CN104293677A

CN104293677A - 具有杀线虫功能的寡孢节丛孢基因工程菌株及其应用

Info

Publication number: CN104293677A
Application number: CN201410138594.2A
Authority: CN
Inventors: 梁连铭; 杨金奎; 莫媛媛; 张克勤
Original assignee: Yunnan University YNU
Current assignee: Yunnan University YNU
Priority date: 2014-04-08
Filing date: 2014-04-08
Publication date: 2015-01-21
Anticipated expiration: 2034-04-08
Also published as: CN104293677B

Abstract

本发明涉及一种具有杀线虫功能的食线虫真菌寡孢节丛孢基因工程菌株及其应用，属生物农药技术领域。本发明的生产菌株为：寡孢节丛孢基因工程菌株（Arthrobotrys oligosporaΔMad1），保藏号为CCTCC M 2013439。寡孢节丛孢基因工程菌株在制备用于防治线虫制剂中的应用。本发明的有益效果在于：1、寡孢节丛孢基因工程菌株与出发菌株具有相同的生长速率和形态。其与野生菌株的不同之处在于当其培养在在含有0.1%-0.5%的硝酸钠或者0.1%-0.%的尿素或者0.1%-0.5%的酵母提取物的水琼脂培养基上时会产生比出发菌株提高2倍以上的粘性三维菌网。2、当菌株培养在固体CMA培养基上时，其捕捉线虫的能力提高5倍以上，24小时线虫捕捉率达95%以上，能够在制备杀线虫制剂中应用。

Description

具有杀线虫功能的寡孢节丛孢基因工程菌株及其应用

技术领域：

本发明涉及一种具有杀线虫功能的食线虫真菌寡孢节丛孢（Arthrobotrys oligospora）基因工程菌株及其应用，属生物农药技术领域。

背景技术：

植物寄生线虫是世界范围内普遍发生的植物病害。据统计，全球每年因植物寄生线虫造成的直接经济损失高达1570亿美元，其中尤以根结线虫、胞囊线虫最为严重。在我国，植物寄生线虫危害蔬菜、粮食、烟草、油料、水果等几乎所有的农作物，对许多重要农作物的危害已经超过其它植物病害，且呈逐年增加的趋势。。

目前，我国对植物寄生线虫的防治主要依赖于化学农药。但化学农药在毒杀线虫的同时，对其他生物的高毒性，在农作物和土壤环境中的残留等，都严重影响食品安全与环境生态安全。在国家颁布的绿色食品禁用农药名单中，包括克线磷、灭线磷、溴甲烷、涕灭威等几十个化学杀线虫剂几乎全部被禁用，使山东、广东、海南、云南等蔬菜基地根结线虫发生呈上升趋势。目前我国蔬菜种植面积已达近3亿亩。随着经济发展，我国社会正由温饱型向全面小康型转变，人民生活也由吃饱向吃好转变，健康绿色食品是现代生活的基本需求。因此，研究开发生物杀线虫剂已经成为现代农业可持续发展中必须解决的关键问题。

近年来，随着主要化学杀线虫剂使用受限，利用自然界中线虫天敌微生物开展生物防治成为国内外研究的热点。与传统化学农药相比，微生物制剂具有安全、无污染、无残留的优点，同时也存在防效不高的问题。

寡孢节丛孢是典型的线虫天敌真菌，通过产生捕食器官——三维菌网捕捉继而杀死线虫，是一类非常重要的生防真菌资源。与传统化学农药相比，微生物制剂具有安全、无污染、无残留的优点，同时也存在防效不高的问题。寡孢节丛孢三维菌网的数量是捕捉线虫效率的关键因子，因此通过改造原始菌株提高捕食器官的数量，是获得高效杀线虫菌株的有效途径。目前，关于植物寄生线虫生物防治的报道日益增多，然而没有任何通过改造捕食线虫真菌提高捕食器官数量来提高杀线虫活性的报道。

Mad1是一种真菌细胞壁蛋白。昆虫血清能够诱导昆虫病原真菌金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)在分生孢子和芽生孢子表面表达一种富含丝氨酸/苏氨酸且高度糖基化的细胞壁蛋白Mad1。当Mad1在酿酒酵母中异源表达时，使酵母细胞粘附于昆虫体表。同时发现Mad1的表达对细胞骨架定位和细胞周期相关基因的表达非常重要。敲除Mad1基因后，金龟子绿僵菌萌发延缓，抑制了芽生孢子的产生，并且降低了对烟草天蛾(Manduca sexta)幼虫的侵染能力。此研究提示，Mad1不但在孢子表面起粘附作用，而且影响其它基因的表达。我们的研究发现，当捕食线虫真菌寡孢节丛孢敲除Mad1编码基因后，其捕食器官（粘性三维菌网）的产生数量明显增多，提高了真菌对线虫的捕捉效率。

