CN102337221B - 莱氏野村菌微菌核诱导产生的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种莱氏野村菌微菌核诱导产生的方法，对莱氏野村菌菌种活化，制备接种体，通过液体发酵培养，获得发酵液，对发酵液进行过滤，弃去上清液，得到微菌核和菌体，该方法可操作性强，重复性好，所用原料易于获取，产生的休眠结构微菌核性能稳定，易于保存，具有很强的杀虫生物活性，可以大批量生产、发酵周期短，生产成本低，为野村菌等虫生真菌制剂的规模化生产提供了新的方法。
Description
技术领域
本发明属于生物制剂领域，具体的说，涉及一种莱氏野村菌微菌核诱导产生的方法。
背景技术
斜纹夜蛾属鳞翅目夜蛾科的一种世界性分布的暴食性农业害虫，危害藤菜、莲藕和十字花科多种蔬菜作物达99科290多种，是我国蔬菜安全生产的重大威胁，造成蔬菜作物大量减产和质量下降。目前害虫防控主要依靠化学防治，化学农药的大量施用导致斜纹夜蛾等夜蛾科害虫抗药性产生，并且污染生态环境、影响蔬菜农产品安全、威胁人民身体健康，还大量杀伤害虫天敌，破坏生态平衡。
近年来，以绿僵菌、白僵菌为代表的真菌生物农药是国际上微生物农药研究的热点之一，具有使用安全、不污染环境、可扩散流行和害虫不易产生抗药性等优点。虫生真菌主要类群为丝状真菌，通常产生菌丝体和分生孢子，少数种类也可产生厚垣孢子。有的植物病原真菌如油菜核盘菌、棉花黄萎病菌等的生活史后期往往在寄主组织内由菌丝体纠集形成菌核或微菌核等休眠结构，以度过不良环境，作为再次接种体感染靶标害虫。
莱氏野村菌[Nomuraea rileyi(Farlow)]属于真菌界、子囊菌门、酵母菌亚门、盘菌纲、粪壳菌纲、肉座菌亚纲、肉座菌目、麦角菌科、野村菌属，是一种世界性广泛分布的虫生真菌，可以感染多种鳞翅目害虫，特别是对多种危害较大的斜纹夜蛾、甜菜夜蛾、粉纹夜蛾、棉铃虫和烟青虫等夜蛾科害虫具有很高的生物活性。目前国内外关于丝状真菌微菌核自然形成的报道寥寥无几，仅见于棉花黄萎病的大丽轮枝菌、微菌核链霉菌、向日葵炭腐菌，未见莱氏野村菌大量诱导产生微菌核的方法。莱氏野村菌微菌核具有耐热、耐旱、抗逆性好、杀虫毒力强等特点。但与目前大量生产使用的丝状真菌基于孢子粉菌体的制剂相比，野村菌产孢因需要光照刺激、产孢条件苛刻、产孢周期长，导致生产成本偏高，产业化难度大。而液体发酵产生的芽生孢子因不耐储存，杀虫活性降低等缺陷，严重制约了莱氏野村菌的规模化生产。因此有必要开发侵染活力高、抗逆性强的莱氏野村菌微菌核粉或高孢粉，为杀虫真菌制剂的创制提供高质量的母药或原粉，解决该菌液固两相发酵中的技术难题，已成为国内外产业化研究的热点之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可大规模生产的莱氏野村菌微菌核诱导产生的方法，所制得沉淀微菌核和菌体具有侵染活力高、抗逆性强的特性。
本发明具体按如下步骤进行：
（1）把莱氏野村菌菌种活化，待用；
（2）接种体制备：将活化的野村菌接种于SMAY培养基上，在25～28℃下连续光照培养144-192h，用0.1%～0.5%的Tween80水溶液将平板上的孢子或菌丝体洗下，配备莱氏野村菌接种体悬浮液；
（3）液体发酵诱导：将接种体加入诱导培养液中进行发酵培养，将所得的发酵液过滤，弃去上清液，得到沉淀微菌核和菌体，干燥，保存；
