。培养完毕，用乙酸乙酯萃取培养基中的多菌灵残留量，进行旋转蒸发，利用甲醇/乙酸混合液（体积比=9:1）定容，采用高效液相色谱法（HPLC）进行分析。其中，流动相为乙腈/乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4.7)=1/2。流速为1mL/min，进样量为10uL，可变波长检测器的工作波长为281nm，采用外标法按峰面积定量，按照下列公式计算多菌灵降解率：
X=(A-B)/A
式中，X为降解率，A为未接菌处理液中多菌灵浓度，B为接菌处理液中多菌灵浓度。
通过上述筛选，发现木霉菌株F2、F13、F15、F18共4株木霉融合子在无机盐培养基内对多菌灵的降解率在70%左右，其中，木霉菌株F18对多菌灵的降解7d达到了71.62%，与亲本菌株相比，提高了8.54%，如图3所示。
③ 平板对峙培养：选取供试病原菌灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea Pers）、畸雌腐霉菌（Pythium irregulare）P15、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）Rs21在PDA培养基上培养3d后，用灭菌打孔器取带菌丝的圆盘型培养基块，将圆盘型带有病原菌的培养基块放在PDA平板一侧，在距该培养基块3cm处放置带有木霉融合子F2、F13、F15、F18及亲本菌株Tr1和亲本菌株LTR-2，28℃下培养72h天后记录抑菌带的宽度。
以供试病原菌灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea Pers）、畸雌腐霉菌（Pythium irregulare）P15、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）Rs21为拮抗对象，检测木霉融合子F2、F13、F15、F18及亲本菌株Tr1、亲本菌株LTR-2的拮抗能力。木霉融合子F18对病原真菌Rhizoctorzia solani Rs21的菌丝缠绕现象如图4所示。表1显示，木霉融合子F18相对于其他融合子，抑菌能力较强，尤其对病原菌灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea Pers）的抑制率达到61.90%，较亲本菌株Tr1及LTR-2分别提高了22.61%和14.28%，在0.01水平上极显著差异。该融合子对畸雌腐霉菌（Pythium irregulare）P15的抑菌效果同亲本菌株相比，虽然抑菌率只有78.43%，但在0.01水平上差异不显著。
表1 木霉及其融合子对病原菌的抑菌率（%）
注：上述实验均三个重复，大写字母表示0.05水平上的差异，小写字母表示0.01水平上的差异。
通过对上述融合子的筛选，最终选择融合子F18进行后续试验。
5）遗传性状稳定性验证
将筛选后的菌株F18在PDA平板上连续转接10代，然后转接到抗药平板上，检测菌株F18的遗传性状稳定性。同时检测菌株对多菌灵的降解率。结果发现该菌转接10代后，仍然可以在含多菌灵的无机盐平板上快速生长。再次检测对多菌灵的降解率，发现F18对多菌灵降解率为72.14%，与最初筛选得到该融合子时测定的多菌灵降解率一样。因此，该菌株具有遗传稳定性。
实施例2.木霉融合子F18菌剂对小麦纹枯病的防治盆栽试验
1）种子及其处理
麦种为中优-16，购于山东省农科院。首先利用70%酒精进行消毒处理，再用无菌水进行清洗，最后置于30℃培养箱中进行催芽。
2） 盆栽用土及其处理
取山东省科学院生物所院中的土壤，过筛除去石块，杂草等杂物，按照体积比1:1加入购买的草炭土，将土样混匀，121℃、120min灭菌40min，自然风干后备用。
3）盆栽方法
用天平称1000克灭菌土样，倒入花盆中，每盆接入8粒布满病原菌的小米粒（各杯中放置位置相同），用天平称300克灭菌土样覆盖病原菌，在表面依次均匀撒入催芽后的种子25粒（保证每杯中20棵成活），称300克灭菌土样覆盖种子（注：300g灭菌土杨中包括0.5g木霉融合子F18可湿性粉剂或者0.5g 50%多菌灵可湿性粉剂，每杯的总土样须相同1600g）。每个处理设立3个重复。另外设对照组。温室温度为10-25℃，湿度为60%，定期浇水。
4） 调查
小麦种植40D后，调查小麦纹枯病病情。小麦纹枯病病情主要依据《中华人民共和国农业行业标准》中纹枯病测报调查规范：严重度指病茎上病斑宽度占茎杆周长的比例，用分级法表示。
0级：（无病）健株；
1级：叶鞘发病，或茎杆上病斑宽度占茎杆周长的1/4以下；
2级：茎杆上病斑宽度占茎杆周长的1/4～1/2；
3级：茎杆上病斑宽度占茎杆周长的1/2～3/4；
4级：茎杆上病斑宽度占茎杆周长的3/4以上，但植株未枯死；
5级：病株提早枯死，呈枯孕穗或枯白穗。
以上计算方式：
病株率%=(每个处理的病株数/每个处理的总株数)×100
病情指数%=∑（各病级×各级株数）/（最高病级×总调查株数）×100
防效%=（对照病情指数－处理病情指数）/对照病情指数×100