经文献检索，未见与本发明相同的公开文献报道。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种具有杀线虫功能的食线虫真菌寡孢节丛孢（Arthrobotrys oligospora）基因工程菌株及其应用。

本发明通过对一株寡孢节丛孢标准菌株进行基因改造，提高捕食器官数量的研究，开发高效生物杀线虫制剂。

本发明通过对寡孢节丛孢标准菌株（购自美国标准生物品收藏中心（ATCC）菌株号：ATCC24927）进行基因工程改造，通过同源重组的方法敲除其细胞壁蛋白Mad1编码基因，获得一株具有产生大量三维菌网能力的基因工程菌株（Arthrobotrys oligosporaΔMad1），YMF1.03925。该工程菌株已于2013年9月21日保藏在中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：中国武汉武汉大学；保藏号为CCTCC M2013439。

Mad1的基因序列（SEQ ID NO:1）如下：

ATGAAGGGTGCAATCCAATTCCTCGGAGCCTTGGCTGCAGTTCAGGCAGTTTCCGCTACCTATATCGACTGGACACAACCTTTCAACAGCTACGACTGCGGTGGAAAGCAATGCGGTGGCCGTCCAAAGTTCGAGCCTCCAGCATACTCCAATGAGAGATGTACCCCACAGCAGAACACCGGATACGATTTCTCTGATGCTCCAGATGGTGATTTGCCAAAGTACGATGACTTTGACTTCTCTGGATACAAGTGCCAAAAGAGCAAGCTCCAGAGGAGATCCGGACGTGGCAGTGGAAGCAAATGCGCTTCCTCCTACGTCGAGCCAGAGACCTACAGCAATGAAATCAAGTGCGGCAAGAAGTTCTCTGTTGACGAATTCGACATCTCTTTGGAGTACGAGTCCGTTATTGAATTCCACTATGGCATGCCTGACGGTTCCAGCTGCAAGCACGTCAGCAAGTGCGGAACTGGTATCACTCCTGTCAAGAACACCCAGTGCGGTGGAGCCAAGAGCGTGAAGTGCAAGATCCACAAGAGCTCCCAGAACAAGAAGAAGTGCAAGTTCAATATCCATCATATCAAGTTCCGATGTGACAAGCCAAGCACTACTTCCGCCCCTGTTCCAGCTACAACCAGCGAGCCAGCTCCATGCACTGAGTACTCTTGCACTGCTACTGACACTACTACCGAACCTGCTCCAACTGAGCCTGCCCCAACTGAGCCAGCTCCATGCACTGAGTACTCCTGCACTGCTACTGATACCACCACCGAGCCTGCTCCAACTGAACCTGCTCCATGCACTGAGTACTCTTGCACTGCTACCGAcACTACCACTGAGCCCGCTCCATGCACTGAGTACTCTTGCACTGCTACTGATACTACCACCGAGCCAGCTCCAACTGAGCCAGCCCCAACCGAGCCAGCTCCATGCACTGAGTACTCTTGCACTGCTACCGACACCACCACCGAGCCTGCTCCAACTGAGCCTGCCCCAACCGAGCCAGCTCCATGCACTGAGTACTCTTGCACTGCTACTGATACTACCACCGAGCCTGCTCCAACTGAACCTGCTCCATGCACTGAGTACTCCTGCA CTGCCACCGAGACTACTTCTGAAGCCGTCCCAACCACTACTGACGAGGCTCCATGCACTGACTACTCTTGCACCGCTACTGAGGCCGTCCCAACTACTACTGACGAGGCTCCTTGCACTGAGTACTCCTGCACCGGTGTTCCAACTTCTGAGGCTGTTCCAACCACTTCTGACGACGTCCCCACTACCACTGATGTCTATATTCCACCCACTGATGTCTATGTCCCACCCACTGACATCTACGTCCCACCTGCCAACACCAGCATCCCATACGAGACTCCTTCTCCAAGCGAGACTGAGACCCTCCCCCCAAGCGGAACTGATGTCTACACTACCTTGCCCAGCGTTCCAGTTGAGACCGGCTGCCCACCAGTCCTCCCACAATGTATGGAGACCTGGACCAAGATTACCCAGTGTGTCAACAGCGGTGATGTCAAGTGTCTTTGCCCCAACCCAGAGTACATCAAGAGCGTCGCTGAGTGCGTTGAAGCCTGGGGTGTCGATGATGACGAAGTCGCCAAGGCTCTCGAGTATATGCAAGGTCTCTGCGCTGAGCACATCCCAGAGAATCCAGCCATTGTTACCTGCGTTCCTACCTATGTCACTCTTCCACCAGTCACCACCGGTGCCTCCACCGTCACTGTCTCTACCACCGTCGTTGTTCCAGTCACCACTGCTTCACCAGAAGAGACCAACAAGCCAGGCTACGTTCCAGTCTTCACCACTGAGACTGTTATCAGGACCGTCACCGTCTGCCCAGTCAAGCTTGTCACCACCGAGCCATCCAAGCCAGTTCTCGTTCCAGGAACCATCACTGCTCCTCCATACGTTCCACCAACTGCTCCAGCTACCATCCCGGCCACTGTCCCAGCTGAGGCTACTACCCCACCAGTTGAATATGCACCATCTACCTTGATGACTGCCTACCCAACTGTTCCAGTTCCGGTTAACAACACCACTCCAAACCCACCAATCGCCACTGGCGCTGCTTCTTCCTTCAAGGCCTTCAGCACCGTCATGCTTGCCGGTGTCATTGGTCTCACTGCCTTGATCATGGCTTAA

