CN103881927A - 一种高产无色素普鲁兰多糖的茁芽短梗霉及其培养和制备普鲁兰多糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高产无色素普鲁兰多糖的茁芽短梗霉，保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号为CCTCC M2013611。本发明还公开了一种高产无色素普鲁兰多糖的茁芽短梗霉的诱变筛选方法及其培养方法以及一种高产无色素普鲁兰多糖的茁芽短梗霉发酵生产普鲁兰多糖的方法。应用上述茁芽短梗霉菌株GM-1发酵培养得到的培养物不会因黑色素样物质积累而呈现出暗绿色或者墨绿色，而是形成乳白色或淡黄色组合物。本发明的芽短梗霉菌株GM-1与常规普鲁兰糖生产菌株相比，其得到普鲁兰多糖为无色，且普鲁兰多糖的产率更高，实现原料利用率的提高、降低生成成本，以及满足了食品、医药、环境等应用领域对无色普鲁兰糖的要求。
Description
技术领域
本发明属于普鲁兰多糖的微生物菌种生物工程技术领域，具体涉及一种大量产生无色素普鲁兰多糖的诱变茁芽短梗霉菌株及发酵培养方法。
本发明茁芽短梗霉保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏地址是中国武汉武汉大学，保藏日期是2013年11月27日，保藏号为CCTCC M 2013611；保藏名称：出芽短梗霉GM-1(Aureobasidium pullulans GM-1)。
技术背景
普鲁兰多糖是茁芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）产生的胞外多糖，易溶于水，具有非常优良的增稠作用，造膜性强、易形成良好的水溶性的可食薄膜，并且具有无毒无害、无色无味等优良特性，常用其作为保色、保香、保鲜、抗氧化等的包装材料。普鲁兰糖的生产及应用已经有30多年的研究历史，日本林原公司在70年代进行中试规模工业化生产，至今一直垄断国际市场。经过20年研究发展，国内的相关研究中筛选到了一些多糖产量高色素较低的茁芽短梗霉菌株，方宣钧等（茁芽短梗霉菌株紫外诱变及发酵条件优化，农业生物技术学报，1998年02期）也通过紫外照射得到变异株ZY047，通过优化培养条件多糖转化率达到54.1%，但其含有色素；刘娜等（茁霉多糖生产菌的复合诱变筛选及发酵条件研究，吉林农业大学， 食品科学， 2005， 硕士论文）研究了普鲁兰多糖生产菌种和发酵条件的优化，确定了菌种与发酵条件，虽然其色素水平低，但其普鲁兰多糖产量不高，原料利用率也低，增加了生产成本，因此使得工业化过程相当缓慢。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对现有生产方法得到的普鲁兰多糖为黑色或色素较浅并且得率普遍不高的问题，通过紫外线和亚硝基胍NTG诱变，从诱变菌株中筛选无色透明和/或颜色白而且转化率较高的诱变菌株，获得一种大量产生无色素普鲁兰多糖的菌株。本发明还提出一种大量生产无色素普鲁兰多糖的方法，利用CCTCC M 2013611菌株生产无色素普鲁兰糖，优化培养基配方，以及在发酵过程中按发酵时间对搅拌速度及通气量进行调控，使培养基底物得到充分利用，提高了原料的利用率，降低了生产成本，实现高效率、低成本、无色素的普鲁兰糖生产。
为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：
一种高产无色素普鲁兰多糖的茁芽短梗霉，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏地址是中国武汉武汉大学，保藏日期是2013年11月27日，保藏号为CCTCC M 2013611；所述高产无色素普鲁兰多糖的茁芽短梗霉呈淡乳白色或淡乳黄色，色度以明度L值计在15以上。
一种高产无色素普鲁兰多糖的茁芽短梗霉的诱变筛选方法，包括以下步骤：