木霉F18可湿性粉剂处理小麦纹枯病的盆栽试验结果见表2。可见木霉F18可湿性粉剂对小麦纹枯病具有一定的防治效果，其防效达到了73.88%，而50%多菌灵可湿性粉剂对小麦纹枯病的防治效果为74.52%，二者的防治效果在0.05水平上差异不显著。因此，利用木霉F18可湿性粉剂代替多菌灵进行小麦纹枯病的防治，该方法是可行的。
表2 木霉F18可湿性粉剂处理小麦纹枯病的盆栽试验效果
注：数据为三次重复的平均值。
实施例3. 实验室条件下模拟木霉F18菌剂对多菌灵农残污染土壤的修复研究
1）木霉F18可湿性粉剂在灭菌土壤中对多菌灵的降解效果
将5g多菌灵和5g木霉F18可湿性粉剂放入150ml无菌水中制成悬浮液，再与1000g过10目筛的灭菌土均匀混合，调节含水量达到15%，然后放入已灭菌的花盆内。将盆口用纱布包扎好，于25℃保湿培养，每隔7天取10g土样样测定多菌灵含量。同时设5g多菌灵、5g固体培养基（不接种木霉F18可湿性粉剂）和1000g过10目筛的灭菌土混合为对照。每处理重复3次。以上操作均需在超净工作台上进行无菌操作。采用HPLC检测土壤中的多菌灵含量。
灭菌土壤中，木霉F18可湿性粉剂对多菌灵的降解效果见图5。在接种F18的灭菌土中，同未接种的灭菌土相比较，多菌灵降解非常明显，在接种第8个星期时，多菌灵含量仅为19.08%，而对照中多菌灵含量为71.12%，降解率为73.17%。相对于接种土壤来说，对照土壤的降解速度非常慢，表明F18是一株降解性能优良的菌株。
2）木霉F18可湿性粉剂在自然土壤中对多菌灵的降解效果
取试验田土壤，过10目筛。将多菌灵，木霉Tr1可湿性粉剂和适量水混匀，制成悬浮液，与已过筛的自然土混合均匀，调节含水量为15%。同时设加入等量的固体培养基（不接种木霉F18可湿性粉剂）、多菌灵和自然土混合为对照处理，每处理重复三次。将土盆置于25℃保湿培养，每隔7天取10g土样测定多菌灵在土壤中的含量。采用HPLC检测土壤中的多菌灵含量。
自然土壤中接种F18菌剂，对多菌灵的降解速度快于对照土壤，如图6所示。接菌8个星期后，土壤中多菌灵含量仅有10.06%，而对照土壤中的多菌灵含量为46.68%，8周后多菌灵降解率为78.45%。与灭菌土试验相比，多菌灵在自然土中的降解要比在灭菌土中降解的快，这可能是土壤存在的土著微生物同木霉F18的共同代谢降解作用，提高了对多菌灵的降解速度，缩短了降解时间。
Claims (9)
1.一种生防木霉F18，其特征在于，所述生防木霉F18的生物菌种保藏编号为：CGMCC No.9486，保藏日期为：2014年8月5日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.制备如权利要求1所述的生防木霉F18的方法，具体步骤如下：
（1）菌丝培养：将哈茨木霉Tr1和绿色木霉LTR-2分别接种在PDA平板上，28℃培养3-5天，用无菌水制备哈茨木霉Tr1和绿色木霉LTR-2的分生孢子悬浮液，最终悬浮液浓度为1×106个/mL，按照占PD液体培养基体积的1%的接种量将孢子悬浮液分别转接到PD液体培养基中，28℃摇床培养20h；
（2）原生质体的制备：
① 向哈茨木霉Tr1和绿色木霉LTR-2的菌丝体中加入酶裂解液，菌丝体与酶裂解液的重量体积比(45-55)mg:1mL；
②在30℃，50rpm的条件下进行酶解1.5-2h，吸取酶解液，置于显微镜下观察，并用血球计数板计算原生质体数；
③ 有大量原生质体形成后，利用3层无菌擦镜纸过滤酶解液中的菌丝，然后用渗透压缓冲液冲洗3次，将滤液和冲洗液混合后4℃，4000rpm离心15min，弃上清，将沉淀用STC溶液洗涤，然后用STC溶液将沉淀悬浮，调整悬浮液中原生质体的浓度，使其为1×106cfu/mL；
（3）原生质体融合
分别取哈茨木霉Tr1和绿色木霉LTR-2的原生质体各500μl，混匀，4℃，4000rpm离心15min，弃上清，向原生质体中缓慢滴加2.6mL 40%的PEG8000溶液，30℃培养30min，4℃,4000rpm离心10min，弃上清，向原生质体中加入2mL STC溶液，重悬浮，将悬浮液涂布到再生培养基平板上，28℃培养至平板上长出菌落；
（4）融合子的筛选
通过抗药性筛选、多菌灵降解筛选、平板对峙培养、稳定性检测，获得可高效降解多菌灵的生防木霉F18。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中菌丝体与酶裂解液的重量体积比为50mg:1mL。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中菌丝体在30℃，50rpm的条件下进行酶解1.5h。
5.如权利要求1所述的生防木霉F18按照常规工艺制备成微生物制剂。
6.根据权利要求5所述的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂选自可湿性粉剂、微乳剂、悬浮剂、水剂、乳油、水悬乳剂。
7.如权利要求1所述的生防木霉F18在降解多菌灵方面的应用。
8.如权利要求1所述的生防木霉F18在防治小麦纹枯病方面的应用。
9.如权利要求5或6所述的微生物制剂在防治小麦纹枯病方面的应用。
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