CN102492639A - 利用rna聚合酶突变提高环脂肽类抗生素产量的突变体及制法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物农药技术领域，具体涉及利用含利福平（50μg/ml）的LB平板筛选高产抗真菌环脂肽类物质的芽孢杆菌CC09菌株的RNA聚合酶突变体，该突变体的突变位点发生在RNA聚合酶b亚基氨基酸序列中的485和490的任一位置，突变体生产抗真菌环脂肽类抗生素Iturin和Surfactin的产量较野生型CC09菌株提高100%～300%，抗真菌活性较野生型CC09菌株提高20%～60%，可用于多种作物病害的防治。
Description
技术领域
本发明属于生物农药技术领域，具体涉及产抗真菌环脂肽类抗生素的芽孢杆菌CC09菌株的RNA聚合酶突变体的筛选及其应用。
背景技术
随着人们对生活质量要求的提高以及环境生态面临的种种危机，农业生产面临的最大挑战就是如何在未来能够找到环境友好型的化学农药的替代品来抵抗农业病害，随着各国科学家的研究发现，源于有益微生物的生物农药是最有希望成为这类产品的替代品(Marc Ongena等，Cell，2007，16(3)：115-125)。现有有关微生物农药的研究多集中于芽孢杆菌，且已有相关产品出现，如美国Agraquest公司的产品SerenadeTM和Sonata AS，就是来源于菌株Bacillussubtilis QST713和QST2808(Cao CX等，Agric.Nat.Resour，2010，SAG-18-10.)。
芽孢杆菌的抗菌物质多为环脂肽类抗生素，如Iturins和Surfactin等。该类抗菌物质往往产生于微生物的稳定生长期，产量低是制约其开发为生物农药的主要原因。
目前用于提高芽孢杆菌代谢产物中抗菌物质的方法主要有：
优化培养基组成，如在玫瑰孢链霉菌培养液中添加缬氨酸可以提高达托霉素的前体物环肽A21978C2的产量，添加异亮氨酸可以提高同为前体物的环肽A21978C1和A21978C3含量，进而增加达托霉素的产量，添加亮氨酸则可以生成新的衍生物(Zmijewski M J等，J Antibiot，1986，39(10)：1483)；
前体控制发酵工艺，改变环脂肽类抗生素肽尾上的脂肪酸和特定位置的氨基酸，以提高其目的组分产率或生成新的衍生物(Boeck L D等，J Antibiot，1990，43(6)：607)；
利用诱变处理，筛选高产环脂肽菌株(李晶等，安徽农业科学，2008，36(1)：106-111，132)。寻找更为有效的方法及高产量菌株仍是目前研究的重点。
本发明核心突变体来源于芽孢杆菌CC09制成的生防菌剂(专利申请号CN201110073773.9)，该生防菌剂对禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、链格孢菌(Alternaria alternata)、水稻立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)和辣椒疫霉(Phytophthora capsici)等的生长有显著的抑制活性，特别对小麦白粉病和赤霉病有显著的防治效果。本发明以此生防菌为基础，通过定向筛选RNA聚合酶自然突变体，获得了环脂肽类抗生素产量提高100％～300％的突变体，为环脂肽类抗生素的产业化生产提供了一条新的途径和生产菌株。
发明内容
本发明主要目的是：提供一种利用RNA聚合酶突变提高环脂肽类抗生素产量的技术，获得环脂肽类抗生素产量提高的芽孢杆菌CC09(专利申请号CN201110073773.9，该菌株已于2011年3月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.4669)的RNA聚合酶突变体，并应用于植物病害的防治。
本发明的技术方案：
1.CC09菌株RNA聚合酶突变体的获得
菌种的活化
将菌株CC09于LB液体培养基中活化，然后接种于8支含LB液体培养基的试管中进一步培养。
将LB固体培养基加热融化后，加入一定浓度的利福平溶液于已融化的培养基中，摇匀后在无菌条件下以20-30ml的量倒于直径为90mm的平板中。
将
中8支原始菌种种子液，分别以每平板200μL的接种量均匀涂布于8个
法制得的平板上。37℃暗处培养2天后取出，所见菌落即有可能为RNA聚合酶突变体，进而通过对该突变体中rpoB基因的PCR和PCR产物的序列分析，进一步确定突变体的突变基因是否发生在编码RNA聚合酶β亚基的rpoB基因上。
2.高产突变体及其环脂肽类抗生素含量的确定
通过抑制植物病原真菌活性实验和HPLC检验，确定高产突变体的抗真菌活性及所产生的环脂肽类抗生素的含量。
3.高产突变体突变基因位点的确定
利用细菌DNA提取试剂盒，提取个突变体的DNA，并用一系列引物进行PCR扩增，获得完整的rpoB基因序列，经序列分析以及与野生型菌株rpoB序列的同源性比对，找出突变碱基及相应的氨基酸。
4.突变体及其产生的环脂肽类抗生素对植物病原真菌的防治实验
突变体的发酵液及其无菌滤液分别进行抗植物病原真菌实验。
本发明与现有技术相比的有益效果：
[1]所获得的突变体产生的环脂肽类抗生素较野生菌株显著提高(100％～300％)，而且抗生素的产生时间提前，抗真菌活性较野生型CC09菌株提高20％～60％。
[2]未经过人为诱导，所得突变体来自于野生型菌株的自然突变，突变体的生理生化特性以及遗传性状相对稳定。
[3]所获得的突变体及其所产生的环脂肽类抗生素可应用于防治小麦白粉病(Erysipe graminis)、大豆炭疽病(Glomerella glycines)、赤霉病(Fusariumgraminearum)，水稻纹枯病(Rizoctonia solani)，交链孢叶斑病(Alternariaalternata)、灰霉病(Botrytis cinerea)、辣椒疫霉病(Phytophthora capsici)和交链孢果腐病(Alternaria alternata)。
附图说明
图1.野生型芽孢杆菌CC09(WT)与其RNA聚合酶突变体对植物病原真菌交链孢(Alternaria alternata)的抑制差异。
图2.野生型芽孢杆菌CC09(WT)与其RNA聚合酶突变体生产Iturin的比较。
图3.野生型芽孢杆菌CC09(WT)与其RNA聚合酶突变体生产surfactin的比较。
具体实施方式
1.RNA聚合酶突变体的筛选
将野生型芽孢杆菌CC09以1％的接种量接种于4mL/管的LB液体培养基，37℃，120rpm活化培养48h，然后以相同的接种量和培养条件进行二次活化于8支LB液体培养基中，培养24h。
将利福平溶液添加到50～60℃的LB固体培养基中，终浓度为50μg/mL，即为含利福平平板。
将
中制备的二次活化种子液(8支试管)，按200μL/皿的量分别均匀涂布于含利福平平板上，37℃暗处培养2天后观察菌落，即为可能的RNA聚合酶突变体，共筛得78株突变体。
2.高产突变体及其环脂肽类抗生素含量的确定
抑制植物病原真菌活性实验
以交链孢为测试植物病原真菌。发酵液在12000rpm、10min离心去除细胞后，所得无菌上清液1ml与10mL PSA培养基混合倒入培养皿(直径9厘米)，冷却后接种新鲜的测试真菌菌饼(直径7mm)，菌饼倒扣于每个培养皿中，28℃培养48小时后测量菌落直径，计算生长抑制率。生长抑制率(％)＝[(阴性对照菌斑直径-处理板的菌斑直径)/(阴性对照菌斑直径-菌饼直径)]×100％。
结果(见图1)显示，突变体R03、R28、R05的抗真菌活性较野生型菌株提高20％～60％。
样品处理：定量取R03、R28、R05发酵液，离心获得上清液后，对于Iturin A的检测，直接用甲醇稀释一倍即可上样；对于surfactin的检测，定量的上清液取于200微升离心管中，50℃烘干后加入等量的甲醇溶解，上样检测。
Iturin A检测条件：流动相：A泵5mM醋酸铵(色谱纯)，B泵乙腈，A∶B为55∶45；流速：1毫升/分钟；检测器：220nm。
Surfactin检测条件：流动相：A泵0.1％TFA(色谱纯)，B泵乙腈，A∶B为1∶9；流速：1毫升/分钟；检测器：210nm。
结果(图2图3)显示，突变体R03、R28、R05生产的环脂肽类抗生素较野生型菌株提高100％～300％。
3.突变体突变基因位点的确定
各突变体(R03，R05，R28)发酵液离心获得菌体，采用细菌DNA提取试剂盒提取基因组DNA，根据NCBI中同源rpoB序列设计引物，所得DNA经PCR扩增。PCR反应的流程为：94℃预变性5分钟；30个循环，其中包括：94℃变性30秒，55℃退火1min，72℃延伸1min；反应结束后，于72℃下延伸7分钟。所得PCR产物送交华大基因公司测序。与野生型菌株rpoB基因序列比较，突变体R03，R05和R28的突变位点分别发生于编码RNA聚合酶β亚基的rpoB基因的1453bp，1454bp和1469bp，其中突变体R03的485位氨基酸由野生型的组氨酸变为半胱氨酸，R05的490位氨基酸由丝氨酸变为亮氨酸，R28的485位氨基酸由组氨酸变为精氨酸。
4.突变体及其产生的环脂肽类抗生素对植物病原真菌的防治实验
将突变体的发酵液及其离心所得的无菌滤液(即环脂肽类抗生素溶液)分别进行抗植物病原真菌生长实验，结果如表1所示，突变体及其所产生的环脂肽类抗生素对小麦白粉病(Erysipe graminis)、大豆炭疽病(Glomerellaglycines)、赤霉病(Fusarium graminearum)，水稻纹枯病(Rizoctonia solani)，交链孢叶斑病(Alternariaal ternata)、灰霉病(Botrytis cinerea)、辣椒疫霉病(Phytophthora capsici)和交链孢果腐病(Alternaria alternata)均有良好的防治作用。
表1.突变体R03对植物病原真菌的防治效果(％)
Claims (6)
1.一种利用RNA聚合酶突变提高环脂肽类抗生素产量的突变体，其特征是以产环脂肽类抗生素的植物内生菌株CC09为基础，用浓度为50μg/ml的利福平LB平板筛选该菌的RNA聚合酶突变体。
2.根据权利要求1所述的利用RNA聚合酶突变提高环脂肽类抗生素产量的突变体，其特征是突变体的突变位点位于编码RNA聚合酶b亚基的rpoB基因序列中1453bp、1454bp、1469bp的任一碱基位点，所导致的RNA聚合酶b亚基氨基酸序列中485、490的任一位置发生取代。
3.根据权利要求1所述的利用RNA聚合酶突变提高环脂肽类抗生素产量的突变体的制备方法，其特征是将野生型菌株CC09接种于pH7.0的灭菌液体LB培养基中，培养24h后均匀涂布于含利福平50μg/ml的LB固体平板，培养一定时间后长出的菌落，即为野生型菌株CC09的RNA聚合酶突变体。
4.根据权利要求1所述的利用RNA聚合酶突变提高环脂肽类抗生素产量的突变体，，其特征是突变体所产生的抗生素的制备方法是将该突变体以1%的接种量接种于液体LB培养基，37oC，120rpm培养48h，发酵生产抗真菌环脂肽类抗生素。
5.根据权利要求1中所述的利用RNA聚合酶突变提高环脂肽类抗生素产量的突变体在防治小麦白粉病、大豆炭疽病、赤霉病，水稻纹枯病、交链孢叶斑病、灰霉病、辣椒疫霉病和交链孢果腐病中的应用。
6.根据权利要求4中所述的利用RNA聚合酶突变提高环脂肽类抗生素产量的突变体所产生的抗生素在防治小麦白粉病、大豆炭疽病、赤霉病，水稻纹枯病、交链孢叶斑病、灰霉病、辣椒疫霉病和交链孢果腐病中的应用。
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