上述诱导培养液单位体积内所含有的各种原料干物质重量如下：葡萄糖 10~50g/L，酵母膏 5～10g/L，蛋白胨 2～5g/L，KH2PO4 3～5g/L，CaCl2.2H2O 0.7～0.9g/L，MgSO4.7H2O 0.5～0.7g/L，FeSO4.7H2O 0.1～0.2g/L，CoCl2.6H2O 35～40mg/L，MnSO4.H2O 15～20mg/L，ZnSO4.7H2O 15～20mg/L，脱离子水配制；
上述液体发酵的工艺条件为：培养基pH=5.4～6.5，温度为23~28℃，摇床转速为200～250rpm或者发酵罐转速为80～100rpm，培养时间为144～192h。
作为优化，上述诱导培养液单位体积内所含有的各种原料干物质重量如下：葡萄糖 10～40g/L、酵母浸膏 5.0～8.0g/L、蛋白胨 2~3g/L、KH2PO4 3~4g/L、Cacl2.2H2O 0.7~0.8g/L、MgSO4.7H2O 0.6~0.7g/L、FeSO4.7H2O 0.1~0.2g/L、CoCl2.6H2O 36~37mg/L、MnSO4.H2O 16~18mg/L、ZnSO4.7H2O 16~18mg/L，脱离子水配制；上述液体发酵的工艺条件为：培养基pH=5.5～6.0，温度为25~26℃，摇床转速为250rpm或者发酵罐转速为100rmp,培养时间为150～192h；所得到的沉淀微菌核和菌体可以用冻干粉保存。
传统的野村菌产孢需要光照刺激、产孢条件苛刻、产孢周期长、生产成本高，产业化难度大，而且芽生孢子不耐储存，杀虫活性低等缺点。
本发明对产孢条件进行了优化，可以大量生产莱氏野村菌休眠体微菌核的方法，本发明中所用的液体发酵工序操作简单，发酵液易于配制，重复性好，所用的原料易于获取，操作工艺简单，易于控制，产生的休眠结构微菌核性能稳定，易于保存，具有很强的杀虫生物活性，可以进行大规模产业化生产。
微菌核是虫生真菌度过高温、低温或干旱等不良环境的休眠体，是菌丝体互相纠结，菌丝变态分化产生的颜色加深、质地坚硬的菌丝组织体，能够在条件合适时，重新萌动长出菌丝体。微菌核具有抗逆耐储、能够适应高温、干旱等外界不良环境的特点。微菌核作为生物制剂的有效成分，可用于规模化生产新型杀虫真菌农药。
有益效果：
本发明所用的培养液的配制和液体发酵工序可操作性强，重复性好，所用原料易于获取，产生的休眠结构微菌核性能稳定，易于保存，具有很强的杀虫生物活性，本方法可以大批量生产、发酵周期短，生产成本低，为野村菌等虫生真菌制剂的规模化生产提供了新的方法。
附图说明
图1为莱氏野村菌CQNr01菌株液体发酵诱导培养48h的显微观察；
图2为莱氏野村菌CQNr01菌株液体发酵诱导培养96h的显微观察；
图3为莱氏野村菌CQNr01菌株液体发酵诱导培养144h的显微观察；
图4为莱氏野村菌CQNr01菌株液体发酵诱导培养192h的显微观察。
具体实施方式
实施例1
本发明诱导莱氏野村菌产生微菌核的方法如下：
（1）莱氏野村菌的取材：
所用莱氏野村菌菌株分离纯化自重庆沙坪坝区蔬菜地斜纹夜蛾幼虫僵虫体表菌体，经形态与分子鉴定为莱氏野村菌（Nomuraea rileyi）菌株编号为：CQNr01。
（2）菌种活化：
采用SMAY培养基进行活化，pH为5.5，SMAY培养基配制为麦芽糖40g/L、酵母粉15g/L、蛋白胨10g/L、琼脂粉20g/L。
（3）接种体的制备：
将莱氏野村菌CQNr01接种到SMAY平板上，在25℃、光照条件下培养192h，用0.3% Tween80溶液将平板上的孢子和/菌体洗下，调节悬浮液浓度，制备成1.0×107孢子/毫升的接种体悬浮液。
（4）诱导培养液的配方：