1）茁芽短梗霉为出发菌株，采用紫外线（15W 3min）和亚硝基胍NTG(1mg/ml)复合诱变的方法对出发菌株进行处理；
2）从诱变菌株中筛选无色透明或者颜色白的诱变菌株；
3）培养诱变菌株，检测菌株培养物的色度L值，以及测定培养物中普鲁兰多糖的含量，并以此作为复筛的依据，获得高产无色素普鲁兰多糖的茁芽短梗霉GM-1。
一种高产无色素普鲁兰多糖的茁芽短梗霉的培养方法，包括如下步骤：
1）菌种活化：将斜面菌种茁芽短梗霉GM-1转接斜面PDA培养基，30℃活化培养3d；
2）种子培养：选取生长良好的斜面作为种子，用接种针挑一块接入种子培养基中，于30℃，200士20 rpm下培养48h，制得种子液；
3）发酵培养：将上述步骤2）中的种子培养液以体积比5～15%接种量接种于发酵培养基中，在28℃下，220rpm振荡培养5d。
为了获得更好的技术效果，步骤2）中所述种子培养基组成为：蔗糖20.0g/L，蛋白胨2.0g/L，米糠3.0g/L，草酸0.3g/L，K2HPO4 1.0g/L，NaCl 1.0g/L，MgSO 4·7H2O 0.2g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，pH 6.5；步骤3）中所述发酵培养基组成为：蔗糖 30.0g/L，蛋白胨5.0g/L，米糠5.0g/L，草酸1.0g/L，K2HPO4 3.0g/L，NaCI 2.50g/L，MgSO 4·7H2O 0.20g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，pH6.5。
经上述过程培养茁芽短梗霉突变株GM-1后，得到的培养物呈淡乳白色或淡乳黄色，不会出现深绿色或者墨绿色，且培养物的着色度以Lab色度系统化得到的明度L值在15以上。
一种高产无色素普鲁兰多糖的茁芽短梗霉发酵生产普鲁兰多糖的方法，包括以下步骤：
1） 制备种子培养基，其水溶液组成为：蔗糖20.0 g/L，蛋白胨2.0 g/L，米糠3.0 g/L，草酸0.3 g/L，K2HPO4 1.0 g/L，NaCl 1.0 g/L，MgSO 4·7H2O 0.2 g/L，FeSO4 ·7H2O 0.01 g/L，pH5.5～8.0，121℃灭菌20min；用接种环蘸取少许茁芽短梗霉GM-1接入所述种子培养基中，于30℃，转速为200rpm培养48h，作为一级种子液；将一级种子液以体积比5%～10%的接种量接种于所述种子培养基中，于30℃，转速为200rpm培养48h，作为二级种子液；经一级种子、二级种子逐步扩大培养后，作为液体种子；
2） 制备发酵培养基，其水溶液组成为：蔗糖 30.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，米糠5.0 g/L，草酸 1.0g/L，K2HPO4 3.0g/L，NaCI 2.5g/L，MgSO 4·7H2O 0.2g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，pH5.5，121℃灭菌20min；按体积比2%～12%的接种量将液体种子接入发酵罐中；前24小时发酵温度为30℃；24小时后将温度调整为28℃，再持续发酵120～144h；
3） 将上述得到的茁芽短梗霉突变株GM-1培养物在罐压维持在0.08～0.1 MPa下保持20～30min后，用200目的过滤板进行过滤除菌，然后进行超滤浓缩，得到浓缩糖液；
4）对浓缩糖液进行喷雾干燥，得到粉末状普鲁兰多糖。
为了获得更好的技术效果，步骤（2）中发酵罐的工艺参数为：发酵前24h，搅拌速度150～300 rpm，通空气量1～2L/min；24小时后菌体浓度达到1.5～2.5×108个/mL，调搅拌速度到300～600 rpm，通空气量3～5L/min；48h以后，搅拌速度调为300～600 rpm，通空气量5～8L/min，直至发酵结束。
本发明的茁芽短梗霉菌株GM-1与常规普鲁兰糖生产菌株相比，本发明得到普鲁兰多糖为无色，且普鲁兰多糖的产率更高，实现原料利用率的提高、降低生成成本，以及满足了食品、医药、环境等应用领域对无色普鲁兰糖的要求。