Mad1的氨基酸序列（SEQ ID NO:2）如下：

MKGAIQFLGALAAVQAVSATYIDWTQPFNSYDCGGKQCGGRPKFEPPAYSNERCTPQQNTGYDFSDAPDGDLPKYDDFDFSGYKCQKSKLQRRSGRGSGSKCASSYVEPETYSNEIKCGKKFSVDEFDISLEYESVIEFHYGMPDGSSCKHVSKCGTGITPVKNTQCGGAKSVKCKIHKSSQNKKKCKFNIHHIKFRCDKPSTTSAPVPATTSEPAPCTEYSCTATDTTTEPAPTEPAPTEPAPCTEYSCTATDTTTEPAPTEPAPCTEYSCTATDTTTEPAPCTEYSCTATDTTTEPAPTEPAPTEPAPCTEYSCTATDTTTEPAPTEPAPTEPAPCTEYSCTATDTTTEPAPTEPAPCTEYSCTATETTSEAVPTTTDEAPCTDYSCTATEAVPTTTDEAPCTEYSCTGVPTSEAVPTTSDDVPTTTDVYIPPTDVYVPPTDIYVPPANTSIPYETPSPSETETLPPSGTDVYTTLPSVPVETGCPPVLPQCMETWTKITQCVNSGDVKCLCPNPEYIKSVAECVEAWGVDDDEVAKALEYMQGLCAEHIPENPAIVTCVPTYVTLPPVTTGASTVTVSTTVVVPVTTASPEETNKPGYVPVFTTETVIRTVTVCPVKLVTTEPSKPVLVPGTITAPPYVPPTAPATIPATVPAEATTPPVEYAPSTLMTAYPTVPVPVNNTTPNPPIATGAASSFKAFSTVMLAGVIGLTALIMA

本发明的具有杀线虫功能的食线虫真菌寡孢节丛孢（Arthrobotrys oligospora）基因工程菌株在制备用于防治线虫制剂中的应用。

本发明的有益效果在于：

1、寡孢节丛孢基因工程菌株（Arthrobotrys oligosporaΔMad1）与出发菌株具有相同的生长速率和形态。其与野生菌株的不同之处在于当其培养在在含有 0.1%-0.5%的硝酸钠或者0.1%-0.%的尿素或者0.1%-0.5%的酵母提取物的水琼脂培养基上时会产生比出发菌株提高2倍以上的粘性三维菌网。

2、当菌株培养在固体CMA培养基上时，其捕捉线虫的能力提高5倍以上，24小时线虫捕捉率达95%以上，能够在制备杀线虫制剂中应用具。

附图说明：

图1显示寡孢节丛孢出发菌株和ΔMad1菌株对线虫的捕捉。

具体实施方式：

以下结合附图对本发明作详细描述，但本发明的内容并不局限于此。

一、寡孢节丛孢基因工程菌株（Arthrobotrys oligosporaΔMad1）菌株构建方法

1.构建基因敲除载体；

敲除载体的构建方法如下：5’端和3’端同源重组片段分别用引物5f+5r和3f+3r进行扩增。引物5r和3f的5’端含有29个碱基同源于潮霉素基因（HPH cassette）。5’端片段，3’端片段，潮霉素基因通过融合PCR都是方法得到全长敲除片段。相对于目的敲除基因，潮霉素是以反义链方向进行转录的。

Claims

1.一种具有杀线虫功能的寡孢节丛孢基因工程菌株，其特征在于所述菌株的保藏号为CCTCC M2013439。

2.权利要求1所述的具有杀线虫功能的寡孢节丛孢基因工程菌株在制备用于防治线虫制剂中的应用。