葡萄糖：20g/L，酵母膏：6g/L，蛋白胨：6g/L，KH2PO4:4.0 g/L，CaCl2.2H2O:0.8g/L，MgSO4.7H2O:0.6/L，FeSO4. 7H2O:0.1g /L，CoCl2.6H2O：37mg/L，MnSO4.H2O:16mg/L，ZnSO4.7H2O:14mg/L，脱离子水配制；将液体培养液分别以100mL的量分装到250mL三角瓶中，调节pH值为5.5，进行121℃高温高压灭菌30分钟。冷却后接种。
（5）液体发酵工艺为：
按照1:100的体积比把莱氏野村菌CQNr01的接种体接种到发酵培养液中进行发酵培养，发酵工艺条件为培养基pH=5.5，温度为25℃，摇床转速为230rpm，培养时间为192h。
（6）莱氏野村菌微菌核的培养形态与休眠结构观察：
将莱氏野村菌菌株按照上述方法进行液体发酵诱导培养，每天观察液体培养基中的微菌核产生状况。接种后振荡培养24~48h后，分生孢子萌发形成菌丝，菌液颜色未见变化，而培养液粘度及菌体生物量逐渐增加，48h如图1所示；培养72h后后菌液开始变混浊，此时菌悬液中的菌量继续增加，部分菌丝体前端开始膨大，明显加粗；在光学显微镜下观察未见微菌核产生，；培养96h后，发酵菌液逐渐变红而粘稠，取样在显微镜下观察，可见由数十个细胞的微菌核休眠结构。微菌核呈褐红色，边缘光滑，中间紧密，如图2所示；培养144h后，菌液变得更加粘稠，颜色呈深红色，微菌核数量剧烈增加，有少量的微菌核周围开始萌发菌丝，如图3所示；192h后微菌核数量不再明显增加，部分微菌核四周形成细长的菌丝，如图4所示；用此法产生的微菌核经过干燥后进行生物学特性测定，具有明显的侵染活性和抗逆性。
（7）将所得莱氏野村菌CQNr01的发酵液分别过滤，弃去上清液，得到沉淀微菌核和菌体，低温干燥，计数保存。
（8）通过以上方法所得出的微菌核数量在72h、96h、120h、 144h和192h分别为0、2.5×104、4.0×106、1.9×108个/mL和2.0×108个/mL。
实施例2
本实施例其他的步骤与实施例1完全相同，不同的有以下几点：
（1）所用莱氏野村菌菌株分离纯化自云南昆明蔬菜地斜纹夜蛾僵虫体表菌体，菌株编号为：YNNr02。
（2）诱导培养液的配方如下：葡萄糖：10g/L，酵母膏：8g/L，蛋白胨：8g/L， KH2PO4:5.0g/L，CaCl2.2H2O:0.85g/L，MgSO4.7H2O:0.7/L，FeSO4.7H2O:0.12g/L，CoCl2.6H2O：35mg/L，MnSO4.H2O:15mg/L，ZnSO4.7H2O:15mg/L，脱离子水配制。
（3）发酵培养工艺的条件如下：培养基pH=6.0，温度为28℃，液体发酵罐转速为80rpm，培养时间为150h。
（4）通过以上方法所得出的微菌核数量在72h、96h、120h、 150h分别为0、1.5×104、1.7×106、1.5×108个/mL。
实施例3
本实施例其他的步骤与实施例1完全相同，不同的有以下几点：
（1）本实施例所用莱氏野村菌菌株分离纯化自山东临沂蔬菜地粘虫僵虫体表菌体，菌株编号为：SDNr02。
（2）诱导培养液的配方如下：葡萄糖：30g/L，酵母膏：9g/L，蛋白胨：9g/L，KH2PO4:4.5g/L，CaCl2.2H2O:0.9g/L，MgSO4.7H2O:0.5/L，FeSO4. 7H2O:0.15g/L，CoCl2.6H2O：36mg/L，MnSO4.H2O:18mg/L，ZnSO4.7H2O:18mg/L，脱离子水配制。
（3）发酵培养工艺的条件如下：培养基pH=6.0，温度为24℃，发酵罐转速为90rpm，培养时间为168h。
（4）通过以上方法所得出的微菌核数量在72h、96h、120h、144h和168h分别为0、1.0×104、8.5×105和7.0×107个/mL、7.1×107个/mL。
实施例4
本实施例其他的步骤与实施例1完全相同，不同的有以下几点：
（1）本实施例所用莱氏野村菌菌株分离纯化自江苏兴化蔬菜地斜纹夜蛾僵虫体表菌体，菌株编号为：JSNr04。
（2）诱导培养液的配方如下：葡萄糖：40g/L，酵母膏：10g/L，蛋白胨：10g/L，KH2PO4:3g/L，CaCl2.2H2O:0.7g/L，MgSO4.7H2O:0.6/L，FeSO4.7H2O:0.2g/L，CoCl2.6H2O：40mg/L，MnSO4.H2O:20mg/L，ZnSO4.7H2O:20mg/L，脱离子水配制。
（3）发酵培养工艺的条件如下：培养基pH=6.5，温度为26℃，发酵罐转速为100rpm，培养时间为180h。
（4）通过以上方法所得出的微菌核数量在72h、96h、120h、144h和180h分别为0、1.5×104、2.0×106和1.6×108个/mL、1.7×108个/mL。
Claims (4)
1.一种莱氏野村菌微菌核诱导产生的方法，其特征在于按以下步骤进行：
（1）把莱氏野村菌（Nomuraea rileyi）菌种活化，待用，所述菌种的活化采用SMAY培养基进行活化，PH 5.5，SMAY培养基配制为麦芽糖40g/L、酵母粉15g/L、蛋白胨10g/L、琼脂粉20g/L；
（2）接种体制备：将活化的野村菌接种于SMAY培养基上，在25～28℃下连续光照培养144-192h，用0.1%～0.5%的Tween80水溶液将平板上的孢子或菌丝体洗下，配制莱氏野村菌接种体悬浮液；
（3）液体发酵诱导：将接种体加入诱导培养液中进行发酵培养，将所得的发酵液过滤，弃去上清液，得到沉淀微菌核和菌体，干燥，保存；
所述诱导培养液单位体积内所含有的各种原料干物质重量如下：葡萄糖 10~50g/L，酵母膏5～10g/L，蛋白胨5～10g/L，KH2PO4 3～5g/L，CaCl2.2H2O 0.7～0.9g/L，MgSO4.7H2O 0.5～0.7g/L，FeSO4.7H2O 0.1～0.2g/L，CoCl2.6H2O 35～40mg/L，MnSO4.H2O 15～20mg/L，ZnSO4.7H2O 14～20mg/L，脱离子水配制；
所述液体发酵的工艺条件为：培养基pH=5.4～6.5，温度为23~28℃，摇床转速为200～250rpm或者发酵罐转速为80～100rpm，培养时间为144～192h。
2.根据权利要求1所述莱氏野村菌微菌核诱导产生的方法，其特征在于：所述诱导培养液单位体积内所含有的各种原料干物质重量如下：葡萄糖 10～40g/L、酵母浸膏 5～8g/L、蛋白胨 5~8g/L、KH2PO4 3~4g/L、Cacl2.2H2O 0.7~0.8g/L、MgSO4.7H2O 0.6~0.7g/L、FeSO4.7H2O 0.1~0.2g/L、CoCl2.6H2O 36~37mg/L、MnSO4.H2O 16~18mg/L、ZnSO4.7H2O 16~18mg/L，脱离子水配制。
3.根据权利要求1所述莱氏野村菌微菌核诱导产生的方法，其特征在于：所述液体发酵的工艺条件为：培养基pH=5.5～6.0，温度为25~26℃，摇床转速为220~250rpm或者发酵罐转速为80~100rpm,培养时间为150～192h。
4. 根据权利要求1所述莱氏野村菌微菌核诱导产生的方法，其特征在于：所得到的沉淀微菌核和菌体用冻干粉保存。
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