具体实施方法
下面结合实施例具体阐述本发明。
实施例1：复合诱变处理筛选茁芽短梗霉突变株及性能
（1） 菌株
出发菌株为茁芽短梗霉（Aureobasidium pullulans ATCC 201253），经复合诱变后的突变株为茁芽短梗霉GM-1。该突变株茁芽短梗霉突变株GM-1于2013年11月27日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号为CCTCC M 2013611。
（2） 菌种活化及种子培养
将出发菌株茁芽短梗霉（Aureobasidium pullulans ATCC 201253）转接PDA斜面培养基，28～33℃恒温培养3～4d，选择生长良好的活化斜面菌种转接于装有种子培养基的三角瓶中，于28～33℃ 200±20rpm下培养36h。
（3） 菌种选育
以茁芽短梗霉为出发菌株进行紫外线、亚硝基胍NTG诱变，从大量的诱变菌株中筛选分泌黑色素极少而且转化率高的诱变菌株；
1） 孢子悬浮液的制备 将活化后的出发菌株接种至种子培养液中，30℃恒温振荡培养；吸取经培养20h后的种子培养液1 ml，10000rpm下离心2min，弃上清液，加入灭菌的生理盐水洗涤离心三次，以1 ml生理盐水重新悬浮，制成单孢子悬浮液，用血球计数板计数后，将孢子浓度调整到1×106CFU/ml。
2） 紫外诱变
诱变处理时取10ml 孢子悬浮液放于直径9 cm的培养皿中，放入无菌搅拌铁芯，液层厚度为2～3mm，将培养皿放入恒温箱中备用；将磁力搅拌器（包括转子）放入超净工作台，调整高度使距15W紫外灯30cm处，随后打开紫外灯5-30min，使其稳定。将培养箱中存放的培养皿迅速放至磁力搅拌器上，搅拌并开始计时，分别在30sec、1min、2min、4min、6min的时候将培养皿的盖子盖上，关闭紫外灯；然后将照射后的培养皿中的菌液0.2ml加入到PDA培养基中，振荡均匀，于30℃恒温箱中倒置培养72h，挑取平板上的无色透明的菌落进行摇瓶复筛，根据检测培养物明度L值在15以上，作为亚硝基胍NTG诱变的出发菌株。
3）亚硝基胍NTG诱变
在上述紫外线诱变菌株孢子悬浮液中添加亚硝基胍溶液至终浓度为1mg/ml，于28℃ 160rpm下培养2h，处理后离心分离，并反复用生理盐水洗涤离心5次以上，最后用生理盐水恢复原体积后稀释103倍，取100μL诱变后菌液涂布平板培养； 72h后，挑取平板上的无色透明的菌落进行摇瓶复筛，确定筛选培养物含普鲁兰糖量最高，且检测培养物明度L值在15以上，由此获得高产无色素普鲁兰多糖的茁芽短梗霉突变株GM-1。
（4）诱变菌株的特性
（1）菌体形态：发酵液中主要呈现酵母样形态，细胞椭圆形且大小均一，数个菌体可连成杆状，菌株的繁殖方式类似于酵母的出芽生殖方式；
（2）菌落形态：菌落由最初粘稠乳白色渐渐转变为淡黄色；菌落呈圆形，中心隆起，表面光滑，湿润，质地粘稠不易挑取，生长后期有菌丝体产生；
（3）培养特征：28～33℃，200rpm下震荡培养5d后，发酵液颜色乳白或淡黄色；
（4）可以利用的碳源：葡萄糖，蔗糖，麦芽糖，果糖，可溶性淀粉，糊精等，上述氮源可以混合使用，也可单一使用；
（5）可以利用的氮源：牛肉膏、蛋白胨、米糠、玉米浆、硝酸钠、酵母膏、硫酸铵等，上述氮源可以混合使用，也可单一使用；
实施例2 芽短梗霉突变株的培养及性能
培养方法：1）将斜面菌种茁芽短梗霉突变株GM-1转接斜面PDA培养基，30℃活化培养3d；
2）将茁芽短梗霉GM-1接种于含蔗糖20.0 g/L，蛋白胨2.0g/L，米糠3.0 g/L，草酸0.3 g/L，K2HPO41.0 g/L，NaCl 1.0 g/L，MgSO 4·7H2O 0.2 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L，pH 6.0的液体营养培养基中，于28℃ 220rpm下振荡培养，培养至增值稳定期（从接种起144小时）。经诱变后的突变株GM-1发酵得到的培养物呈淡乳白色或淡乳黄色，而出发亲本株茁芽短梗霉（Aureobasidium pullulans ATCC 201253）发酵培养物具有深绿色或者墨绿色。
为了测定前述培养物中的葡聚糖含量，以10000rpm离心收集培养物上清液，加入2倍体积无水乙醇，4℃静置12小时，于12000rpm离心10min，得到多糖沉淀，用乙醇等有机溶剂洗涤3次，在105℃下烘3h至恒重，测定其重量，作为普鲁兰多糖的量。
（1） 芽短梗霉突变株色素积聚性
为了将茁芽短梗霉GM-1的色素积累性与亲本的茁芽短梗霉（Aureobasidium pullulans ATCC 201253）的色素积累性进行比较，将两者以实施例二的培养方法至增殖稳定期，该培养期间从接种起48小时后到144小时后分别采集培养物的一部分。为了对采集的培养物的色成分进行定性分析，使用PR-650 SpectraScan Colorimeter 光谱光度计/色度计进行分析，表中表示将分析结果通过CIE（国际照明委员会）Lab色度系统化得到的测定值。
。
由表1可知，达到增殖稳定期的茁芽短梗霉的培养物与达到增殖稳定期的亲本出发株培养物相比，明度L值明显高，深绿色色素积聚性低；且达到增殖稳定期的茁芽短梗霉的培养物呈淡乳白色或淡乳黄色，而出发亲本株发酵培养物具有深绿色或者墨绿色。
（2） 普鲁兰多糖积聚性
由于通常食品加工工艺中将pH环境保持为酸性可以使其不易发生杂菌污染引起品质劣化。探讨茁芽短梗霉关于pH环境的培养条件，使用接种时初始pH不同的培养基，以实施例2的培养方法振荡培养至增殖稳定期，采集部分接种至144小时后的培养液，测定100g 培养物中的普鲁兰多糖含量，并且测定培养后的培养液的pH值和明度L值，其结果见表2。
通过肉眼观察，以经诱变过的茁芽短梗霉GM-1的各种接种时初始不同pH得到的培养物的色调都为淡乳白色或淡黄色，没有发现显著差异，而亲本株茁芽短梗霉（Aureobasidium pullulans ATCC 201253）的培养物呈墨绿色，与诱变株培养物的淡乳白色或淡黄色有显著色差。关于普鲁兰多糖积聚量，由表2可知，得到的培养物的多糖含量与作为亲本株茁芽短梗霉（Aureobasidium pullulans ATCC 201253）相比明显高；另当前述培养液的接种时的初始pH设定在4.5～8.0的范围内，不需要人为的控制，经过长时间培养后的培养液的pH表现出收敛于pH在3.8～4.2之间。
由这些结果可知，茁芽短梗霉GM-1在pH 4.5～8.0的范围的pH环境下其色素积累性和普鲁兰多糖积聚性不会受到影响，可以良好地进行培养。
实施例3 普鲁兰糖无色素发酵生产方法
利用优化培养基配方，同时通过控制发酵条件，先促进菌体的生长，再改变发酵条件，促进产物合成，实现发酵生产普鲁兰糖无色素，使培养基底物得到充分利用，提高了原料的利用率，降低了生产成本。
比较例1
（1）用接种环将茁芽短梗霉GM-1接入装有100ml培养基的500ml三角瓶中。种子培养基的水溶液组成为（g/L）：蔗糖20.0，蛋白胨2.0g/L，米糠3.0，草酸0.3，K2HPO41.0，NaCl 1.0，MgSO 4·7H2O 0.2，FeSO4·7H2O 0.01，pH6.5，121℃灭菌20min；于30℃，转速为180rpm培养48h，作为一级种子液；
（2） 将一级种子液以体积比6%的接种量接种于种子培养基中，种子培养基成分同步骤（1）。于30℃，转速为180rpm培养48h，作为种子液；
（3） 按10%（V/V）的接种量将上述液体种子接入发酵罐中。在50升发酵罐中加入30升发酵培养基并接入二级种子液3升，其水溶液组成为（g/L）：蔗糖30.0，米糠5.0，草酸0.5，K2HPO41.0，NaCl 1.0，MgSO 4·7H2O 0.2，FeSO4 ·7H2O 0.01，pH5.5，121℃灭菌20min；前24小时发酵温度为30℃，搅拌速度为300rpm，通空气量6 L/min，罐压0.01MPa；24小时后将温度调整为28℃，其他发酵条件不变，再持续发酵120小时；
（4）发酵结束时发酵液呈淡黄色，明度L值达27.56，发酵液经处理后获得14.37g/L的普鲁兰多糖。
比较例2
（1）取一环茁芽短梗霉（Aureobasidium pullulans ATCC 201253）接入装有50ml培养基的500ml三角瓶中。种子培养基的水溶液组成为（g/L）：蔗糖20.0，蛋白胨2.0，米糠3.0，草酸0.3，K2HPO41.0，NaCl 1.0，MgSO 4·7H2O 0.2，FeSO4 ·7H2O 0.01，pH6.5，121℃灭菌20min；于30℃，转速为180rpm培养48h，作为一级种子液；
（2） 将一级种子液以体积比，8%的接种量接种于种子培养基中，种子培养基成分同步骤一。于30℃，转速200rpm培养，48h，作为种子液；
（3） 按10%（V/V）的接种量将种子液接入50升发酵罐中。在50升发酵罐中加入30升发酵培养基并接入二级种子液2升，其水溶液组成为（g/L）：蔗糖30.0，蛋白胨5.0，米糠5.0，草酸1.0，K2HPO4 3.0，NaCI 2.5，MgSO 4·7H2O 0.2，FeSO4 ·7H2O 0.01，pH6.5，121℃灭菌20min；前24小时发酵温度为30℃，搅拌速度为400rpm，通空气量8 L/min，罐压0.01MPa；24小时后将温度调整为28℃，其他发酵条件不变，再持续发酵120小时；
（4）发酵结束时发酵液呈墨绿色，明度L值达2.87，发酵液经处理后获得7.34g/L的普鲁兰多糖。
Claims (9)
1.一种高产无色素普鲁兰多糖的茁芽短梗霉，其特征在于，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏地址是中国武汉武汉大学，保藏日期是2013年11月27日，保藏号为CCTCC M 2013611。
2.权利要求1所述的高产无色素普鲁兰多糖的茁芽短梗霉，其特征在于，所述高产无色素普鲁兰多糖的茁芽短梗霉呈淡乳白色或淡乳黄色，色度以明度L值计在15以上。
3.一种高产无色素普鲁兰多糖的茁芽短梗霉的诱变筛选方法，包括以下步骤：
1）茁芽短梗霉为出发菌株，采用紫外线照射和亚硝基胍NTG复合诱变的方法对出发菌株进行处理；
2）从诱变菌株中筛选无色透明或者颜色白的诱变菌株；
3）培养诱变菌株，检测菌株培养物的色度L值，以及测定培养物中普鲁兰多糖的含量，并以此作为复筛的依据，获得高产无色素普鲁兰多糖的茁芽短梗霉GM-1。
4.一种高产无色素普鲁兰多糖的茁芽短梗霉的培养方法，包括如下步骤：
1）菌种活化：将斜面菌种茁芽短梗霉GM-1转接斜面PDA培养基，30℃活化培养3d；
2）种子培养：选取生长良好的斜面作为种子，用接种针挑一块接入种子培养基中，于30℃，200士20 rpm下培养48h，制得种子液；
3）发酵培养：将上述步骤2）中的种子培养液以体积比5～15%接种量接种于发酵培养基中，在28℃下，220rpm振荡培养5d。
5.如权利要求4所述的高产无色素普鲁兰多糖的茁芽短梗霉的培养方法，其特征在于，步骤2）中所述种子培养基组成为：蔗糖20.0g/L，蛋白胨2.0g/L，米糠3.0g/L，草酸0.3g/L，K2HPO4 1.0g/L，NaCl 1.0g/L，MgSO 4·7H2O 0.2g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，pH 6.5。
6.如权利要求4所述的高产无色素普鲁兰多糖的茁芽短梗霉的培养方法，其特征在于，步骤3）中所述发酵培养基组成为：蔗糖 30.0g/L，蛋白胨5.0g/L，米糠5.0g/L，草酸1.0g/L，K2HPO4 3.0g/L，NaCI 2.50g/L，MgSO 4·7H2O 0.20g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，pH6.5。
7.如权利要求4所述的高产无色素普鲁兰多糖的茁芽短梗霉的培养方法，其特征在于，步骤3）中得到的培养物呈淡乳白色或淡乳黄色，且培养物的着色度以Lab色度系统化得到的明度L值在15以上。
8.一种高产无色素普鲁兰多糖的茁芽短梗霉发酵制备普鲁兰多糖的方法，包括以下步骤：
1） 制备种子培养基，其水溶液组成为：蔗糖20.0 g/L，蛋白胨2.0 g/L，米糠3.0 g/L，草酸0.3 g/L，K2HPO4 1.0 g/L，NaCl 1.0 g/L，MgSO 4·7H2O 0.2 g/L，FeSO4 ·7H2O 0.01 g/L，pH5.5～8.0，121℃灭菌20min；用接种环蘸取少许茁芽短梗霉GM-1接入所述种子培养基中，于30℃，转速为200rpm培养48h，作为一级种子液；将一级种子液以体积比5%～10%的接种量接种于所述种子培养基中，于30℃，转速为200rpm培养48h，作为二级种子液；经一级种子、二级种子逐步扩大培养后，作为液体种子；
2） 制备发酵培养基，其水溶液组成为：蔗糖 30.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，米糠5.0 g/L，草酸 1.0g/L，K2HPO4 3.0g/L，NaCI 2.5g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，pH5.5，121℃灭菌20min；按体积比2%～12%的接种量将液体种子接入发酵罐中；前24小时发酵温度为30℃；24小时后将温度调整为28℃，再持续发酵120～144h；
3） 将上述得到的茁芽短梗霉突变株GM-1培养物在罐压维持在0.08～0.1 MPa下保持20～30min后，用200目的过滤板进行过滤除菌，然后进行超滤浓缩，得到浓缩糖液；
4）对浓缩糖液进行喷雾干燥，得到粉末状普鲁兰多糖。
9.如权利要求8所述的高产无色素普鲁兰多糖的茁芽短梗霉发酵制备普鲁兰多糖的方法，其特征在于，其中步骤（2）中发酵罐的工艺参数为：发酵前24h，搅拌速度150～300 rpm，通空气量1～2L/min；24小时后菌体浓度达到1.5～2.5×108个/mL，调搅拌速度到300～600 rpm，通空气量3～5L/min；48h以后，搅拌速度调为300～600 rpm，通空气量5～8L/min，直至发酵结束。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Zeng Jing Inventor after: Yuan Lin Inventor after: Qiu Xiaozhong Inventor after: Yang Gang Inventor before: Yuan Lin Inventor before: Guo Jianjun Inventor before: Zhang Xiaohua Inventor before: Yang Gang |
|
| COR | Change of bibliographic data | ||
| CI01 | Publication of corrected invention patent application |
Correction item: Inventor Correct: Zeng Jing|Guo Jianjun|Yuan Lin|Qiu Xiaozhong|Yang Gang False: Zeng Jing|Yuan Lin|Qiu Xiaozhong|Yang Gang Number: 43 Volume: 32 |
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| ERR | Gazette correction | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20170804 |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |