CN108473946A - 增强的蛋白质表达及其方法 - Google Patents
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Abstract
本公开总体上涉及产生增加量的一种或多种目的蛋白的经修饰的革兰氏阳性细菌细胞和具有增强的遗传感受态的经修饰的革兰氏阳性细菌细胞。因此,本公开的某些实施例涉及相对于表达目的蛋白的未修饰(亲本)革兰氏阳性细菌细胞,表达增加量的相同目的蛋白的经修饰的革兰氏阳性细菌细胞,其中所述经修饰的细菌细胞在编码变体RNA聚合酶(RNAP)β'‑亚基多肽的rpoC基因中包含至少一个突变。在某些实施例中,将所述编码变体β'‑亚基多肽的rpoC基因整合到所述经修饰的细胞的染色体中。在其他实施例中,将所述编码变体β'‑亚基多肽的rpoC基因包含在引入所述经修饰的细胞的染色体外质粒中。在其他实施例中,本公开涉及感受态芽孢杆菌属宿主细胞,所述感受态芽孢杆菌属宿主细胞包含至少一个拷贝的核酸构建体,其编码经修饰的rpoC多肽,所述经修饰的rpoC多肽包含与SEQ ID NO:8的90%的序列同一性和在SEQ ID NO:8的位置796处的天冬氨酸至甘氨酸的取代,其中所述编码rpoC多肽的多核苷酸对于在引入所述第一核酸构建体之前是非感受态的芽孢杆菌属宿主细胞而言是外源的。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年10月30日提交的美国临时申请号62/248,228的权益,该临时申请通过引用以其全文特此结合。
技术领域
本公开总体上涉及微生物学、分子生物学、酶学、蛋白质工程等领域。在某些实施例中,本公开涉及产生增加量的一种或多种目的蛋白的经修饰的革兰氏阳性细菌细胞。在某些其他实施例中,本公开涉及包含增加的遗传感受态的经修饰的革兰氏阳性细菌细胞。
序列表的提交
命名为“NB40948WOPCT_SEQ.txt”的文本文件序列表的电子提交的内容创建于2016年10月12日,并且大小为71KB,将其以全文通过引用特此结合。
背景技术
已经开发了多种技术来改进多肽的工业生产,包括例如经典的菌株改良方法,例如对菌株进行多轮诱变并选择高产者,构建或基因工程化具有高或高于插入基因组中的一个或多个目的基因的天然拷贝数的生产菌株,将多个拷贝的合适的表达载体引入生产菌株,载体、启动子、融合表达的改进,目的蛋白与分子伴侣的共表达等。
尽管许多上述参考方法和技术对于改进宿主微生物菌株的生产力是有效的,但它们几乎都具有局限性,例如为了制造单个产物的多轮菌株构建操作的劳动强度、不稳定的质粒特别是在宿主细胞培养期间在高拷贝数下丢失、通过将多个拷贝的基因整合到宿主细胞染色体中引起的其不稳定性等等。
因此,本领域仍然需要改进的宿主和/或生产菌株,所述改进的宿主和/或生产菌株能够增加单个目的蛋白的蛋白质生产,增加一种或多种目的蛋白的蛋白质生产,增加一种或多种目的蛋白组的蛋白质生产,增加内源蛋白的蛋白质生产等。
RNA聚合酶(以下称为“RNAP”)是最核心的转录调控中枢之一,并且研究最多的细菌RNAP是大肠杆菌RNAP,其代表从大量细菌属(包括沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、变形杆菌属(Proteus)、气杆菌属(Aerobacter)和芽孢杆菌属(Bacillus))分离的RNAP酶(参见,Fukuda等人,1977)。
RNAP“核心酶”分别由2:1:1的比率的α、β和β'亚基组成。RNAPα、β和β'亚基分别由rpoA、rpoB和rpoC基因编码。
影响RNAP的突变可以在执行众所周知的选择方案期间产生(Conrad等人,2010;Cui等人,2010)。α-亚基(RpoA)蛋白的突变体版本有时可以实质地改变细胞表型(Klein-Marcuschamer等人,2009)。同样地,在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中导致利福平抗性的β-亚基(RpoB)蛋白的某些突变与涉及生长、感受态、孢子形成和萌发的改变的表达和/或调控相关(Maughan等人,2004)。
例如,这种β-亚基改变的一个结果可能是基因活性的增加,尽管在其他情况下这种改变可能产生很小的影响或不产生影响(Kane等人,1979)。已经报道了利福平耐药菌株的不同水平的磷酸酶活性(例如,参见Sharipova等人,1994)。还报道了,β亚基(RpoB)蛋白中的至少一个突变导致目的产物的改变的产生(PCT国际公开号WO 2003/055996)。
另外,已经提出了β'-亚基(RpoC)蛋白的突变以允许在基本培养基中的最佳生长的调控适应(Conrad等人,2010),并导致对头孢呋辛(CEF)抗性的抗性(Lee等人,2013)。
如以下在具体实施方式中所阐述的,本公开解决了本领域中对能够表达和产生增加量的一种或多种目的蛋白的细菌细胞的未满足的需求。更具体地说,本公开内容解决了本领域对改进的细菌(宿主)细胞的需求,所述细菌(宿主)细胞能够增加单个目的蛋白的生产,增加一种或多种目的蛋白的生产,增加一个或多个目的蛋白组的生产,增加内源蛋白的生产等。在又其他实施例中,本公开解决了本领域对具有改进的或增加的遗传感受态的革兰氏阳性细菌细胞(例如,芽孢杆菌属物种宿主细胞)的未满足的需求,从而导致更高频率的其转化细胞。
发明内容
本公开总体上涉及产生增加量的一种或多种目的蛋白的经修饰的革兰氏阳性细菌细胞。因此,在某些实施例中,本公开涉及一种相对于未经修饰的革兰氏阳性细菌细胞表达增加量的目的蛋白(POI)的经修饰的革兰氏阳性细菌细胞,其中所述经修饰的细菌细胞包含在编码变体RNA聚合酶(RNAP)β'-亚基多肽的rpoC基因中的至少一个突变。在某些实施例中,将所述编码变体β'-亚基多肽的rpoC基因整合到所述经修饰的细胞的染色体中。在其他实施例中,将所述编码变体β'-亚基多肽的rpoC基因包含在所述经修饰的细胞的染色体外质粒中。在另一个实施例中,包含所述至少一个突变的编码变体β'-亚基多肽的所述rpoC基因衍生自野生型rpoC基因或其变体,所述rpoC基因与SEQ ID NO:5具有至少80%的序列同一性。在某些其他实施例中,所述rpoC基因编码与SEQ ID NO:6具有至少90%序列同一性的变体β′-亚基多肽。在又另一个实施例中,包含所述至少一个突变的编码变体β'-亚基多肽的所述rpoC基因衍生自野生型rpoC基因或其变体,所述rpoC基因与SEQ ID NO:7具有至少80%的序列同一性。在某些实施例中,所述rpoC基因编码与SEQ ID NO:8具有至少90%序列同一性的变体β′-亚基多肽。在某些其他实施例中,SEQ ID NO:6的变体β′-亚基多肽在SEQ ID NO:6的氨基酸残基位置751、784、797、796和/或1018-1020处或者在任何细菌RNAPβ'-亚基家族成员中的等同位置处包含至少一个突变。
在又其他实施例中,所述变体β′-亚基多肽包含至少一个选自下组的突变:在SEQID NO:6的氨基酸残基751处的甲硫氨酸至异亮氨酸的取代(M751I)、在SEQ ID NO:6的氨基酸残基784处精氨酸至组氨酸的取代(R784H)、在SEQ ID NO:6的氨基酸残基797处的丝氨酸至苯丙氨酸的取代(S797F)、在SEQ ID NO:6的氨基酸残基796处的天冬氨酸至甘氨酸的取代(D796G)和/或SEQ ID NO:6的氨基酸残基1,018、1,019和1,020的缺失(ΔI1018-R1020)。在另一个实施例中,SEQ ID NO:8的变体β′-亚基多肽在SEQ ID NO:8的氨基酸残基位置751、784、797、796和/或1018-1020处或者在任何细菌RNAPβ'-亚基家族成员中的等同位置处包含至少一个突变。
在其他实施例中,所述变体β′-亚基多肽包含至少一个选自下组的突变:在SEQ IDNO:8的氨基酸残基751处的甲硫氨酸至异亮氨酸的取代(M751I)、在SEQ ID NO:8的氨基酸残基784处精氨酸至组氨酸的取代(R784H)、在SEQ ID NO:8的氨基酸残基797处的丝氨酸至苯丙氨酸的取代(S797F)、在SEQ ID NO:8的氨基酸残基796处的天冬氨酸至甘氨酸的取代(D796G)和/或SEQ ID NO:8的氨基酸残基1,018、1,019和1,020的缺失(ΔI1018-R1020)。
在其他实施例中,该经修饰的细胞进一步包含在编码变体RNAPβ-亚基多肽的rpoB基因中的至少一个突变。在某些实施例中,包含至少一个突变的rpoB基因衍生自野生型rpoB基因或其变体,所述rpoB基因与SEQ ID NO:1具有至少80%序列同一性。在某些其他实施例中,所述rpoB基因编码与SEQ ID NO:2具有至少90%序列同一性的变体RNAPβ-亚基多肽。在另一个实施例中,SEQ ID NO:2的变体RNAPβ-亚基多肽包含选自下组的至少一个突变:SEQ ID NO:2的氨基位置469、478、482、485或487处或者在任何真细菌RNAPβ-亚基家族成员中的等同位置处的氨基酸取代。在又其他实施例中,所述变体RNAPβ-亚基多肽包含选自下组的至少一个突变:在SEQ ID NO:2的氨基酸残基478处的丙氨酸至天冬氨酸的取代(A478D)、在SEQ ID NO:2的氨基酸残基482处的组氨酸至精氨酸的取代(H482R)、在SEQ IDNO:2的氨基酸残基482处的组氨酸至酪氨酸的取代(H482Y)、在SEQ ID NO:2的氨基酸残基482处的组氨酸至脯氨酸的取代(H482P)和在SEQ ID NO:2的氨基酸残基469处的谷氨酰胺至赖氨酸的取代(Q469K)。
在某些实施例中,相对于所述未经修饰的革兰氏阳性对照细胞,所表达的POI的增加量为至少5%。在另一个实施例中,相对于所述未经修饰的革兰氏阳性对照细胞,所表达的POI的增加量为至少10%。
在又其他实施例中,该革兰氏阳性细菌(宿主)细胞是芽孢杆菌科成员。在某些实施例中,该革兰氏阳性细菌细胞是芽孢杆菌属的成员。在又其他实施例中,所述芽孢杆菌属细胞选自:枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、索诺拉沙漠芽孢杆菌(B.sonorensis)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、饲料芽孢杆菌(B.pabuli)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、黏琼脂芽孢杆菌(B.agaradhaerens)、秋叶氏芽孢杆菌(B akibai)、库拉奇芽孢杆菌(B.clarkii)、假坚强芽孢杆菌(B.pseudofirmus)、列城芽孢杆菌(B.lehensis)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、吉氏芽孢杆菌(B.gibsonii)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。在另一个实施例中,该芽孢杆菌属细胞是枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。
在其他实施例中,所述POI由所述经修饰的细菌细胞的外源基因或所述经修饰的细菌细胞的内源基因编码。在其他实施例中,该POI是细胞外分泌或转运的。在某些其他实施例中,分离或纯化该细胞外分泌或转运的POI。
在某些其他实施例中,该POI选自下组:乙酰酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、碳酸酐酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、糖基水解酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、过水解酶、多元醇氧化酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、肽酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶、及其组合。
某些其他实施例涉及由本公开的经修饰的细胞产生的分离的目的蛋白(POI)。
在其他实施例中,本公开涉及一种用于在革兰氏阳性细菌细胞中增加目的蛋白(POI)的表达的方法,其包括(a)获得一种表达增加量的POI的经修饰的革兰氏阳性细菌细胞,其中所述经修饰的细菌细胞包含在编码变体RNA聚合酶(RNAP)β'-亚基多肽的rpoC基因中的至少一个突变,和(b)在表达所述POI的条件下培养所述经修饰的细胞,其中所述表达POI的增加量的经修饰的细菌细胞是相对于未经修饰的革兰氏阳性细菌细胞中POI的表达而言的。在某些实施例中,将所述编码变体β'-亚基多肽的rpoC基因整合到所述经修饰的细胞的染色体中。在其他实施例中,将所述编码变体β'-亚基多肽的rpoC基因包含在所述经修饰的细胞的染色体外质粒中。
在本方法的其他实施例中,包含所述至少一个突变的编码变体β'-亚基多肽的所述rpoC基因衍生自野生型rpoC基因或其变体,所述rpoC基因与SEQ ID NO:5具有至少80%的序列同一性。在某些其他实施例中,所述rpoC基因编码与SEQ ID NO:6具有至少90%的序列同一性的变体RNAPβ′-亚基多肽。在又其他实施例中,包含所述至少一个突变的编码变体β'-亚基多肽的所述rpoC基因衍生自野生型rpoC基因或其变体,所述rpoC基因与SEQ IDNO:7具有至少80%的序列同一性。在另一个实施例中,所述rpoC基因编码与SEQ ID NO:8具有至少90%序列同一性变体β′-亚基多肽。在某些其他实施例中,SEQ ID NO:6的变体RNAPβ′-亚基多肽在SEQ ID NO:6的氨基酸残基位置751、784、797、796和/或1018-1020处或者在任何细菌RNAPβ'-亚基家族成员中的等同位置处包含至少一个突变。
在本方法的某些其他实施例中,所述变体RNAPβ′-亚基多肽包含至少一个选自下组的突变:在SEQ ID NO:6的氨基酸残基751处的甲硫氨酸至异亮氨酸的取代(M751I)、在SEQ ID NO:6的氨基酸残基784处精氨酸至组氨酸的取代(R784H)、在SEQ ID NO:6的氨基酸残基797处的丝氨酸至苯丙氨酸的取代(S797F)、在SEQ ID NO:6的氨基酸残基796处的天冬氨酸至甘氨酸的取代(D796G)和SEQ ID NO:6的氨基酸残基1,018、1,019和1,020的缺失(ΔI1018-R1020)。在另一个实施例中,SEQ ID NO:8的变体RNAPβ′-亚基多肽在SEQ ID NO:8的氨基酸残基位置751、784、797、796和/或1018-1020处或者在任何细菌RNAPβ'-亚基家族成员中的等同位置处包含至少一个突变。在某些其他实施例中,所述变体RNAPβ′-亚基多肽包含至少一个选自下组的突变:在SEQ ID NO:8的氨基酸残基751处的甲硫氨酸至异亮氨酸的取代(M751I)、在SEQ ID NO:8的氨基酸残基784处精氨酸至组氨酸的取代(R784H)、在SEQID NO:8的氨基酸残基797处的丝氨酸至苯丙氨酸的取代(S797F)、在SEQ ID NO:8的氨基酸残基796处的天冬氨酸至甘氨酸的取代(D796G)和SEQ ID NO:8的氨基酸残基1,018、1,019和1,020的缺失(ΔI1018-R1020)。
在其他实施例中,该方法进一步包含编码变体RNAPβ-亚基多肽的rpoB基因。在某些实施例中,包含至少一个突变的rpoB基因衍生自野生型rpoB基因或其变体,所述rpoB基因与SEQ ID NO:1具有至少80%序列同一性。在某些其他实施例中,所述rpoB基因编码与SEQ ID NO:2具有至少90%序列同一性的变体RNAPβ-亚基多肽。在另一个实施例中,SEQ IDNO:2的变体RNAPβ-亚基多肽包含选自下组的至少一个突变:SEQ ID NO:2的氨基位置469、478、482、485或487处或者在任何真细菌RNAPβ-亚基家族成员中的等同位置处的氨基酸取代。在又其他实施例中,所述变体RNAPβ-亚基多肽包含选自下组的至少一个突变:在SEQ IDNO:2的氨基酸残基478处的丙氨酸至天冬氨酸的取代(A478D)、在SEQ ID NO:2的氨基酸残基482处的组氨酸至精氨酸的取代(H482R)、在SEQ ID NO:2的氨基酸残基482处的组氨酸至酪氨酸的取代(H482Y)、在SEQ ID NO:2的氨基酸残基482处的组氨酸至脯氨酸的取代(H482P)和在SEQ ID NO:2的氨基酸残基469处的谷氨酰胺至赖氨酸的取代(Q469K)。
在本方法的其他实施例中,相对于所述未经修饰的革兰氏阳性对照细胞,所表达的POI的增加量为至少5%。在另一个实施例中,相对于所述未经修饰的革兰氏阳性对照细胞,所表达的POI的增加量为至少10%。在某些其他实施例中,该革兰氏阳性细菌细胞是芽孢杆菌科成员。在另一个实施例中,该革兰氏阳性细菌细胞是芽孢杆菌属成员。在又其他实施例中,所述芽孢杆菌属选自:枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、索诺拉沙漠芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、饲料芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、黏琼脂芽孢杆菌、秋叶氏芽孢杆菌、库拉奇芽孢杆菌、假坚强芽孢杆菌、列城芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、吉氏芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。在某些其他实施例中,该芽孢杆菌属是枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。在其他实施例中,所述POI由所述经修饰的细菌细胞的外源基因或所述经修饰的细菌细胞的内源基因编码。在某些实施例中,该POI是细胞外分泌或转运的。在其他实施例中,分离该细胞外分泌或转运的POI。在另一个实施例中,纯化该分离的POI。
在另一个实施例中,该POI选自下组:乙酰酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、碳酸酐酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、糖基水解酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、过水解酶、多元醇氧化酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、肽酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶、及其组合。
本公开的某些其他实施例涉及由本公开的方法产生的分离的目的蛋白(POI)。
在另一个实施例中,本公开涉及一种用于获得表达增加量的POI的经修饰的革兰氏阳性细菌细胞的方法,其包括(a)将至少一个rpoC基因修饰引入亲本革兰氏阳性细菌细胞,和(b)选择表达增加量的POI的一个或多个子代细胞。
在某些其他实施例中,本公开涉及一种包含经修饰的rpoC基因的整合载体,所述经修饰的rpoC基因包含在编码变体的RNA聚合酶(RNAP)β'-亚基多肽的rpoC基因中的至少一个突变。在其他实施例中,本公开涉及包含整合质粒的此类的革兰氏阳性细菌细胞。
在某些其他实施例中,本公开涉及一种用于获得转化的芽孢杆菌属宿主细胞的方法,其包括(a)将外源多核苷酸转化到芽孢杆菌属宿主细胞中,所述芽孢杆菌属宿主细胞通过至少一个拷贝的引入的第一核酸构建体而成为感受态,所述引入的第一核酸构建体包含启动子区域5'并且与编码经修饰的rpoC多肽的多核苷酸有效地连接,其中所述经修饰的rpoC多肽包含与SEQ ID NO:8的90%序列同一性和在SEQ ID NO:8的位置796处的天冬氨酸至甘氨酸的取代,其中所述编码rpoC多肽的多核苷酸对于在引入所述第一核酸构建体之前是非感受态的芽孢杆菌属宿主细胞是外源的,和(b)分离包含外源多核苷酸的芽孢杆菌属宿主细胞的转化体。在某些实施例中,所述感受态芽孢杆菌属宿主细胞进一步包含至少一个拷贝的引入的第二核酸构建体,所述引入的第二核酸构建体包含启动子区域5'并且与编码ComK多肽的多核苷酸有效地连接以使所述宿主细胞甚至更为感受态。在某些其他实施例中,该ComK多肽包含与SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:37的ComK多肽的90%序列同一性。在另一个实施例中,该芽孢杆菌属宿主细胞是地衣芽孢杆菌。本公开的某些其他实施例涉及从此类的方法获得的转化的芽孢杆菌属宿主细胞。
在另一个实施例中,本公开涉及一种获得感受态芽孢杆菌属宿主细胞的方法,其包括:(a)向非感受态芽孢杆菌属宿主细胞中引入至少一个拷贝的第一核酸构建体,所述第一核酸构建体包含启动子区域5'并且与编码经修饰的rpoC多肽的多核苷酸有效地连接,其中所述经修饰的rpoC多肽包含与SEQ ID NO:8的90%序列同一性和SEQ ID NO:8的位置796处的天冬氨酸至甘氨酸的取代,其中所述编码rpoC多肽的多核苷酸对于芽孢杆菌属宿主细胞是外源的,和(b)分离感受态芽孢杆菌属宿主细胞,所述感受态芽孢杆菌属宿主细胞包含步骤(a)的引入的多核苷酸。在某些实施例中,所述感受态芽孢杆菌属宿主细胞进一步包含至少一个拷贝的引入的第二核酸构建体,所述引入的第二核酸构建体包含启动子区域5'并且与编码ComK多肽的多核苷酸有效地连接。在又其他实施例中,该ComK多肽包含与SEQ IDNO:35或SEQ ID NO:37的ComK多肽的90%序列同一性。在另一个实施例中,该芽孢杆菌属宿主细胞是地衣芽孢杆菌。
本公开的某些其他实施例涉及从此类的方法获得的感受态的芽孢杆菌属宿主细胞。
在某些其他实施例中,本公开涉及一种感受态芽孢杆菌属宿主细胞,所述感受态芽孢杆菌属宿主细胞包含至少一个拷贝的第一核酸构建体,其包含启动子区域5'并与编码经修饰的rpoC多肽的多核苷酸有效地连接,所述经修饰的rpoC多肽包含与SEQ ID NO:8的90%的序列同一性和在SEQ ID NO:8的位置796处的天冬氨酸至甘氨酸的取代,其中所述编码rpoC多肽的多核苷酸对于在引入所述第一核酸构建体之前是非感受态的芽孢杆菌属宿主细胞是外源的。
在另一个实施例中,本公开涉及一种用于获得转化的芽孢杆菌属宿主细胞的方法,其包括:(a)将外源多核苷酸转化到芽孢杆菌属宿主细胞中,所述芽孢杆菌属宿主细胞通过至少一个拷贝的引入的第一核酸构建体而成为感受态,所述引入的第一核酸构建体包含启动子区域5'并且与编码rpoB多肽的多核苷酸有效地连接,其中所述经修饰的rpoB多肽包含与SEQ ID NO:4的90%序列同一性并且包含SEQ ID NO:4的位置478处的缬氨酸残基,其中所述编码rpoB多肽的多核苷酸对于在引入第一核酸构建体之前是非感受态的芽孢杆菌属宿主细胞是外来的,和(b)分离包含外源多核苷酸的芽孢杆菌属宿主细胞的转化体。
在又另一个实施例中,本公开涉及一种获得感受态芽孢杆菌属宿主细胞的方法,其包括(a)向非感受态芽孢杆菌属宿主细胞中引入至少一个拷贝的第一核酸构建体,所述第一核酸构建体包含启动子区域5'并且与编码rpoB多肽的多核苷酸有效地连接,其中所述rpoB多肽包含与SEQ ID NO:4的90%序列同一性并且包含SEQ ID NO:4的位置478处的缬氨酸残基,其中所述编码rpoB多肽的多核苷酸对于芽孢杆菌属宿主细胞是外源的,和(b)分离感受态芽孢杆菌属宿主细胞,所述感受态芽孢杆菌属宿主细胞包含步骤(a)的引入的多核苷酸。
本公开的某些其他实施例涉及从此类的方法获得的转化的芽孢杆菌属宿主细胞。
附图说明
图1示出了本发明的示例性rpoC基因修饰(即,取代和缺失突变体)的质粒图谱,其示出于表1中。表1中示出的特定氨基酸取代或缺失是相对于SEQ ID NO:5的亲本枯草芽孢杆菌rpoC基因,其编码SEQ ID NO:6的野生型RpoC(β'-亚基)蛋白。例如,图1所示的pCZ211质粒的图谱编码经修饰的RpoC(β′-亚基)蛋白,其包含SEQ ID NO:6的氨基酸残基796处的天冬氨酸(D)被甘氨酸(G)残基的氨基酸取代(在图1中标记为“rpoC-D796G”)。该质粒进一步包含“EcoRI”限制性位点、“XbaI”限制性位点,I-Sce位点、卡那霉素(“Km”)抗性基因、β-内酰胺酶(“bla”)基因、cop-6和编码“repC”蛋白的基因。
图2示出了本发明的示例性rpoC基因修饰(即,取代和缺失突变体)的质粒图谱,其示出于表2中。表2中示出的特定氨基酸取代或缺失是相对于SEQ ID NO:7的亲本地衣芽孢杆菌rpoC基因,其编码SEQ ID NO:8的野生型RpoC(β'-亚基)蛋白。例如,图2所示的pCZ201质粒的图谱编码经修饰的RpoC(β′-亚基)蛋白,其包含SEQ ID NO:8的氨基酸残基796处的天冬氨酸(D)被甘氨酸(G)残基的氨基酸取代。该质粒进一步包含“EcoRI”限制性位点、“Sal-I”限制性位点、“I-Sce”位点、与卡那霉素启动子(“Kan启动子”)有效地连接的卡那霉素抗性标记(“Kan CDS”)编码序列、“λ终止子”、核糖体rrnB终止子(“Term rrnB”)和pE194温敏性复制子(“Ts复制子”)。
图3示出了实例2中描述的载体pKB320的质粒图谱。pK320质粒包含多种限制性酶位点、pE194温度敏感复制子(Ts复制子)、卡那霉素编码序列(Kan CDS)、卡那霉素启动子(Kan启动子)、核糖体终止子序列(Term rrnB)和λ终止子(λTerm)。
图4是实例3中描述的rpoB构建体的示意图,其中rpoB构建体包含壮观霉素(SpecR)抗性标记和在SEQ ID NO:2的氨基酸位置469处的谷氨酰胺(Q)至精氨酸(R)的取代(即,Q469R取代)、在SEQ ID NO:2的氨基酸位置469处的谷氨酰胺(Q)至赖氨酸(K)的取代(即,Q469K取代)或在SEQ ID NO:2的氨基酸位置482处的组氨酸(H)至酪氨酸(Y)的取代(即,H482Y取代)。
图5呈现了实例7中描述的显示淀粉酶-4酶产量(作为时间的函数)的数据。图5中示出的数据比较了亲本(野生型)地衣芽孢杆菌细胞中每OD(图5A)或每单位体积(图5B)的淀粉酶-4酶产量相对于包含rpoC基因变体的经修饰的(子代)地衣芽孢杆菌细胞(即,编码RpoC(β'-亚基)“D796G”多肽变体)中的淀粉酶-4产量。
图6呈现了实例8中描述的显示淀粉酶-3酶产量的数据。如图6所示,将来自亲本(野生型)地衣芽孢杆菌细胞和包含rpoC基因变体的经修饰的(子代)地衣芽孢杆菌细胞(即,编码RpoC(β'-亚基)“D796G”多肽变体)的淀粉酶-3酶活性(单位/克/OD)绘制为时间(小时)的函数。
图7示出了质粒pBLComK的图谱,其包括编码pBR322复制起点的DNA序列、粪肠球菌壮观霉素抗性(Specr)基因spc(也称为aad9)、用于在芽孢杆菌中复制的枯草芽孢杆菌(纳豆)质粒pTA1060rep基因、由枯草芽孢杆菌xylA启动子控制的地衣芽孢杆菌comK基因和枯草芽孢杆菌xylR基因。
图8呈现了编码淀粉酶的pHPLT的质粒图谱。
图9示出了包含/编码rpoB(478V)和野生型(天然)rpoC多肽的亲本(对照)地衣芽孢杆菌宿主细胞的地衣芽孢杆菌宿主细胞转化效率数据(OD600和CFU)。
图10示出了包含/编码突变rpoB多肽(V478A)和野生型(天然)rpoC多肽的子代(经修饰的)地衣芽孢杆菌宿主细胞的地衣芽孢杆菌宿主细胞转化效率数据(OD600和CFU)。
图11示出了包含/编码rpoB(478V)多肽和经修饰的rpoC多肽(D796G)的子代(经修饰的)地衣芽孢杆菌宿主细胞的地衣芽孢杆菌宿主细胞转化效率数据(OD600和CFU)。
生物学序列简述
以下序列遵循37C.F.R.§§1.821-1.825(“包含核苷酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求-序列规则”)并符合世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25(2009)和欧洲专利公约(EPC)以及专利合作条约(PCT)法规第5.2和49.5(a-bis)条,以及行政章程第208款和附件C关于序列表的要求。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循如37C.F.R.§1.822中所述的条例。
SEQ ID NO:1是编码来自枯草芽孢杆菌的野生型RpoB(β-亚基)蛋白的核酸序列。
SEQ ID NO:2是来自枯草芽孢杆菌的野生型RpoB(β-亚基)蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3是编码来自地衣芽孢杆菌的野生型RpoB(β-亚基)蛋白的核酸序列。
SEQ ID NO:4是来自地衣芽孢杆菌的野生型RpoB(β-亚基)蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5是编码来自枯草芽孢杆菌的野生型RpoC(β′-亚基)蛋白的核酸序列。
SEQ ID NO:6是来自枯草芽孢杆菌的野生型RpoC(β′-亚基)蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7是编码来自地衣芽孢杆菌的野生型RpoC(β′-亚基)蛋白的核酸序列。
SEQ ID NO:8是来自地衣芽孢杆菌的野生型RpoB(β′-亚基)蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9是用于构建温度敏感质粒pKSV7-I-Sce KM的“I-SceI-1”寡核苷酸序列。
SEQ ID NO:10是用于构建温度敏感质粒pKSV7-I-Sce KM的“I-SceI-2”寡核苷酸序列。
SEQ ID NO:11是正向“EcoRI-rpoC”引物核酸序列。
SEQ ID NO:12是反向“SalI-rpoC”引物核酸序列。
SEQ ID NO:13是用于菌落PCR的正向引物核酸序列,以证实质粒pCZ201-pCZ205的成功组装。
SEQ ID NO:14是用于菌落PCR的反向引物核酸序列,以证实质粒pCZ201-pCZ205的成功组装。
SEQ ID NO:15是正向“rpoC”引物核酸序列。
SEQ ID NO:16是反向“rpoC”引物核酸序列。
SEQ ID NO:17是用于测序确认的正向“rpoC”引物核酸序列。
SEQ ID NO:18是用于获得淀粉酶-3整合盒的正向“NotI-淀粉酶-3”引物核酸序列。
SEQ ID NO:19是用于获得淀粉酶-3整合盒的反向“NotI-淀粉酶-3”引物核酸序列。
SEQ ID NO:20是用于扩增rpoB基因的5'序列的寡核苷酸。
SEQ ID NO:21是用于扩增rpoB基因的5'序列的寡核苷酸。
SEQ ID NO:22是用于扩增rpoB基因的3'序列的寡核苷酸。
SEQ ID NO:23是用于扩增rpoB基因的3'序列的寡核苷酸。
SEQ ID NO:24是用于扩增rpoB基因的3'序列的寡核苷酸。
SEQ ID NO:25是用于扩增rpoB基因的5'序列的寡核苷酸。
SEQ ID NO:26是用于扩增rpoB基因的3'序列的寡核苷酸。
SEQ ID NO:27是用于扩增rpoB基因的5'序列的寡核苷酸。
SEQ ID NO:28是包含壮观霉素抗性基因和I-Sce限制性酶的识别位点的合成DNA构建体。
SEQ ID NO:29是用于扩增rpoB基因的3'序列的寡核苷酸。
SEQ ID NO:30是用于扩增rpoB基因的3'序列的寡核苷酸。
SEQ ID NO:31包含SEQ ID NO:6的RpoC蛋白的氨基酸残基461-500。
SEQ ID NO:32是正向EcoRI-RpoB引物核酸序列。
SEQ ID NO:33是反向NotI-RpoB引物核酸序列。
SEQ ID NO:34是编码芽孢杆菌属ComK多肽的核酸序列。
SEQ ID NO:35是由SEQ ID NO:34编码的ComK多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:36是编码芽孢杆菌属ComK多肽的替代性核酸序列。
SEQ ID NO:37是由SEQ ID NO:36编码的ComK多肽的氨基酸序列。
具体实施方式
本公开总体上涉及产生增加量的一种或多种目的蛋白的经修饰的革兰氏阳性细菌细胞。因此,本公开的某些实施例涉及相对于表达相同POI的未修饰(亲本)革兰氏阳性细菌细胞,表达增加量的目的蛋白(下文称为“POI”)的经修饰的革兰氏阳性细菌细胞,其中所述经修饰的细菌细胞包含在编码变体RNA聚合酶(RNAP)β'-亚基多肽的rpoC基因中的至少一个突变。
I.定义
鉴于本文描述的经修饰的细菌细胞、其组合物及其方法,定义下列术语和短语。本文中未定义的术语应当符合本领域中所使用的常规含义。
除非另有定义,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明组合物和方法所应用领域的普通技术人员通常理解的相同含义。虽然类似于或等同于本文描述的那些的任何方法和材料也可以用于本发明组合物和方法的实践或测试中,但现在将对代表性示例方法和材料进行描述。在本说明书中引用的所有公开物以及专利都通过引用并入本文。
进一步注意的是,权利要求书可以撰写以排除任何可选择的要素。因此,该陈述旨在作为使用与权利要求要素的叙述有关的排他性术语如“单独”、“仅”、“排除”等或利用“否定型”限定的前提基础。
如将对于本领域技术人员显而易见的是,在阅读本公开时,本文描述和展示的单独实施例中的每一个具有离散的组分和特征,这些组分和特征可以在不偏离本文所述的本发明组合物和方法的范围或精神的情况下容易地与任何其他若干个实施例的任何一个的特征分离或组合。可以按照所叙述的事件的顺序或按照逻辑上可行的任何其他顺序来进行任何叙述的方法。
在提供了一系列值的情况下,应理解每个中间值为到下限的十分之一单位(除非上下文清晰地另外指示),该范围的上限与下限之间以及在该陈述范围内的任何其他陈述的或中间值均被涵盖在本发明的组合物和方法之内。这些较小范围的上限和下限可以被独立地包括在所述较小的范围内,并且也被涵盖在本发明的组合物和方法之内,服从所陈述范围中任何特别排除的限值。在所陈述的范围包括一个或者全部两个限值的情况下,排除那些包括的限值的任一个或者全部两个的范围也包括在本发明的组合物和方法中。
本文提供了某些范围,其中数值前面是术语“约”。术语“约”在本文中用于为其后面的确切数字以及与该术语后面的数字接近或近似的数字提供文字支持。
如本文所定义,“经修饰的细胞”、“改变的细胞”、“经修饰的细菌细胞”、“改变的细菌细胞”、“经修饰的宿主细胞”或“改变的宿主细胞”可以互换使用并且是指包含在编码变异RNA聚合酶(RNAP)β'-亚基多肽的rpoC基因中的至少一个突变的重组革兰氏阳性细菌(宿主)细胞。例如,本公开的“经修饰的”革兰氏阳性细菌细胞可以进一步定义为衍生自亲本细菌细胞的“经修饰的(宿主)细胞”,其中经修饰的(子代)细胞包含在编码变体RNAPβ'-亚基多肽的rpoC基因中的至少一个突变。
如本文所定义的,“未经修饰的细胞”、“未改变的细胞”、“未经修饰的细菌细胞”、“未改变的细菌细胞”、“未经修饰的宿主细胞”或“未改变的宿主细胞”可以互换使用并且是指不包含在编码变体RNAPβ'-亚基多肽的rpoC基因中的至少一个突变的“未经修饰的”(亲本)革兰氏阳性细菌细胞。
在某些实施例中,“未经修饰的”革兰氏阳性(亲本)细胞可以被称为“对照细胞”,特别是当与“修饰”的革兰氏阳性(子代)细胞进行比较或相对于“修饰”的革兰氏阳性(子代)细胞时。如本文所用的,当将“未经修饰的”(亲本)细胞(即,对照细胞)中的POI的表达和/或产生与“经修饰的”(子代)细胞中的相同POI的表达和/产生相比较时,应该理解的是,在基本上相同的条件下(例如,相同的条件如培养基、温度、pH等)生长/培养/发酵“经修饰的”和“未经修饰的”细胞。
同样地,如本文所定义的,术语“增加的表达”、“增强的表达”、“增加的POI表达”、“增加的产生”、“增加的POI产生”等是指“经修饰的”(子代)细胞,其包含在编码变体RNAPβ'-亚基多肽的rpoC基因中的至少一个突变,其中所述“增加”总是相对(相对比)于表达相同POI的“未经修饰的”(亲本)细胞而言的。
如本文所用的,“核酸”是指核苷酸或多核苷酸序列、及其片段或部分,以及可能是双链或单链的基因组或合成来源的DNA、cDNA、和RNA,无论其代表正义或反义链。应当理解,由于遗传密码的简并性,许多核苷酸序列可以编码给定的蛋白质。
可以理解的是,本文所述的多核苷酸(或核酸分子)包括“基因”、“载体”和“质粒”。因此,术语“基因”是指编码氨基酸具体序列的多核苷酸,其包括所有或部分蛋白编码序列,并且可以包括调控(非转录的)DNA序列,如启动子序列,该启动子序列决定例如基因在其下表达的条件。基因的转录区域可以包括非翻译区域(UTR)(这些非翻译区域包括内含子、5'-非翻译区(UTR)、和3'-UTR),以及编码序列。
如本文所用的,术语“编码序列”是指直接确定其(编码的)蛋白质产物的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界一般由通常以ATG起始密码子开始的开放阅读框(在下文中称为“ORF”)确定的。编码序列通常包括DNA、cDNA和重组核苷酸序列。
如本文定义的,术语“开放阅读框”(下文称为“ORF”)意指包含不间断阅读框的核酸或核酸序列(无论是天然存在的、非天然存在的、或合成的),不间断阅读框由以下各项组成:(i)起始密码子,(ii)一系列代表氨基酸的更多密码子中的两(2)个,和(iii)终止密码子,该ORF以5'至3'方向阅读(或翻译)。
如本文所用的术语“启动子”是指能够控制编码序列或功能性RNA表达的核酸序列。通常,编码序列位于启动子序列3'(下游)。启动子能以其整体来自天然基因,或者由来自自然界中发现的不同启动子的不同元件构成,或甚至包含合成的核酸区段。本领域技术人员应理解,不同启动子可以在不同细胞类型中、或在不同发育阶段、或响应于不同环境条件或生理条件来指导基因表达。引起基因在大多数细胞类型中表达的启动子大多数时候通常被称为“组成型启动子”。进一步认识到,由于在大多数情况下还不能完全确定调控序列的确切边界,不同长度的DNA片段可具有相同的启动子活性。
如本文所用的术语“有效地连接”是指核酸序列在单个核酸片段上的缔合,这样使得一个核酸片段的功能受到另一个影响。例如,当能够实现该编码序列的表达(即编码序列在启动子的转录控制下)时,启动子与该编码序列(例如,ORF)有效地连接。编码序列可以在正义或反义方向上有效地连接到调控序列上。
如本文所定义的,“合适的调控序列”是指位于编码序列的上游(5’非编码序列)、内部或下游(3’非编码序列),并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或者翻译的核苷酸序列。调控序列可以包括启动子、翻译前导序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎环结构。
如本文定义的,术语“引入”,如短语中所使用的,如“向细菌细胞中引入”至少一种多核苷酸开放阅读框(ORF)、或其基因、或其载体,包括本领域已知用于将多核苷酸引入细胞的方法,这些方法包括但不限于原生质体融合、自然或人工转化(例如,氯化钙、电穿孔)、转导、转染、缀合等(例如,参见Ferrari等人,1989)。
如本文所用的,“转化的”或“转化”意指细胞已经通过使用重组DNA技术转化。转化通常通过将一个或多个核苷酸序列(例如,多核苷酸、ORF或基因)插入细胞中而发生。所插入的核苷酸序列可以是异源的核苷酸序列(即在待转化的细胞中不是天然存在的序列)。
如本文所用的,“转化”是指将外源DNA引入革兰氏阳性宿主细胞中,使得DNA保持为染色体整合体或自我复制的染色体外载体。
如本文所定义的,术语“感受态”是其中外源DNA可内化到芽孢杆菌属物种宿主细胞中导致转化事件的自然生理状态。术语“感受态”不同于涉及电穿孔、原生质体、热休克和CaCl2处理的“人工转化”。
如本文所定义的,术语“非感受态”、“难以转化的”和“低转化能力”在本文中可互换使用,其中这些术语意指,当在枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌中使用用于感受态介导的转化的方法时,每微克(μg)DNA的转化体数量少于自发突变频率的两倍。
如本文所用的,术语“ComK”多肽被定义为comK基因的产物,该基因是在感受态发展之前充当最终自动调节控制开关的转录因子。ComK多肽(即,转录因子)涉及活化参与DNA结合、摄取和重组的晚期感受态基因的表达。
如本文所定义的,宿主细胞“基因组”、细菌(宿主)细胞“基因组”或革兰氏阳性细菌(宿主)细胞“基因组”包括染色体和染色体外基因。
如本文所用的,术语“质粒”、“载体”和“盒”是指染色体外元件,其通常携带通常不是细胞中心代谢的一部分的基因,并且通常呈圆形双链DNA分子的形式。此类元件可以是衍生自任何来源的单链或双链DNA或RNA的线性或环状自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列,其中许多核苷酸序列已连接或重组到单个结构中,该单个结构能够将针对选定基因产物的启动子片段和DNA序列连同适当3'未翻译序列引入到细胞中。
“转化盒”是指含有外源基因并具有促进特定宿主细胞转化的外源基因之外的元件的特定载体。
“表达盒”是指包含外源基因并具有允许在宿主细胞中用于“增加地”表达外源(异源)基因的外源基因之外的元件的特定载体。
许多原核和真核表达载体是可商购的并且是本领域众所周知的。合适的表达载体的选择是在本领域技术人员的知识范围内。
如本文所用的,术语“载体”是核酸可以在生物体、细胞、或细胞组分之间传播和/或转移的任何手段。载体包括为“附加体”的病毒、噬菌体、前病毒、质粒、噬菌粒、转座子、和人造染色体如YAC(酵母人工染色体)、BAC(细菌人工染色体)、和PLAC(植物人工染色体)等,即,其自主复制或可以整合到宿主微生物的染色体中。
“表达载体”是指具有在外来细胞中并入并表达异源DNA的能力的载体。许多原核和真核表达载体是可商购的。
“靶向载体”是包含与其转化的宿主细胞的染色体中的区域同源的多核苷酸序列并且可以驱动该区域的同源重组的载体。靶向载体可用于通过同源重组将突变引入细胞染色体中。在一些实施例中,靶向载体包含其他非同源序列,例如添加到末端(即,填充序列或侧翼序列)。末端可以闭合,这样使得靶向载体形成闭环,例如像,插入载体中。适当载体的选择和/或构建在本领域技术人员的知识内。
如本文所用的,术语“质粒”是指用作克隆载体的环状双链(ds)DNA构建体,并且其在许多细菌和一些真核生物中形成额外的染色体自复制遗传元件。在一些实施例中,质粒被合并入宿主细胞的基因组中。
如本文所用的,术语“目的蛋白”或“POI”是指期望在经修饰的革兰氏阳性细菌细胞(例如“宿主”细胞)中表达的目的多肽,其中POI以增加水平表达(即,相对于未经修饰的(亲本)革兰氏阳性细菌细胞)。因此,如本文所用的,POI可以是酶、底物结合蛋白、表面活性蛋白、结构蛋白、受体蛋白等。
类似地,如本文所定义的,“目的基因”或“GOI”是指编码POI的核酸序列(例如,多核苷酸、基因或开放阅读框)。编码“目的蛋白”的“目的基因”可以是天然存在的基因、突变的基因或合成的基因。
如本文所用的,术语“多肽”和“蛋白质”可互换地使用,并且是指包含通过肽键连接的氨基酸残基的任何长度的聚合物。本文中使用用于氨基酸残基的常规一(1)字母或三(3)字母代码。多肽可以是线性的或支化的,它可以包含经修饰的氨基酸,并且它可以被非氨基酸中断。
该术语多肽还涵盖已经自然地或通过干预被经修饰的氨基酸聚合物;这些修饰是例如,二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操纵或修饰,例如与标记组分轭合。该定义中还包括,例如,含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如,非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他经修饰的多肽。
在某些实施例中,本公开的基因编码商业上相关的工业目的蛋白,例如酶(例如乙酰酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、碳酸酐酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、糖基水解酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、过水解酶、多元醇氧化酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、肽酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶、及其组合)。
如本文所定义的,“内源基因”是指位于生物体基因组的天然位置中的基因。
如本文中所定义的,“异源”基因、“非内源性”基因、“外源”基因是指通常不在宿主生物体中被发现,但通过基因转移引入宿主生物体中的基因(或ORF)。外源(异源)基因包含插入非天然生物中的天然基因(或ORF)和/或插入天然或非天然生物中的嵌合基因。
如本文所用的,术语“表达”是指源自本发明的核酸分子的正义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积累。表达也可是指将mRNA翻译成多肽。因此,术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤,包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、分泌等。
如本文所用的,“变体”多肽是指通过取代、添加或缺失一个或多个氨基酸,通常通过重组DNA技术衍生自亲本(或参考)多肽的多肽。变体多肽可以与亲本多肽相差少量氨基酸残基,并且可以通过它们与亲本(参考)多肽的一级氨基酸序列同源性/同一性水平来定义。
优选地,变体多肽与亲本(参考)多肽序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或甚至至少99%氨基酸序列同一性。如本文所用的,“变体”多核苷酸是指编码变体多肽的多核苷酸,其中“变体多核苷酸”与亲本多核苷酸具有特定程度的序列同源性/同一性,或与亲本多核苷酸(或其补体)在严格的杂交条件下杂交。优选地,变体多核苷酸与亲本(参考)多核苷酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或甚至至少99%核苷酸序列同一性。
如本文所用的,“突变”是指核酸序列中的任何变化或改变。存在若干种类型的突变,包括点突变、缺失突变、沉默突变、移码突变、剪接突变等。可以特异性地进行突变(例如,通过定点诱变)或随机地进行突变(例如经由化学试剂、通过修复减去的细菌菌株)。
如本文所用的,在多肽或其序列的上下文中,术语“取代”意指一个氨基酸被另一个氨基酸替代(即,取代)。
如本文所定义的,“异源”核酸构建体或“异源”核酸序列具有对于表达其的细胞而言不是天然的一部分序列。
如本文所定义的,“异源控制序列”是指基因表达控制序列(例如,启动子或增强子),其本质上不起作用以调控(控制)目的基因的表达。通常,异源的核酸序列对于它们存在的细胞或部分基因组不是内源(天然)的,并且已经通过感染、转染、转化、显微注射、电穿孔等添加到细胞中。“异源的”核酸构建体可以含有与在天然宿主细胞中发现的控制序列/DNA编码(ORF)序列组合相同或不同的控制序列/DNA编码序列组合。
如本文所用的,术语“信号序列”和“信号肽”是指可以参与蛋白质的成熟蛋白或前体形式的分泌或定向转运的氨基酸残基序列。典型地,信号序列位于前体或成熟蛋白序列的N-末端。信号序列可以是内源的或外源的。成熟蛋白中一般不存在信号序列。典型地,在蛋白质转运后,信号序列通过信号肽酶从蛋白质切割。
如本文所用的,“亲本”细胞是指其中“亲本”细胞的基因组被修饰(例如,引入亲本细胞中的一个或多个突变)以产生经修饰的“子代”细胞的微生物的任何细胞或菌株。
术语“衍生的”涵盖术语“起源的”、“获得的”“可获得的”和“创建的”,并且通常表示一种指定的材料或组合物在另一种指定的材料或组合物中找到它的起源或具有可以参考另一种指定材料或组合物描述的特征。
如本文所用的,“增加”蛋白质产生是指产生的蛋白质的量增加。蛋白质可以在宿主细胞内产生,或分泌(或转运)到培养基中。在某些实施例中,目的蛋白被产生到培养基中。
如与亲本宿主相比,增加的蛋白质产生可以被检测为蛋白质或酶活性,例如蛋白酶活性、淀粉酶活性、纤维素酶活性、半纤维素酶活性等,或产生的总的细胞外蛋白质的更高的最大水平。如本文所定义的,细菌RNAP“核心酶”分别由2:1:1的比率的α、β和β'亚基组成。RNAPα、β和β'亚基多肽分别由rpoA、rpoB和rpoC基因编码。因此,如本文所用的,术语“β-亚基”或“β-亚基多肽”意指由rpoB基因编码的RpoB多肽;并且术语“β'-亚基”或“β'-亚基多肽”意指由rpoC基因编码的RpoC多肽。如本文所用的,术语“β'-亚基家族成员”是指以上述2:1:1比率的三种亚基α、β和β'组成的任何原核RNAP,并且其中β'-亚基的氨基酸序列包含可与来自SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8的位置461至500的RpoC(β'-亚基)蛋白的序列比对并且产生至少有75%的同源性的四十(40)个氨基酸连续序列。
如本文所用的,术语“等同位置”意指在与来自SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8的氨基酸残基461至500的RpoC(β'-亚基)多肽序列比对后的氨基酸残基位置。以上针对SEQ IDNO:6(即,SEQ ID NO:6的残基461至500)和SEQ ID NO:8(即,SEQ ID NO:8的残基461至500)描述的四十(40)个连续氨基酸残基(即,等同位置)存在于SEQ ID NO:38的氨基酸序列中。
如本文所用,术语“同源性”涉及同源多核苷酸或多肽。如果两个或更多个多核苷酸或两个或更多个多肽是同源的,则这意味着同源多核苷酸或多肽具有至少60%、更优选至少70%、甚至更优选至少85%、仍然更优选至少90%、更优选至少95%、和最优选至少98%的“同一性程度”。无论两个多核苷酸或多肽序列是否具有足够高的同一性程度以是同源的,如本文所定义的,可以通过使用本领域已知的计算机程序(例如,GCG程序包中提供的“GAP”)比对两个序列来适当地研究(Program Manual for the Wisconsin Package,Version 8[维斯康星软件包程序手册,第8版],1994年8月,Genetics Computer Group[遗传学计算机组],美国威斯康星州麦迪逊市科学道575(575Science Drive,Madison,Wisconsin,USA)53711)(Needleman和Wunsch,(1970))。使用GAP和以下设置进行DNA序列比较:空位产生罚分5.0和空位扩展罚分0.3。
如本文所用的,术语“百分比(%)同一性”是指当使用序列比对程序比对时,编码多肽或多肽的氨基酸序列的核酸序列之间的核酸或氨基酸序列同一性的水平。
如本文所用的,“比生产力”是在给定时间段内生产的蛋白质的总量/细胞/时间。
如本文所定义的,术语“纯化的”、“分离的”或“富集的”意指生物分子(例如,多肽或多核苷酸)通过将其与它在自然界中相关联的天然存在的成分中的一些或所有分离而被从其天然状态改变。这种分离或纯化可以通过本领域公认的分离技术如离子交换层析、亲和层析、疏水分离、透析、蛋白酶处理、硫酸铵沉淀或其他蛋白质盐沉淀、离心、尺寸排阻层析、过滤、微量过滤、凝胶电泳或梯度分离进行,以去除最终组合物中所不希望的全细胞、细胞碎片、杂质、外来蛋白质或酶。随后可以进一步向纯化或分离的生物分子组合物中添加成分,该成分提供了额外的益处,例如是活化剂、抗抑制剂、期望的离子、控制pH的化合物或其他酶或化学品。
II.RNA聚合酶
如上简要所述的,所有细胞生物体中的转录是由多亚基DNA依赖性RNA聚合酶(RNAP)驱动的,其具有包含模板DNA的保守的蟹爪状形状(参见Cramer,2002)。RNAP核心酶由2:1:1比率的α、β和β'亚基组成,其分别由rpoA、rpoB和rpoC基因单独编码。全酶通常包含Σ和Ω亚基。Σ亚基负责启动子识别和结合。
革兰氏阳性菌具有额外的δ亚基,据报道δ亚基通过在弱启动子位点阻断RNAP结合来增强转录特异性(Juang&Helmann,1994;Lopez de Saro等人,1995)。全酶RNAP通过融合转录起始位点附近的DNA形成开放复合物,并且然后开始合成RNA。Σ因子被释放,并且核心酶完成mRNA的合成(Borukhov&Severinov,2002;de Haseth&Helmann,1995)。核心RNAP在序列和结构上高度保守,跨越从细菌种类到人类,尤其是在大亚基(即,细菌β和β'亚基)同源物中(Lane&Darst,2010)。四种结构保守的模块,称为β'爪、β'钳、β叶和β瓣,在适当调节RNAP和DNA方面起着至关重要的作用(Chakraborty等人,2012)。
III.细菌(宿主)细胞和使用方法
在某些实施例中,本公开涉及产生增加量的一种或多种目的蛋白的经修饰的革兰氏阳性细菌细胞。因此,本公开的某些实施例涉及相对于表达相同POI的未修饰(亲本)革兰氏阳性细菌细胞,表达增加量的POI的经修饰的革兰氏阳性细菌细胞,其中所述经修饰的细菌细胞包含在编码变体RNA聚合酶(RNAP)β'-亚基多肽的rpoC基因中的至少一个突变。在其他实施例中,本公开涉及通过将表达构建体引入宿主细胞而成为感受态的革兰氏阳性细菌宿主细胞,所述表达构建体包含与编码变体rpoC多肽的多核苷酸有效地连接的启动子区域。
因此,在某些实施例中,本公开涉及修饰细菌细胞的方法,使得经修饰的(子代)细胞产生增加水平的目的蛋白。在其他实施例中,本公开涉及通过发酵本公开的经修饰的(变体)细菌细胞产生的目的蛋白。本公开的某些其他实施例涉及一种或多种蛋白质组合物,其包含如此制备的一种或多种目的蛋白。在又其他实施例中,本公开涉及使用本文所述的经修饰的(突变)细菌细胞生产一种或多种目的蛋白的方法,并且涉及生产和使用一种或多种蛋白质组合物的方法,所述蛋白质组合物包含一种或多种目的蛋白。
在某些实施例中,本公开涉及经修饰的革兰氏阳性细菌细胞,如与未经修饰的(亲本)细胞相比(相对比),所述经修饰的革兰氏阳性细菌细胞产生增加水平的一种或多种目的蛋白,其中一种或多种经经修饰的细胞包含在由rpoC基因编码的RNAP(亚基)的β'-亚基中的至少一个突变。在某些其他实施例中,如与未经修饰的(亲本)细胞相比(相对比),本公开提供了产生增加水平的一种或多种目的蛋白的经修饰的细菌细胞,其中经修饰的细胞包含(a)在由rpoC基因编码的RNAP的β'-亚基中的至少一个突变和(b)在由rpoB基因编码的RNAP(亚基)的β-亚基中的至少一个突变。
IV.在RNAP的RpoC(β'-亚基)中包含突变的经修饰的(宿主)细胞
在一些实施例中,RNAP的β'-亚基中的至少一个突变可以是任何类型的突变,并且可以是单个突变或一组多个突变,包括例如替代、插入、缺失、转座、终止(引入的终止密码子)、点突变等。
突变可以是单碱基对取代,即用相同位置上的不同核苷酸碱基取代单个核苷酸碱基,其中相应取代DNA的另一条链上的互补碱基。单个碱基对取代是可以想象的并且确实被认为是在本发明的范围内。突变可以出现在蛋白质编码区域或出现在编码核糖体或转移RNA的区域中。
可以使用本领域已知的任何诱变程序来制备本公开的突变,这些诱变程序包括例如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等。
定点诱变是在编码该在讨论的基因的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个(例如,若干个)突变的技术。定点诱变可以通过PCR体外完成,其使用含有所希望突变的引物。定点诱变也可以通过盒式诱变体外进行,涉及首先用限制性酶在编码在讨论的基因的质粒中的指定位点处进行切割,并且然后在切割位点处连接含有所希望突变的寡核苷酸片段。在一个典型的实施例中,使用相同的限制性酶在指定位点消化或切割质粒并制备含有突变的寡核苷酸片段,从而允许质粒和片段的黏性末端彼此连接(参见,例如,Scherer和Davis,1979和Barton等人,1990)。
还可以使用本领域已知的方法体内实现定点诱变。参见例如美国专利申请公开号2004/0171154;Storici等人,2001;Kren等人,1998和Calissano和Macino,1996。任何定点诱变程序可以适用于本发明。为此,存在可以用于制备变体的许多可商购的套装盒。
随机诱变可以通过许多已知手段完成。一种此类众所周知的方法是在诱变试剂例如2-氨基嘌呤(2AP)、N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)或甲磺酸乙酯(EMS)等存在下通过生长进行化学诱变。适用于本文和本领域已知的化学诱变方法的详细讨论可在Miller(冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),普莱恩维尤,纽约州,1992)中找到。
如由Selifonova等人,2001所述的,诱变也可以通过从质粒表达突变基因例如mutD5来完成。
可以通过转座子诱变、基因组改组、来自质粒的基因的过表达或其他细胞工程技术来操纵细胞基因组(Kleckner等人,1991;Patnaik,2008)。如在美国专利6,361,966的方法中,突变细胞也可以通过简单地使得细胞生长并允许复制错误自然发生而产生。
为了获得不断改进的突变体,可以适当地进行两轮(2)或更多轮的诱变,并且在每轮中,可以使用相同或不同的诱变方法。
在一些实施例中,rpoC基因编码的RNAP的β′-亚基是芽孢杆菌β′-亚基的天然存在的变体,其与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或甚至至少99%氨基酸序列同一性。
在某些实施例中,该RNAP的β′-亚基获得自不同的细菌细胞,并且与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或甚至至少99%氨基酸序列同一性。
V.产生增加水平的目的蛋白的经修饰的(宿主)细胞
为了确认经修饰的革兰氏阳性细菌细胞产生增加水平的POI,可以应用各种筛选方法。例如,表达载体可以编码与靶蛋白的多肽融合物并且用作可检测标签,或者可替代地,靶蛋白本身可以用作可选择或可筛选的标记。可以使用蛋白质印迹、斑点印迹(此类方法的详细描述可获自冷泉港试验方案(Cold Spring Harbor Protocols)网站)、ELISA、或者(如果标记为GFP)全细胞荧光或FACS来检测经标记的蛋白质。
例如,可以包含6-组氨酸标签以与靶蛋白融合,并且蛋白质印迹可以用于检测这种标签。此外,如果靶蛋白以足够高的水平表达,可以进行与考马斯/银染色结合的SDS-PAGE以适当地检测与野生型相比突变体表达的增加,并且在这种情况下不需要标记任何分子。
在其他实施例中,经修饰的(宿主)细胞相对于未经修饰的(亲本)细胞中POI的表达与mRNA转录物水平相关。例如,某些实施例涉及编码POI的基因或ORF的分子表征,其通常包括对RNA表达的时间和空间分布的全面分析。存在许多广泛使用的程序,并且它们在本领域中已知是用于检测和确定总RNA或聚(A)RNA样品中特定mRNA的丰度。非限制性实例包括诸如RNA印迹分析、核酸酶保护测定(NPA)、原位杂交和逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)等方法。
可以使用其他方法来确认目的蛋白的改进水平,包括例如,检测蛋白质活性或每个细胞中的量、蛋白质活性或每毫升培养基中的量的增加,从而允许培养或发酵有效地继续更长时间,或通过这些方法的组合。
比生产力的检测是用于评估蛋白质产生的另一种合适的方法。比生产力(Qp)可以使用以下公式确定:
Qp=gP/gDCW·hr
其中“gP”是在罐中产生的蛋白质的克数,“gDCW”是在罐中的干细胞重量(DCW)的克数,并且“hr”是从接种时间开始的几小时内的发酵时间,其包括产生时间以及生长时间。
在某些实施例中,如与其未经修饰的(亲本)细胞相比,本公开的经修饰的细菌细胞产生至少约、至少约5%、至少约6%、至少约7%、至少约8%、至少约9%、或至少约10%或更多的POI。
VI.通过引入编码经修饰的RpoC多肽的多核苷酸成为感受态的经修饰的(宿主)细胞
本公开的某些实施例涉及非感受态革兰氏阳性宿主细胞。更具体地,本公开的某些实施例涉及通过引入核酸构建体而成为感受态的非感受态革兰氏阳性宿主细胞(例如,芽孢杆菌属物种宿主细胞),所述核酸构建体包含有效地连接到编码修饰rpoC多肽的多核苷酸的启动子。在某些实施例中,通过“引入的”核酸构建体成为感受态的一个或多个非感受态宿主细胞是一种芽孢杆菌属细胞,所述芽孢杆菌属细胞选自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、索诺拉沙漠芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、饲料芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、黏琼脂芽孢杆菌、秋叶氏芽孢杆菌、库拉奇芽孢杆菌、假坚强芽孢杆菌、列城芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、吉氏芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。
例如,在某些实施例中,本公开涉及一种用于获得转化的芽孢杆菌属宿主细胞的方法,其包括(a)将外源多核苷酸转化到芽孢杆菌属宿主细胞中,所述芽孢杆菌属宿主细胞通过至少一个拷贝的引入的第一核酸构建体而成为感受态,所述引入的第一核酸构建体包含启动子区域5'并且与编码经修饰的rpoC多肽的多核苷酸有效地连接,其中所述经修饰的rpoC多肽包含与SEQ ID NO:8的90%序列同一性和在SEQ ID NO:8的位置796处的天冬氨酸至甘氨酸的取代,其中所述编码rpoC多肽的多核苷酸对于在引入所述第一核酸构建体之前是非感受态的芽孢杆菌属宿主细胞是外源的,和(b)分离包含外源多核苷酸的芽孢杆菌属宿主细胞的转化体。在某些实施例中,以上所示的感受态芽孢杆菌属宿主细胞进一步包含至少一个拷贝的引入的第二核酸构建体,所述引入的第二核酸构建体包含启动子区域5'并且与编码ComK多肽的多核苷酸有效地连接以使所述宿主细胞甚至更为感受态。在具体的实施例中,该ComK多肽包含与SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:37的ComK多肽的至少75%、80%、90%、95%序列同一性。在一个具体的实施例中,宿主细胞是地衣芽孢杆菌。在其他实施例中,本公开提供了一种从此类的方法获得的转化的芽孢杆菌属宿主细胞。
在其他实施例中,本公开涉及获得感受态芽孢杆菌属宿主细胞的方法,其包括:(a)向非感受态芽孢杆菌属宿主细胞中引入至少一个拷贝的第一核酸构建体,所述第一核酸构建体包含启动子区域5'并且与编码经修饰的rpoC多肽的多核苷酸有效地连接,其中所述经修饰的rpoC多肽包含与SEQ ID NO:8的90%序列同一性和SEQ ID NO:8的位置796处的天冬氨酸至甘氨酸的取代,其中所述编码rpoC多肽的多核苷酸对于芽孢杆菌属宿主细胞是外源的,和(b)分离感受态芽孢杆菌属宿主细胞,所述感受态芽孢杆菌属宿主细胞包含步骤(a)的引入的多核苷酸。在某些其他实施例中,所述感受态芽孢杆菌属宿主细胞进一步包含至少一个拷贝的引入的第二核酸构建体,所述引入的第二核酸构建体包含启动子区域5'并且与编码ComK多肽的多核苷酸有效地连接。在某些实施例中,该ComK多肽包含与SEQ IDNO:35或SEQ ID NO:37的ComK多肽的在约75%至100%之间的序列同一性。在另一个实施例中,该宿主细胞是地衣芽孢杆菌。在另一个实施例中,本公开涉及从此类的方法获得的一个或多个感受态的芽孢杆菌属宿主细胞。
在某些其他实施例中,本公开提供了感受态芽孢杆菌属宿主细胞,所述感受态芽孢杆菌属宿主细胞包含至少一个拷贝的第一核酸构建体,其包含启动子区域5'并与编码经修饰的rpoC多肽的多核苷酸有效地连接,所述经修饰的rpoC多肽包含与SEQ ID NO:8的90%的序列同一性和在SEQ ID NO:8的位置796处的天冬氨酸至甘氨酸的取代,其中所述编码rpoC多肽的多核苷酸对于在引入所述第一核酸构建体之前是非感受态的芽孢杆菌属宿主细胞是外源的。
VII.细菌细胞
在某些实施例中,本公开的经修饰的细菌细胞是芽孢杆菌科成员。在其他实施例中,本公开的经修饰的细菌细胞是芽孢杆菌属的成员。在某些实施例中,本公开的经修饰的芽孢杆菌属细胞是一种芽孢杆菌属细胞,所述芽孢杆菌属细胞选自:枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、索诺拉沙漠芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、饲料芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、黏琼脂芽孢杆菌、秋叶氏芽孢杆菌、库拉奇芽孢杆菌、假坚强芽孢杆菌、列城芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、吉氏芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。在其他实施例中,该芽孢杆菌属细胞是枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。
据本领域所认识,芽孢杆菌属继续经历分类学重组。因此,该属旨在包括已重新分类的物种,包括但不限于:例如嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)(现在称为“嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)”)或多粘芽孢杆菌(B.polymyxa)(现在是“多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)”)的此类生物体。
VIII.培养经修饰的细胞用于产生目的蛋白
在其他实施例中,如与未修饰(亲本)细胞相比(即,相对),本公开提供了用于增加修饰细菌细胞的蛋白质生产力的方法。更具体地,在某些实施例中,用于增加经修饰的细菌细胞的蛋白质生产力的方法包括在合适的发酵条件下培养经修饰的细菌细胞,其中经修饰的细胞包含在如由rpoC基因编码的RNAP的β'-亚基中的至少一个突变。
因此,可以在常规营养培养基中培养宿主细胞和转化细胞。用于转化的宿主细胞的培养基可以适当地修饰以活化启动子并选择转化体。特定培养条件(如温度、pH等)可以是用于选择用于表达的宿主细胞的那些条件,并且对于本领域技术人员将是显而易见的。此外,培养条件可以在科学文献,例如Sambrook(1982;2001),Harwood等人(1990)和从美国典型培养物保藏中心(ATCC)中找到。
IX.转化
可以构建包含编码POI的核酸的多核苷酸构建体,使得其由宿主细胞表达。由于遗传密码中已知的简并性,编码相同氨基酸序列的不同多核苷酸可以用本领域常规技术进行设计和制备。例如,可以应用密码子优化来优化在特定宿主细胞中的产生。
可以将编码目的蛋白的核酸并入载体中,其中可以使用众所周知的转化技术(例如本文公开的转化技术)将载体转移至宿主细胞中。同样地,在某些实施例中,可以将核酸构建体并入载体中,所述核酸构建体包含与编码经修饰的rpoC多肽的多核苷酸有效地连接的启动子区域,其中可以使用众所周知的转化技术将载体转移到宿主细胞中。在其他实施例中,可以将核酸构建体并入载体中,所述核酸构建体包含与编码ComK多肽的多核苷酸有效地连接的启动子区域,其中可以使用众所周知的转化技术将载体转移到宿主细胞中。
载体可以是可以转化到宿主细胞(例如,芽孢杆菌属物种宿主细胞)中并在其中复制的任何载体。例如,包含编码POI的核酸的载体可以在作为繁殖和扩增载体的手段的细菌宿主细胞中转化并复制。载体也可以被转化到表达宿主中,使得编码蛋白质的核酸(即ORF)可以表达为功能性蛋白质。充当表达宿主(即,经修饰的细菌“宿主”细胞)的细菌细胞包括芽孢杆菌科的成员和芽孢杆菌属的成员。
可用常规技术修饰以包含并表达编码POI的核酸的代表性载体是载体p2JM103BBI(参见,Vogtentanz,2007)。
可以将编码POI的多核苷酸有效地连接到允许在宿主细胞中转录的合适的启动子上。启动子可以是在选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核酸序列,并且可以衍生自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。
尤其是在细菌宿主细胞中,用于指导编码POI的多核苷酸序列的转录的合适启动子的实例包括大肠杆菌(E.coli)的乳糖操纵子的启动子、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)琼脂酶基因dagA或celA启动子、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)的启动子、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启动子、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶(amyQ)的启动子、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子等。
在某些实施例中,用于指导编码POI的多核苷酸序列的转录的启动子是PCT国际公开WO 2001/51643中所述的野生型aprE启动子、突变aprE启动子或共有aprE启动子。
在其他实施例中,用于指导编码POI的多核苷酸序列转录的启动子是核糖体启动子,例如核糖体RNA启动子或核糖体蛋白启动子。更具体地,在某些实施例中,核糖体RNA启动子是衍生自枯草芽孢杆菌的rrn启动子,更具体地,rrn启动子是来自枯草芽孢杆菌的rrnB、rrnI或rrnE核糖体启动子。在某些实施例中,核糖体RNA启动子是来自PCT国际公开号WO 2013/086219中所述的枯草芽孢杆菌的P2rrnI启动子。
POI编码序列可以有效地连接到信号序列。编码信号序列的核酸序列可以是与待表达的GOI(编码POI)天然相关的DNA序列,或者可以来自不同的属或物种。可以将包含多核苷酸构建体或载体的信号序列和启动子序列引入细菌宿主细胞中,并且那些序列可以衍生自相同来源或不同来源。例如,在某些实施例中,该信号序列是arpE信号序列(参见,例如Vogtentanz等人,2007;Wang等人,1988),其有效地连接到PCT国际公开WO 2001/51643中所述的arpE启动子上。
表达载体还可以包含合适的转录终止子,以及在真核生物中,包含有效地连接到编码目的蛋白的DNA序列的某些聚腺苷酸化序列。终止和聚腺苷酸化序列可以适当地衍生自与启动子相同来源,但是在其他实施例中,终止和聚腺苷酸化序列可以很好地衍生自与彼此不同来源和/或与启动子不同的来源。
合适的载体可以进一步包含使得该载体能够在宿主细胞中复制的核酸序列。此类赋能的序列的实例包括质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1、pIJ702等的复制起点。
合适的载体还可以包含可选择标记,例如其产物弥补分离的宿主细胞中的缺陷的基因,例如来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因,或者赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性、氯霉素抗性、四环素抗性等)的基因。
合适的表达载体典型地包括克隆载体的组分,例如像允许载体在选择的宿主生物体中自主复制的元件和用于选择目的的一个或多个表型可检测的标记。表达载体通常还包含控制核苷酸序列,例如像启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始信号和任选的抑制子基因、一个或多个活化子基因序列等。
另外,合适的表达载体可以进一步包含编码氨基酸序列的序列,该氨基酸序列能够将目的蛋白靶向宿主细胞器如过氧化物酶体或者特定的宿主细胞区室。这样的靶向序列可以是例如氨基酸序列“SKL”。为了在控制序列的指导下进行表达,目的蛋白的核酸序列可以以合适的方式与控制序列有效地连接,使得发生表达。
用于连接编码目的蛋白的DNA构建体、启动子、终止子和/或其他元件,并将它们插入到含有复制所需信息的合适载体中的方案,如本文所述,是本领域技术人员众所周知的(参见例如Sambrook等人,1989,和第3版,2001)。
将包含多核苷酸构建体或表达载体的分离的细胞有利地用作重组生产POI的宿主细胞。细胞可以用编码POI的DNA构建体转化,方便地通过将构建体(以一个或多个拷贝)整合到宿主染色体中。整合通常被认为是有利的,因为如此引入的DNA序列更可能稳定地保持在细胞中。DNA构建体整合到宿主染色体中可以使用常规方法进行,例如通过同源或异源重组。可替代地,可以用如上所述的与不同类型的宿主细胞相关的表达载体转化细胞。
在其他实施例中,从表达宿主中缺失基因是有利的,其中基因缺陷可以通过表达载体治愈。已知的方法可用于获得具有一个或多个失活基因的细菌宿主细胞。可以通过完全或部分缺失,通过插入失活或通过使基因对其预期目的不起作用的任何其他方式(使得该基因被阻止表达功能性蛋白)来完成基因灭活。
用于转化细菌和培养细菌的技术是标准的并且是本领域众所周知的。它们可以用于转化本发明的改进宿主以产生目的重组蛋白。将DNA构建体或载体引入宿主细胞中包括技术例如转化;电穿孔;核显微注射;转导;转染,例如脂质转染介导的和DEAE-右旋糖酐介导的转染;与磷酸钙DNA沉淀一起孵育;用DNA包被的微粒高速轰击;基因枪(gene gun或biolistic)转化和原生质体融合等。在Brigidi等人中还公开了用于细菌的转化和表达方法(1990)。Ferrari等人(美国专利号5,264,366)中提供了用于蛋白酶缺失的芽孢杆菌菌株的优选的一般转化和表达方案。
如上所简述的,本公开的某些实施例涉及用于获得转化的芽孢杆菌属宿主细胞的方法,其包括(a)将外源多核苷酸转化到芽孢杆菌属宿主细胞中,所述芽孢杆菌属宿主细胞通过至少一个拷贝的引入的第一核酸构建体而成为感受态,所述引入的第一核酸构建体包含启动子区域5'并且与编码经修饰的rpoC多肽的多核苷酸有效地连接,其中所述经修饰的rpoC多肽包含与SEQ ID NO:8的90%序列同一性和在SEQ ID NO:8的位置796处的天冬氨酸至甘氨酸的取代,其中所述编码rpoC多肽的多核苷酸对于在引入所述第一核酸构建体之前是非感受态的芽孢杆菌属宿主细胞是外源的,和(b)分离包含外源多核苷酸的芽孢杆菌属宿主细胞的转化体。在其他实施例中,所述感受态芽孢杆菌属宿主细胞进一步包含至少一个拷贝的引入的第二核酸构建体,所述引入的第二核酸构建体包含启动子区域5'并且与编码ComK多肽的多核苷酸有效地连接以使所述宿主细胞甚至更为感受态。在某些实施例中,该ComK多肽包含与SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:37的ComK多肽的约75%-100%序列同一性。在另一个实施例中,本公开涉及通过这些方法获得的转化的芽孢杆菌属宿主细胞。
在某些其他实施例中,本公开提供了获得感受态芽孢杆菌属宿主细胞的方法,其包括:(a)向非感受态芽孢杆菌属宿主细胞中引入至少一个拷贝的第一核酸构建体,所述第一核酸构建体包含启动子区域5'并且与编码经修饰的rpoC多肽的多核苷酸有效地连接,其中所述经修饰的rpoC多肽包含与SEQ ID NO:8的90%序列同一性和SEQ ID NO:8的位置796处的天冬氨酸至甘氨酸的取代,其中所述编码rpoC多肽的多核苷酸对于芽孢杆菌属宿主细胞是外源的,和(b)分离感受态芽孢杆菌属宿主细胞,所述感受态芽孢杆菌属宿主细胞包含引入的多核苷酸。在某些实施例中,所述感受态芽孢杆菌属宿主细胞进一步包含至少一个拷贝的引入的第二核酸构建体,所述引入的第二核酸构建体包含启动子区域5'并且与编码ComK多肽的多核苷酸有效地连接。在某些实施例中,该ComK多肽包含与SEQ ID NO:35或SEQID NO:37的ComK多肽的约75%-100%序列同一性。在某些实施例中,该芽孢杆菌属宿主细胞是地衣芽孢杆菌。在另一个实施例中,本公开涉及一种从此类的方法获得的感受态的芽孢杆菌属宿主细胞。
例如,如下文实例9中所述,包含至少一个拷贝的引入的第一核酸构建体的本公开的经修饰的芽孢杆菌属宿主细胞表明所获得的转化体数量显著增加,所述引入的第一核酸构建体包含有效地连接到编码经修饰的rpoC多肽的多核苷酸的启动子区域,所述经修饰的rpoC多肽包含与SEQ ID NO:8的90%的序列同一性并且在位置796处包含天冬氨酸至甘氨酸的取代(即,相对于SEQ ID NO:8的D796G取代),(即相对于不包含引入的第一核酸构建体的亲本(对照)芽孢杆菌属宿主细胞)。因此,在某些实施例中,包含引入的第一核酸构建体(即,编码经修饰的rpoC多肽,所述经修饰的rpoC多肽包含与SEQ ID NO:8包含90%序列同一性且在位置796处包含天冬氨酸(D)至甘氨酸(G)取代)的经修饰的芽孢杆菌属宿主细胞相对于未经修饰的(对照)“非感受态”亲本芽孢杆菌属宿主细胞,转化体数量增加了至少2倍。
X.发酵
在某些实施例中,本公开涉及生产POI的方法,其包括发酵经修饰的细菌细胞,其中经修饰的细胞将POI分泌到培养基中。本领域众所周知的发酵方法可用于发酵经修饰的和未经修饰的细菌细胞。
在一些实施例中,细菌细胞在分批或连续发酵条件下培养。经典的分批发酵是封闭的系统,其中在发酵开始时设定培养基的组成,并且该组成在发酵期间不改变。在发酵开始时,用一种或多种所希望的生物体接种培养基。在这种方法中,允许发酵发生而不向系统添加任何组分。通常,分批发酵符合关于添加碳源的“分批”的资格,并且经常对控制因素(例如pH和氧浓度)进行尝试。分批系统的代谢物和生物质组成不断变化直到发酵停止时。在典型分批培养中,细胞可以通过静态停滞期进展到高生长对数期,最后进入生长速率减少或停止的稳定期。如果不经处理,处于稳定期的细胞最终死亡。通常,在对数期的细胞负责产物的大量生产。
标准分批系统的合适的变体是“补料分批发酵”系统。在典型的分批系统的这种变化中,随着发酵的进展,将底物以增量添加。当分解代谢物抑制可能抑制细胞的代谢时并且在培养基中希望具有有限量的底物的情况下,补料分批系统是有用的。在补料分批系统中实际底物浓度的测量是困难的,并且因此基于可测量因素(例如pH、溶解的氧和废气(例如CO2)的分压)的变化对其进行估计。分批和补料分批发酵是常用的并且在本领域中是已知的。
连续发酵是一个开放的系统,在该系统中,将定义的发酵培养基连续添加到生物反应器中,同时除去等量的条件培养基以用于处理。连续发酵通常将培养物保持在恒定的高密度,其中细胞主要处于对数期生长。连续发酵允许对一种或多种影响细胞生长和/或产物浓度的因素进行调节。例如,在一个实施例中,将限制营养素(例如碳源或氮源)保持在固定的速率,并且允许调节所有其他参数。在其他系统中,影响生长的许多因素可以不断改变,而通过培养基浊度测量的细胞浓度保持不变。连续系统努力保持稳定态的生长条件。因此,由于转移培养基而引起的细胞损失应当与发酵中的细胞生长速率相平衡。调节用于连续发酵过程的营养素和生长因子的方法以及最大化产物形成速率的技术在工业微生物学领域中是众所周知的。
在某些实施例中,这可以通过常规程序从培养基中回收由转化的(经修饰的)宿主细胞产生的POI,所述常规程序包括通过离心或过滤从培养基中分离宿主细胞,或者如果需要,破坏细胞并从细胞部分和碎片中除去上清液。通常经过澄清后,上清液或滤液的蛋白质组分通过盐(例如硫酸铵)沉淀。然后沉淀的蛋白质被溶解,并且可以通过各种色谱程序进行纯化,例如离子交换色谱法、凝胶过滤法。
XI.经修饰的(宿主)细胞产生的目的蛋白
在另一个实施例中,本公开提供了用于产生增加水平的POI的方法,其包括获得一种表达增加量的POI的经修饰的革兰氏阳性细菌细胞,其中所述经修饰的细菌细胞包含在编码变体RNA聚合酶(RNAP)β'-亚基多肽的rpoC基因中的至少一个突变,和在表达所述POI的条件下培养所述经修饰的细胞,其中所述表达POI的增加量的经修饰的细菌细胞是相对于未经修饰的革兰氏阳性细菌细胞中POI的表达而言的。
POI可以是任何内源或异源蛋白质,并且它可以是这种POI的变体。该蛋白质可以含有一个或多个二硫键,或者是功能形式为单体或多聚体的蛋白质,即该蛋白质具有四级结构并且由多个相同(同源)或不相同(异源)亚基组成,其中POI或其变体POI优选地是具有目的性质的POI。
在某些实施例中,该POI或其变体POI选自下组:乙酰酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、碳酸酐酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、糖基水解酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、过水解酶、多元醇氧化酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、肽酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶、及其组合。
POI或变体POI还可以是肽、肽激素、生长因子、凝血因子、趋化因子、细胞因子、淋巴因子、抗体、受体、粘附分子、微生物抗原(例如HBV表面抗原、HPV E7等)及其变体或其片段。
其他类型的目的蛋白(或变体)可以是能够为食品或作物提供营养价值的蛋白质(或变体)。非限制性实例包括可以抑制抗营养因子形成的植物蛋白质和具有更理想的氨基酸组成的植物蛋白质(例如比非转基因植物具有更高的赖氨酸含量)。
XII.蛋白质组合物的用途
在另一个实施例中,本公开提供了包含一种或多种目的蛋白的蛋白质组合物。蛋白质组合物使用本文提供的方法合适地生产。蛋白质组合物包含由目的基因编码、使用本文所述的方法表达的目的蛋白。该组合物可用于各种有用的工业应用中,例如像用于生物质水解、清洁应用、谷物加工、动物营养、食品组合物、纺织品处理、个人护理产品等中。
例如,由此产生的蛋白质组合物可以用于清洁应用中。酶促清洁组分是受欢迎的,因为它们能够分解常规化学洗涤剂不容易分解的土壤、污渍和其他杂物。可用于清洁的众所周知的酶包括蛋白酶和淀粉酶,连同其他酶例如脂肪酶、果胶酶、甘露聚糖酶,甚至是某些纤维素酶,这些酶各自提供一组不同的功能。蛋白酶与基于蛋白质的污渍相抗衡;淀粉酶对碳水化合物和淀粉起作用;并且脂肪酶分解例如脂质或脂肪。本公开为在清洁应用中的这样的用途提供了经修饰的细菌细胞,该细菌细胞已经被证明具有改进的蛋白质产生,作为目的工业酶、变体和混合物的生产者是合适和有益的。
在另一个实例中,由此制得的蛋白质组合物可以用于谷物加工中。淀粉是植物中最常见的储存碳水化合物,由植物本身以及由微生物和由高等生物使用。多种酶能够催化淀粉水解。来自所有植物来源的淀粉以颗粒的形式发生,但是取决于植物来源的种类,淀粉呈现明显不同的大小和物理特征。淀粉的酸水解在过去被广泛使用,然而这一过程现在已经在很大程度上被酶促加工所替代,已知所述酶促加工要求更少的耐腐蚀材料和其他益处,需要更少的加热能量,并且比酸处理相对更容易控制。本公开为在淀粉降解和谷物加工中的这样的用途提供了工程化的、转化的或衍生的真细菌细胞,该真菌细胞已经被证明具有改进的蛋白质产生,作为目的工业酶、变体和混合物的生产者是合适和有益的。
在另一个实例中,由此制得的蛋白质组合物可以用于食品应用中。由细菌、酵母和霉菌产生的酶数千年以来已经用于食品应用,以制作食品例如面包、奶酪、啤酒和葡萄酒。今天,酶被用于面包店、奶酪制作、淀粉加工、以及果汁和其他饮料的生产中,提供各种益处,例如改进的质地、外观和营养价值,产生理想的香味和香气等。食品酶典型地来源于动物和植物(例如淀粉消化酶,即淀粉酶,可以从大麦种子发芽获得)以及来自一系列有益微生物。酶被认为是传统基于化学的技术的可行和理想的替代品,在许多工艺中替代合成的化学药品。酶可以帮助改进食品生产过程的环境性能,降低能源消耗并改进废物或副产品的生物降解性。就其作用而言,酶比合成的化学药品更具特异性,因此,酶促加工常常提供更少的副反应和废物或副产物,因此生产更高质量的产品并降低污染的可能性。酶促加工通常也是唯一可行的加工。这方面的一个实例是浓缩苹果清汁的生产,其依赖于酶(果胶酶)的使用。大多数食品酶由微生物例如芽孢杆菌属、曲霉属、链霉属或克鲁维酵母属生产。本公开为在食品应用中的这样的用途提供了工程化的、转化的或衍生的真细菌细胞,该真菌细胞已经被证明具有改进的蛋白质产生,作为目的工业酶、变体和混合物的生产者是合适和有益的。
在另一个实例中,由此制得的蛋白质组合物可以用于动物饲料添加剂中。纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、目的蛋白、蛋白酶、脂肪酶、植酸酶和其他碳水化合物酶已经广泛用于动物饲料工业。由于许多基于植物的饲料包含具有减少动物生长的抗营养因子的物质,所以添加到此类饲料中的酶通过降解纤维、蛋白质、淀粉和植酸来改进这些抗营养因子的可消化性,使它们更易被动物消化,并且使得能够使用更便宜和通常在本地生产的饲料,同时使肉、蛋或奶的生产力最大化。同时,添加到此类饲料中的酶还可以提供支持肠道健康和增强的动物性能的益处。本公开为在动物饲料应用中的这样的用途提供了工程化的、转化的或衍生的真细菌细胞,该真菌细胞已经被证明具有改进的蛋白质产生,作为目的工业酶、变体和混合物的生产者是合适和有益的。
在又另外的实例中,由此制得的蛋白质组合物可以用于纺织品应用中。酶已经成为纺织品加工的一个不可分割的部分。在纺织品工业中存在两个已确立起来的酶应用。首先,酶(例如淀粉酶)通常用于预精整区域以用于退浆。第二,酶(例如纤维素酶)通常用于精整区域以用于软化、生物石化和减少棉制品的起球倾向。
其他酶例如像果胶酶、脂肪酶、蛋白酶、过氧化氢酶、木聚糖酶等也用于织物品加工。此外,有各种需要酶的应用,包括牛仔布和非牛仔布的褪色、生物洗擦、生物磨光、羊毛精整、过氧化物去除、染料的脱色等。因此,在某些实施例中,本公开为在纺织品应用中的这样的用途提供了经修饰的革兰氏阳性细菌细胞(其在本文中示出具有改进的蛋白质产生)作为目的工业酶、变体和混合物的生产者。
实例
根据以下实例可以进一步理解本发明细菌细胞、其组合物和方法的方面,这些实例不应被解释为限制性的。材料和方法的修改对本领域技术人员而言是显而易见的。
实例1
包含rpoC基因中的突变的经修饰的枯草芽孢杆菌细胞
在本实例中,在包含五(5)种不同rpoC突变的基因中的一(1)种的经修饰的枯草芽孢杆菌细胞中测试蛋白酶和淀粉酶的产生,并与包含野生型枯草芽孢杆菌rpoC基因(SEQID NO:6)的未经修饰的(亲本)枯草芽孢杆菌细胞相比较。设计,构建并测试总共五(5)种不同的rpoC基因改变(例如,取代和缺失)。表1如下列出了五种rpoC基因改变。
表1
包含编码经修饰的(突变体)RNAPβ'-亚基蛋白的经修饰的rpoC基因的整合质粒
质粒 | β′突变 | 基因 |
pCZ211 | D796G | rpoC |
pCZ212 | M751I | rpoC |
pCZ213 | R784H | rpoC |
pCZ214 | S797F | rpoC |
pCZ215 | ΔI1018-R1020 | rpoC |
设计核苷酸取代或缺失以实现上文表1中所述的RpoC(β'-亚基)蛋白中的氨基酸改变(例如,参见SEQ ID NO:5,其编码SEQ ID NO:6的野生型RpoC(β'-亚基)蛋白)。
例如,SEQ ID NO:6的氨基酸位置751处的甲硫氨酸(M)至异亮氨酸(I)的取代(在下文中称为“M751I”)是通过将SEQ ID NO:5的核苷酸2251、2252和2253处的ATG密码子替代为其ATC、ATT或ATA密码子实现的;SEQ ID NO:6的氨基酸位置784处的精氨酸(R)至组氨酸(H)的取代(在下文中称为“R784H”)是通过将SEQ ID NO:5的核苷酸2350、2351和2352处的CGT密码子替代为其CAT或CAC密码子实现的;SEQ ID NO:6的氨基酸位置797处的丝氨酸(S)至苯丙氨酸(F)的取代(在下文中称为“S797F”)是通过将SEQ ID NO:5的核苷酸2389、2390和2391处的TCA密码子替代为其TTT或TTC密码子实现的;并且SEQ ID NO:6的氨基酸位置796处的天冬氨酸(D)至甘氨酸(G)的取代(在下文中称为“D796G”)是通过将SEQ ID NO:5的核苷酸2386、2387和2388的GAC密码子替代为其GGC、GGT、GGA或GGG密码子实现的。表1中如上列出的三(3)个氨基酸缺失构建体(下文中称为“ΔI1018-R1020”)是通过缺失SEQ IDNO:5的密码子实现的,其分别对应于在SEQ ID NO:6的残基1018、1019和1020处的RpoC(β'-亚基)蛋白中的异亮氨酸(I)、丝氨酸(S)和精氨酸(R)氨基酸。
整合质粒的构建。如上简述,如本文所述构建总共五个整合质粒(表1),称为pCZ211(例如,参见图1)、pCZ212、pCZ213、pCZ214和pCZ215。通过SGI-DNA(加利福尼亚州拉荷亚)合成或通过位点诱变产生五个经修饰的rpoC基因,并使用限制性消化和连接将其克隆到温度敏感质粒pKSV7-I-Sce中。将连接混合物转化到大肠杆菌Top10细胞中,并铺板在含有50μg/ml羧苄青霉素的LA平板上。通过菌落PCR和测序筛选菌落。
温度敏感质粒的构建。以上段落中提到的温度敏感整合质粒pKSV7-I-Sce如下构建:二十(20)皮摩尔的两(2)个单链寡聚体I-SceI-1:cgatTAGGGATAACAGGGTAATat(SEQ IDNO:9)、和I-SceI-2:cgatATTACCCTGTTATCCCTAat(SEQ ID NO:10),(其中大写字母是I-SceI限制性酶位点的同源序列)在98℃孵育七(7)分钟,并且然后在55℃保持五(5)分钟以使寡聚体退火。退火的片段用T4多核苷酸激酶(新英格兰生物实验室(New England BioLabs);马萨诸塞州伊普斯维奇)磷酸化,并且然后与pKSV7整合载体的ClaI位点连接(Smith&Youngman,1992)。为了消除存在于pKSV7中的氯霉素抗性基因,用NcoI和MfeI消化质粒,并用T4DNA聚合酶(新英格兰生物实验室;马萨诸塞州伊普斯维奇)平端化。通过琼脂糖凝胶电泳从氯霉素抗性基因片段中分离出含有repF和cop-6的片段,并用凝胶提取套装盒(凯杰公司(Qiagen);德国希尔登)纯化,然后自我连接以产生pKS载体。用限制性核酸内切酶HindIII消化pKS载体并在用HindIII限制性内切酶消化后连接到衍生自质粒pDG780的卡那霉素(Km)抗性基因上(Guérout-Fleury等人,1995)。所得的质粒被命名为“pKSV-I-SceKm”。
突变rpoC基因转化进入枯草芽孢杆菌细胞和rpoC突变体筛选。将含有表1中示出的突变的rpoC基因的每种质粒转化到枯草芽孢杆菌细胞中,其中在30℃在含有10μg/ml卡那霉素的LB平板上选择转化体。随后,挑取菌落并接种到摇瓶中的25mL的LB中,并在30℃以250RPM振荡孵育三(3)小时。
为了将质粒整合到枯草芽孢杆菌的染色体中,将温度转变为37℃并孵育过夜。第二天,连续稀释至10-6和10-7,并将培养物铺在LB平板上并在37℃孵育过夜。通过菌落PCR和测序筛选rpoC突变克隆。
在包含经修饰的(突变体)rpoC基因的经修饰的枯草芽孢杆菌细胞中表达目的蛋白。将rpoC突变引入枯草芽孢杆菌细胞后,用编码两种不同蛋白酶之一或两种不同淀粉酶之一的表达盒转化经修饰的和未经修饰的枯草芽孢杆菌细胞。
由表达盒编码的两种蛋白酶是(1)在美国专利号5,972,682中所示并描述的迟缓芽孢杆菌变体蛋白酶,其在本文中称为“蛋白酶-1”和(2)在PCT国际公开号WO 2010/056635中所示并描述的克劳氏芽孢杆菌变体蛋白酶,其在本文中称为“蛋白酶-2”。
同样地,由表达盒编码的两种淀粉酶是(1)在PCT国际申请公开号WO 2014/164777中所示并描述的解凝乳类芽孢杆菌淀粉酶变体;其在本文中称为“淀粉酶-1”和(2)在PCT国际申请公开号WO 2009/149419和WO 2009/149395中所示并描述的枯草芽孢杆菌淀粉酶的野生型或变体;其在本文中称为“淀粉酶-2”。在摇瓶中测试经修饰的和未经修饰的枯草芽孢杆菌细胞中每种酶的产量,并与未经修饰的(亲本)枯草芽孢杆菌细胞进行比较。
实例2
包含rpoC基因中的突变的经修饰的地衣芽孢杆菌细胞
在该实例中,在包含五(5)种不同rpoC突变的(经修饰的)基因之一的经修饰的地衣芽孢杆菌细胞中测试淀粉酶的产生,并与包含野生型地衣芽孢杆菌rpoC基因(SEQ IDNO:7)的未经修饰的(亲本)地衣芽孢杆菌细胞进行比较。表2如下列出了五个rpoC基因改变。
表2
包含编码经修饰的(突变体)RNAPβ'-亚基蛋白的经修饰的rpoC基因的整合质粒
质粒 | β′突变 | 基因 |
pCZ201 | D796G | rpoC |
pCZ202 | ΔI1018-R1020 | rpoC |
pCZ203 | M751I | rpoC |
pCZ204 | R784H | rpoC |
pCZ205 | S797F | rpoC |
因此,在本实例中,设计核苷酸取代或缺失以实现上文表2中所述的RpoC(β'-亚基)蛋白中的氨基酸改变(例如,参见SEQ ID NO:7,其编码SEQ ID NO:8的地衣芽孢杆菌野生型RpoC(β'-亚基)蛋白)。
例如,参考SEQ ID NO:7中示出的野生型rpoC核苷酸序列,在氨基酸位置751处的甲硫氨酸(M)至异亮氨酸(I)的取代(M751I)是通过将SEQ ID NO:7的核苷酸位置2253的鸟嘌呤(G)替代为胞嘧啶(C)(即,ATG至ATC)实现的;在氨基酸位置784处的精氨酸(R)至组氨酸(H)的取代(R784H)是通过将SEQ ID NO:7的核苷酸位置2351的鸟嘌呤替代为腺嘌呤(A)(即,CGT至CAT)实现的;在氨基酸位置797处的丝氨酸(S)至苯丙氨酸(F)的取代(S797F)是通过将SEQ ID NO:7的核苷酸位置2390和2391的胞嘧啶-腺嘌呤核苷酸(CA)替代为胸腺嘧啶-胸腺嘧啶核苷酸(TT)(即,TCA至TTT)实现的;在氨基酸位置796处的天冬氨酸(D)至甘氨酸(G)的取代(D786G)是通过将SEQ ID NO:7的核苷酸位置2387的腺嘌呤(A)替代为鸟嘌呤(G)(即GAC至GGC)实现的。表2中如上列出的三(3)个氨基酸缺失构建体(ΔI1018-R1020)是通过缺失SEQ ID NO:7的密码子实现的,其分别对应于在SEQ ID NO:8的残基1018、1019和1020处的RpoC(β'-亚基)蛋白中的异亮氨酸(I)、丝氨酸(S)和精氨酸(R)氨基酸。
rpoC整合质粒的构建。如上简述,如本文所述构建总共五个整合质粒(表2),称为pCZ201(例如,参见图2)、pCZ202、pCZ203、pCZ204和pCZ205。这些质粒中的每一个(即,pCZ201-pCZ205)含有大肠杆菌复制起点、卡那霉素(“Km”)选择标记、来自金黄色葡萄球菌的PE194温度敏感复制子(“Ts复制子”)和具有密码子改变的rpoC基因,其导致了上述五种氨基酸改变之一(表2)。
所有五种质粒都衍生自通过使用限制性消化和连接方法插入大约3.2kb合成(预制的)载体pKB320(参见下文和图3,pKB320质粒图谱)。通过SGI-DNA(加利福尼亚州拉荷亚)将表2中呈现的这五种经合成经修饰的(突变的)rpoC基因各自单独插入到pUC02载体中并作为质粒制品递送。使用PCR从质粒中扩增每个经修饰的(突变的)rpoC片段,并通过使用引物在两端添加两个限制性位点(即EcoRI和SalI):
EcoRI-rpoC-正向引物:tcggaattccgagccgtatgggtcttgt(SEQ ID NO:11);和
SalI-rpoC-反向引物:taagtcgacttattcagccggaaccatttc(SEQ ID NO:12)。
成功获得PCR产物后,使用EcoRI和SalI限制性酶消化PCR产物以及pKB320质粒。然后在16℃用T4连接酶进行标准连接过夜。然后将过夜连接混合物转化到Top10大肠杆菌感受态细胞中,并涂布在具有10ppm卡那霉素选择物的LB平板上,并在37℃孵育过夜。
在平板上形成单个大肠杆菌菌落后,使用以下引物进行菌落PCR以确认所有五种质粒的成功组装:
正向引物:ctcgtgcacccaactgatcttcag(SEQ ID NO:13)和;
反向引物:ctgcgtccgttatcgatcaatgcgtc(SEQ ID NO:14)。
将成功组装的(确认的)克隆接种到LB液体培养物中,并在第二天使用标准微量制备程序提取质粒DNA。对质粒样品进行测序并确认每个都是正确的。
rpoC整合质粒在地衣芽孢杆菌细胞中的原生质体转化和rpoC突变体选择。使用标准原生质体转化,将包含表2示出的经修饰的rpoC基因的所有五种质粒都转化到地衣芽孢杆菌细胞中(参见,PCT国际公开号WO 2005/111203)。将DNA和原生质体混合物铺板在具有40ppm新霉素作为选择物的地衣芽孢杆菌再生板上。在再生板上生长三(3)天后,挑取来自单个转化体菌落的样品,并在含有10ppm新霉素的LB平板上重新划线。
第二天,挑取单菌落并接种到摇瓶中的25mL的LB培养基中,在37℃,250rpm振荡三(3)小时。然后将温度升至46℃,并将培养物振荡过夜。第二天,将每个过夜培养物稀释106和107,并将100μl涂布到LB平板上并在30℃培养孵育过夜,直至形成单菌落。然后将平板送到昆泰锐生物科学公司(Quintara Biosciences)(加利福尼亚州奥尔巴尼)进行菌落PCR以及测序确认。
使用以下两(2)种引物进行菌落PCR:
rpoC正向引物:cagctaaggatacgatccaaggcaag(SEQ ID NO:15),和
rpoC反向引物:tcgctttatcttcgtcgatcagctc(SEQ ID NO:16)。
使用以下引物进行测序:
rpoC正向引物:ggcaagctgatgaaatccttggatg(SEQ ID NO:17)。
在经修饰的地衣芽孢杆菌细胞中的淀粉酶表达。为了在上述经修饰的地衣芽孢杆菌细胞中表达淀粉酶(即,用五种rpoC突变体中的一种转化的经修饰的地衣芽孢杆菌细胞),制备了表达淀粉酶的整合盒。整合盒包含在PCT国际公开号WO 2008/112459中所示并描述的淀粉酶变体,其在本文中称为“淀粉酶-3”。为了制备淀粉酶-3整合盒,地衣芽孢杆菌的基因组DNA(gDNA)通过使用以下两(2)个引物提取并用作PCR的模板:
NotI-淀粉酶-正向:tatgcggccgcatattccgcattcgcaatgcctac(SEQ ID NO:18),和
NotI-淀粉酶-反向:tttgcggccgcaaaataaaaaaacggatttccttcagg(SEQ ID NO:19)。
然后将一(1)μg PCR产物用NotI酶进行限制性消化,并在37℃孵育4小时。然后柱纯化片段,并且然后通过在三十(30)uL反应中使用五(5)个单位的T4DNA连接酶将十(10)uL的这样的柱纯化的片段连接并在16℃孵育过夜。第二天,取五(5)μL过夜连接混合物用于滚环扩增反应(RCA),其通过将五(5)μL过夜连接混合物与五(5)μL样品缓冲液混合进行并将其在96℃孵育三(3)分钟,随后添加五(5)μL含有0.2uL酶混合物的反应缓冲液,将其在30℃孵育六(6)小时。
为了转化,将所有的RCA混合物添加到包含rpoC-D796G取代的一百五十(150)μl的经修饰的地衣芽孢杆菌感受态细胞中和包含rpoC-M751I取代的经修饰的地衣芽孢杆菌感受态细胞中,并在37℃在玻璃管中振荡一小时。然后将转化混合物(150μl)铺在含有10ppm氯霉素的LB/1%不溶性淀粉板上,并在37℃孵育过夜。选择单个晕圈阳性转化体并在增加的氯霉素浓度的培养中扩增至所希望的75ppm水平。通过将一(1)mL过夜培养物与五百(500)μL的40%甘油混合来收集这两种地衣芽孢杆菌菌株(即,包含rpoC-D796G取代或包含rpoC-M751I取代)的甘油原液。
实例3
rpoB(β-亚基)取代突变体Q469K、Q469R或H482Y引入经修饰的枯草芽孢杆菌细胞
已经从枯草芽孢杆菌利福平抗性菌落的分离和测序中鉴定出编码RpoB(β-亚基)蛋白的rpoB基因中的三个突变(即突变Q469K、Q469R和H482Y)(Ingham&Furneaux,2000)。天然(野生型)枯草芽孢杆菌RpoB(β-亚基)蛋白质序列如SEQ ID NO:2所示,并且编码天然RpoB蛋白质的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中所示。为了将上述突变引入枯草芽孢杆菌的rpoB基因中,如下制备三种构建体,其包含rpoB Q469K、Q469R或H482Y取代。
Q469K突变通过将SEQ ID NO:1的核苷酸位置1405、1406和1407处的CAA密码子改变为AAA密码子而产生。为了引入该突变,用SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21中的寡核苷酸扩增rpoB基因的5'序列;并且用SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23中的寡核苷酸扩增rpoB基因的3'部分。使用SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:33中的寡核苷酸进行融合PCR。
Q469R突变通过将SEQ ID NO:1的核苷酸位置1405、1406和1407处的CAA密码子改变为CGA密码子而产生。为了引入该突变,用SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:25中的寡核苷酸扩增rpoB基因的5'序列;并且用SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:24中的寡核苷酸扩增3'序列。使用SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:23中的寡核苷酸进行融合PCR。
H482Y突变通过将SEQ ID NO:1的核苷酸位置1445、1446和1447处的CAC密码子改变为TAC密码子而产生。为了引入该突变,用SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:27中的寡核苷酸扩增rpoB基因的5'序列;并且用SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:26中的寡核苷酸扩增3'序列。使用SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:23中的寡核苷酸进行融合PCR。
包含壮观霉素抗性(SpcR)基因和I-Sce限制性酶的识别序列的SEQ ID NO:28中所示的合成构建体合成排序按照来自整合DNA技术公司(Integrated DNA Technologies(爱荷华州克拉尔维尔))的g-嵌段合成排序。
使用SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30中的寡核苷酸扩增rpoB基因的C-末端部分。
含有rpoB突变、壮观霉素抗性标记和部分rpoB序列(参见图4)的DNA片段通过使用SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:30中的寡核苷酸的融合PCR组装。
枯草芽孢杆菌细胞的转化。纯化后,将在rpoB中包含Q469R、Q469K或H482Y取代的每种上述构建体转化到枯草芽孢杆菌感受态细胞中,并在含有100μg/ml壮观霉素的Luria琼脂平板上选择阳性转化体并在含有200μg/ml利福平的Luria琼脂平板上重新分离。
表达I-Sce限制性内切核酸酶的质粒pKBJ233(在Janes&Stibitz,2006中描述的)转化到上述细胞中。在含有10μg/ml四环素的Luria琼脂平板上选择阳性菌落。重新分离后,通过每十二(12)小时接种在新的培养基中,随后进行单菌落分离,将枯草芽孢杆菌细胞在含有5μg/ml四环素的Luria肉汤中生长连续三(3)天。
通过选择壮观霉素敏感性和利福平抗性菌落来证实壮观霉素标记的除去和经修饰的枯草芽孢杆菌细胞中选择的突变的引入。然后通过rpoBC操纵子的DNA测序证实突变Q469K、Q469R或H482Y的引入。
实例4
rpoB或rpoC基因突变对枯草芽孢杆菌中蛋白酶表达的影响
为了测试在包含rpoB或rpoC基因中的突变的经修饰的枯草芽孢杆菌细胞中蛋白酶-2表达的影响,将蛋白酶-2表达构建体引入rpoB或rpoC经修饰的枯草芽孢杆菌细胞的aprE基因座中。
在含有25μg/ml氯霉素的Luria琼脂平板上扩增蛋白酶-2表达构建体。经修饰的和野生型枯草芽孢杆菌细胞在5mL的Luria肉汤中生长过夜。使用一(1)ml预培养物接种在250rpm下的摇瓶中的25ml 2XNB(描述于PCT国际公开号WO 2010/14483中的2X营养肉汤,1XSNB盐)以测试蛋白酶表达。使用SpectraMax分光光度计在600nm下以每小时间隔测量稀释20倍的全肉汤的细胞密度(分子器件公司(Molecular Devices),宾夕法尼亚州唐宁镇)。
使用如PCT国际公开号WO 2010/144283中所述的N-suc-AAPF-pNA底物(AAPF,来自西格玛化学公司(Sigma Chemical Co.))监测蛋白酶-2表达。简言之,在测定缓冲液(100mMTris,0.005%Tween 80,pH 8.6)中将全发酵液稀释40倍,并且将10μl稀释的样品排列在微量滴定板中。将AAPF原液稀释,并且将测定缓冲液(DMSO中的100mg/ml AAPF原液,稀释100倍)和190μl该溶液添加到微量滴定板中,并且使用SpectraMax分光光度计(分子器件公司,宾夕法尼亚州唐宁镇)在405nm下测量溶液的吸光度。
实例5
rpoB或rpoC基因突变对枯草芽孢杆菌淀粉酶表达的影响
为了测试在包含rpoB或rpoC基因中的突变的经修饰的枯草芽孢杆菌细胞中对淀粉酶-2的表达的影响,制备表达构建体,其驱动淀粉酶-2蛋白从aprE启动子表达。将包含氯霉素乙酰转移酶抗性(catR)标记基因的淀粉酶表达构建体引入:(1)包含经修饰的rpoC基因的经修饰的(子代)枯草芽孢杆菌细胞的aprE基因座,(2)包含经修饰的rpoB基因的经修饰的(子代)枯草芽孢杆菌细胞的aprE基因座、和(3)未经修饰的枯草芽孢杆菌(亲本)细胞的aprE基因座。在包含25μg/ml氯霉素的Luria琼脂平板上扩增细胞。经修饰的和未经修饰的细胞在五(5)mL的Luria肉汤培养基中生长过夜。使用一(1)ml预培养物接种在37℃,250rpm下的摇瓶中的25ml Luria肉汤培养基以测试淀粉酶-2蛋白的表达。使用SpectraMax分光光度计在600nm下以每小时间隔测量细胞密度(分子器件公司,宾夕法尼亚州唐宁镇)。
使用Ceralpha试剂(梅格泽姆公司(Megazyme),爱尔兰威克洛)测量全发酵液的淀粉酶-2蛋白活性。首先将来自Ceralpha HR套装盒的Ceralpha试剂混合物溶解在10ml的MilliQ水中,随后添加30ml的50mM苹果酸盐缓冲液(pH 5.6)。将培养物上清液在MilliQ水中稀释40倍,并将5μl的稀释的样品添加到55μL稀释的工作底物溶液中。在震荡后,将MTP板于室温下孵育4分钟。通过添加70μl的200mM硼酸盐缓冲液(pH 10.2)(终止溶液)来淬灭反应。使用SpectraMax分光光度计(分子器件公司,宾夕法尼亚州唐宁镇)在400nm下测量溶液的吸光度。
实例6
在rpoB和rpoC基因中包含经修饰的经修饰的地衣芽孢杆菌
为了测试rpoB基因和rpoC基因两者中的突变的影响,将包含特定rpoB基因突变(即,编码RpoB-A478V取代)和特定rpoC基因突变(即,编码RpoC-D796G取代)的地衣芽孢杆菌菌株如下所述制备。
野生型地衣芽孢杆菌RpoB(β-亚基)蛋白质如SEQ ID NO:4所示,并由SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列编码。野生型地衣芽孢杆菌RpoC(β'-亚基)蛋白质如SEQ ID NO:8所示,并且由SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列编码。
有两种替代方法将所希望的rpoB和rpoC突变引入地衣芽孢杆菌宿主细胞中,其中每一种都在下文中进行阐述。例如,一种方法是将RpoC-D796G突变引入已经包含RpoB-A478V取代的经修饰的地衣芽孢杆菌细胞中,反之亦然。这两种方法在下文描述为方法1和方法2。
方法1:整合质粒pCZ205构建。质粒pCZ201(例如,参见实例2)包含大肠杆菌复制起点、卡那霉素选择标记、来自金黄色葡萄球菌的PE194温度敏感复制子和具有DNA序列变化(SEQ ID NO:7的核苷酸序列位置2062处的GAC至GGC)从而导致氨基酸改变(D796G)的rpoC基因。
通过使用限制性消化和连接方法将约3.2kb合成经修饰的rpoC基因插入到载体pKB320中来制备pCZ205质粒。通过本领域已知的方法将该合成经修饰的rpoC基因插入到pUC02载体中以产生质粒制品。使用PCR从质粒中扩增rpoC片段,并通过使用以下引物在两端添加两个限制性位点EcoRI和SalI:
EcoRI-rpoC FW:tcggaattccgagccgtatgggtcttgt(SEQ ID NO:11)、和
SalI-rpoC RV:taagtcgacttattcagccggaaccatttc(SEQ ID NO:12)。
成功获得PCR产物后,将PCR产物以及pKB320质粒都用EcoRI和SalI限制性酶消化,随后用T4连接酶在16℃进行标准连接过夜。将过夜连接混合物转化到Top10大肠杆菌感受态细胞中,铺板在具有10ppm卡那霉素选择物的LB平板上,并在37℃孵育过夜。在平板上单个大肠杆菌菌落形成后,用下列引物进行菌落PCR以证实质粒的成功组装:
正向引物:ctcgtgcacccaactgatcttcag(SEQ ID NO:13)、和
反向引物:ctgcgtccgttatcgatcaatgcgtc(SEQ ID NO:14)。
将确认的克隆接种到LB液体培养物中,并在第二天通过使用标准微量制备程序提取质粒DNA。将质粒样品送出测序以确认获得了正确的质粒。
整合质粒pCZ205向地衣芽孢杆菌细胞的原生质体转化和rpoC突变体选择。使用标准原生质体转化将pCZ205质粒转化到地衣芽孢杆菌细胞中(参见PCT国际公开号WO 2005/111203),并且将DNA和原生质体混合物铺板在具有40ppm新霉素作为选择物的地衣芽孢杆菌再生平板上。在再生平板上生长三(3)天后,挑取单个转化体并在具有10ppm新霉素的LB平板上重新划线。第二天,挑取单菌落并接种到摇瓶中的25mL的LB培养基中,在37℃和250rpm摇动三(3)小时,然后将温度转变至46℃并继续摇动过夜。第二天,将过夜培养物稀释106和107倍,并将100μl涂布到LB平板上并在30℃孵育过夜,或直至形成单菌落。通过菌落PCR和测序证实正确突变的存在。用于菌落PCR的两种引物是:
rpoC正向引物:cagctaaggatacgatccaaggcaag(SEQ ID NO:15)和
rpoC反向引物:tcgctttatcttcgtcgatcagctc(SEQ ID NO:16)。
用于测序的引物是:
rpoC测序正向引物:ggcaagctgatgaaatccttggatg(SEQ ID NO:17)。
方法2:整合质粒pCZ211构建。质粒pCZ211含有大肠杆菌复制起点、卡那霉素选择标记、来自金黄色葡萄球菌的PE194温度敏感复制子和具有产生在SEQ ID NO:2的氨基酸位置478处的丙氨酸(A)至缬氨酸(V)取代(“A478V”)的突变的rpoB基因。
通过使用限制性消化和连接方法将约3.5kb经修饰的rpoB基因(编码“A478V”取代)插入载体pKB320中来制备质粒pCZ211。为了获得含有rpoB基因的约3.5kb的DNA片段(在DNA序列位置1433处的GCT至GTT),通过使用以下两种引物和地衣芽孢杆菌gDNA作为模板进行PCR:
EcoRI-RpoB正向引物:
CAAGAATTCTTGACAGGTCAACTAGTTCAGTATG(SEQ ID NO:32)和
NotI-RpoB反向引物:
GTAGCGGCCGCTACCCTGTCACTTGCGTATAAAATTC(SEQ ID NO:33)。
为了将该rpoB PCR产物插入到pKB320载体中,将插入物和载体用EcoRI和NotI限制性酶消化,随后用T4连接酶在16℃进行标准连接过夜。然后将过夜连接混合物转化到Top10大肠杆菌感受态细胞中,铺板在具有10ppm卡那霉素选择物的LB平板上,并在37℃孵育过夜。挑取单个大肠杆菌菌落并接种到液体培养物中,过夜生长,并且然后使用标准微量制备程序提取质粒DNA。然后将质粒样品送出测序以确认获得了pCZ211质粒。
整合质粒pCZ211向地衣芽孢杆菌细胞的原生质体转化和rpoB突变体选择。通过使用标准原生质体转化将pCZ211质粒转化到地衣芽孢杆菌细胞中(参见PCT国际公开号WO2005/111203),将DNA和原生质体混合物然后铺板在具有40ppm新霉素作为选择物的地衣芽孢杆菌再生平板上。在再生平板上生长三天后,挑取单个转化体并在具有10ppm新霉素的LB平板上重新划线。第二天,挑取单菌落并接种到摇瓶中的25mL的LB培养基中,在37℃和250rpm摇动三(3)小时,然后将温度转变至46℃并继续摇动过夜。第二天,将过夜培养物稀释106和107倍,并将100μl涂布到LA平板上并在30℃孵育过夜,直至形成单菌落。挑取单菌落并铺板到没有选择物的LA平板、具有1ppm利福平的有LA平板和具有10ppm卡那霉素的LA平板上。阳性克隆或具有rpoB-A478V取代的阳性克隆将对利福平具有抗性且对卡那霉素敏感(由于pCZ111质粒的缺失)。
实例7
在经修饰的地衣芽孢杆菌细胞中淀粉酶的摇瓶生产
在本实例中,用由许多合成DNA片段构建的DNA盒转化包含实例2中描述的“rpoC-D796G”取代的经修饰的地衣芽孢杆菌细胞和野生型(亲本)地衣芽孢杆菌细胞。更具体地说,DNA片段1包含地衣芽孢杆菌adaA区域、cat启动子区域、alr1基因和cat终止子区域;其从Genescript(金斯瑞公司)(新泽西皮斯卡塔韦)订购。DNA片段2包含枯草芽孢杆菌天然rrnI P2启动子区域、5'-aprE UTR和地衣芽孢杆菌lat信号序列;其制备成双链基因片段(例如来自IDT,IDT公司(Integrated DNA Technologies)的G-嵌段;爱荷华州克拉尔维尔)。DNA片段3包含淀粉酶基因序列和地衣芽孢杆菌lat终止子区域。DNA片段3淀粉酶基因是来自在PCT国际公开号WO 2014/164777中提出并描述的噬细胞菌属物种的淀粉酶变体,其在本文中称为“淀粉酶-4”。
通过PCR融合3个DNA片段,通过使用3'和5'NotI限制性消化序列连接,然后通过使用Illustra Templiphi套装盒(GE医疗集团(GE Healthcare))进行扩增,并最终转化并整合到经修饰的(rpoC-D796G)地衣芽孢杆菌细胞和野生型(亲本)地衣芽孢杆菌细胞的基因组中。通过使用补充有1%淀粉天青(与雷马唑亮蓝R共价连接的马铃薯淀粉;西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich),S7629)和300mg/l的β-氯-D-丙氨酸(CDA)(Chem-Impex国际公司(Chem-Impex International Inc.),伊利诺伊州伍德代尔)的心浸液(Bacto)琼脂平板选择转化体。
指示淀粉分解活性的清除区在具有所整合的淀粉酶-4表达盒的菌落周围清晰可见。
如通过在RBB-淀粉平板上的晕圈形成所判断的,CDA(300mg/l)抗性转化体分泌淀粉酶-4。通过使用MOPS基础培养基在摇瓶中使细胞生长来对由地衣芽孢杆菌细胞产生淀粉酶-4酶进行实验。基本上如本领域已知的那样制备MBD培养基(参见,Neidhardt等人,1974),除了从基础培养基中省去NH4Cl2、FeSO4和CaCl2,使用3mM K2HPO4,并且基础培养基补充有60mM尿素、75g/L葡萄糖和1%大豆胨。
将微量营养素制成一升100X储备溶液:400mg FeSO4 7H2O、100mg MnSO4 H2O、100mg ZnSO4 7H2O、50mg CuCl2 2H2O、100mg CoCl26H2O、100mg NaMoO4 2H2O、100mg Na2B4O710H2O、10ml的1MCaCl2、和10ml的0.5M柠檬酸钠。将CaCl2添加至5mM,并将pH调节至6.8。在Infors培养箱(35℃,280rpm)中生长64小时后,使用α-淀粉酶Ceralpha测定套装盒(梅格泽姆公司(Megazyme),爱尔兰威克洛)确定全细胞培养液中的淀粉酶-4酶浓度。
Ceralphaα-淀粉酶测定涉及在确定的条件下将全培养肉汤与底物混合物一起孵育,并通过添加碱溶液终止反应(并显色)。底物是限定的寡糖“非还原端封闭的对硝基苯基麦芽七糖苷”(BPNPG7底物)和过量水平的葡糖淀粉酶和β-葡糖苷酶(由于存在“阻断基团”,其对天然底物没有作用”)的混合物。当通过内切作用α-淀粉酶(或C6淀粉酶)水解寡糖时,混合物中存在的过量的α-葡糖苷酶和葡糖淀粉酶使对硝基苯基麦芽糖片段瞬时和定量水解成葡萄糖和游离的对硝基苯酚。测量405nm处的吸光度,并且这直接涉及分析样品中淀粉酶的水平。
用于这组测定的设备包括Biomek FX机械臂(贝克曼库尔特公司(BeckmanCoulter));SpectraMAX MTP读数器(340型-分子器件公司)和iEMS培养箱/振荡器(赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific))。在该测定系统中,所使用的试剂和溶液是:(1)对硝基苯基麦芽七糖苷(BPNPG7)底物(Megazyme Ceralpha套装盒);(2)稀释缓冲液:50mMMOPS、0.1mM CaCl2、0.005%80缓冲液、pH 7.15;和(3)200mM硼酸/NaOH缓冲液,pH 10.2(STOP缓冲液)。
将含有54.5mg BPNPG7底物的小瓶溶解于10ml milliQ水中。用稀释缓冲液将淀粉酶样品(全细胞培养液)稀释1600倍。通过将25μl稀释的淀粉酶溶液添加到MTP的孔中,随后添加35μl的5.45mg/mlBPNPG7底物溶液来进行测定。将溶液混合并将MTP用平板密封件密封并置于25℃的培养箱/振荡器(iEMS-赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific))中8分钟。通过添加100μl STOP缓冲液终止反应,并在MTP读数器中在405nm处读取吸光度。使用非酶对照来校正背景吸光度值。为了计算淀粉酶-4酶浓度(mg/l),将纯化的淀粉酶-4酶标准对照样品的稀释系列并入实验中。淀粉酶-4酶的活性(即生产力)示出在图5A和图5B中。
实例8
经修饰的和亲本地衣芽孢杆菌细胞中的淀粉酶的一升生物反应器生产
使用一式四份设置的一升生物反应器以运行标准地衣芽孢杆菌发酵过程,来比较在包含实例2中描述的“rpoC-D796G”取代的经修饰的地衣芽孢杆菌细胞和野生型(亲本)地衣芽孢杆菌细胞中的淀粉酶-3酶表达。经修饰的和未经修饰的(野生型;亲本)地衣芽孢杆菌细胞还包含实例2中示出的淀粉酶-3表达盒。
1L发酵进行90小时,其中在指定的时间点取样(参见图6),并测量OD600和淀粉酶-3活性。
如图6所示,经修饰的地衣芽孢杆菌细胞(包含rpoC-D796G取代)示出比亲本(野生型)地衣芽孢杆菌细胞显著增加的酶活性。同样地,经修饰的地衣芽孢杆菌具有更高的OD600读数,表明更大的细胞群(其本身可以产生更高的酶活性)。为了说明OD差异,图6中呈现的数据表示为U/g/OD600单位,其表明相对于亲本地衣芽孢杆菌,来自经修饰的地衣芽孢杆菌细胞的酶活性的明显增加。
实例9
经修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞的转化效率
在本实例中,分析经修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞的转化效率,以了解其摄取包含编码GC358淀粉酶的目的基因的复制质粒的能力,如美国专利号8,361,755中所述。
更具体地说,分析了以下三种地衣芽孢杆菌宿主细胞的转化效率:宿主细胞1是编码rpoB(478V)多肽(SEQ ID NO:4)和野生型(天然)rpoC多肽(SEQ ID NO:8)的亲本(对照)地衣芽孢杆菌宿主细胞;宿主细胞2是编码经修饰的rpoB多肽(即,在SEQ ID NO:4的位置478处的缬氨酸至丙氨酸取代)和野生型(天然)rpoC多肽(SEQ ID NO:8)的经修饰的(子代)地衣芽孢杆菌宿主细胞,并且宿主细胞3是编码rpoB(V478A)多肽(SEQ ID NO:4)和经修饰的rpoC多肽(即,在SEQ ID NO:8的位置796处的天冬氨酸至甘氨酸取代)的经修饰的子代地衣芽孢杆菌宿主细胞。另外,为了在上述宿主细胞中进行感受态测定,每个宿主细胞包含从木糖诱导型启动子表达ComK的pBL-ComK质粒(例如,参见图7质粒图谱)。
转化效率测定
将上述的亲本(对照)地衣芽孢杆菌宿主细胞(即,宿主细胞1)和经修饰的(子代)地衣芽孢杆菌宿主细胞(即,宿主细胞2和宿主细胞3)铺板在含有100mg/l壮观霉素的LB平板上并在37℃培养过夜。从单菌落接种含有25ml含有100mg/l壮观霉素的LB的重复预培养的摇瓶,并使用50ml培养液(throw)在37℃以250RPM培养过夜。
从该预培养物中,在含有100mg/l壮观霉素的50ml LB中以0.7的OD600(一式两份)接种主培养物。主要培养物在250ml带挡板的锥形瓶中进行,并使用50ml培养液在37℃以250RPM培养。总共八(8)小时一小时一次,测量OD600。培养第一小时后,向培养肉汤中加入0.3%木糖。在三(3)、四(4)、五(5)、六(6)、七(7)和八(8)小时的时间点,将112.5μl培养肉汤添加到12.5μl的100%的DMSO中并且储存在-80℃。
通过使用质粒pHPLT-GC358淀粉酶测试转化效率(图8)。该质粒含有克隆到pHPLT载体(Solingen等人,2001)中的用于表达GC358淀粉酶的基因(例如,参见,US 8,361,755)。在添加质粒DNA后,将细胞在设定为1000RPM的台式热振荡器(tabletop thermoshaker)中于37℃孵育一(1)小时。将细胞铺在含有20mg/l新霉素的淀粉平板上。在37℃孵育两(2)天后,计数所有形成晕圈的菌落。
结果
如图9所示,对照(亲本)地衣芽孢杆菌宿主细胞(即,宿主细胞1;包含/编码rpoB(478V)、野生型(天然)rpoC多肽和质粒pBLComK)示出转化效率为约10个菌落形成单位(CFU),其中在7小时峰值为15CFU。包含/编码经修饰的rpoB多肽(V478A;参见,图10)的经修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞(即宿主细胞2)相对于亲本(对照)宿主细胞示出转化效率降低(图9),其中CFU平均计数为3CFU。这些结果表明rpoB(478V)导致转化效率提高3倍以上。
相反,包含/编码rpoB(V478A)多肽和经修饰的rpoC多肽(D796G)的经修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞(即,宿主细胞3;参见图11)示出与亲本(对照)宿主细胞(图9)相比转化效率增加超过14倍,并且与宿主细胞2(图10)相比转化效率增加超过73倍,表明rpoC“D796G”突变对地衣芽孢杆菌的转化效率有显著和积极的影响。
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Claims (37)
1.一种相对于未经修饰的革兰氏阳性细菌细胞表达增加量的目的蛋白(POI)的经修饰的革兰氏阳性细菌细胞,其中所述经修饰的细菌细胞在编码变体RNA聚合酶(RNAP)β'-亚基多肽的rpoC基因中包含至少一个突变。
2.如权利要求1所述的经修饰的细胞,其中将所述编码变体β'-亚基多肽的rpoC基因整合到所述经修饰的细胞的染色体中。
3.如权利要求1所述的经修饰的细胞,其中将所述编码变体β'-亚基多肽的rpoC基因包含在所述经修饰的细胞的染色体外质粒中。
4.如权利要求1所述的经修饰的细胞,其中包含所述至少一个突变的编码变体β'-亚基多肽的所述rpoC基因衍生自野生型rpoC基因或其变体,所述rpoC基因与SEQ ID NO:5具有至少80%的序列同一性。
5.如权利要求1所述的经修饰的细胞,其中所述rpoC基因编码与SEQ ID NO:6具有至少90%序列同一性的变体β′-亚基多肽。
6.如权利要求1所述的经修饰的细胞,其中包含所述至少一个突变的编码变体β'-亚基多肽的所述rpoC基因衍生自野生型rpoC基因或其变体,所述rpoC基因与SEQ ID NO:7具有至少80%的序列同一性。
7.如权利要求1所述的经修饰的细胞,其中所述rpoC基因编码与SEQ ID NO:8具有至少90%序列同一性的变体β′-亚基多肽。
8.如权利要求5所述的经修饰的细胞,其中SEQ ID NO:6的变体β′-亚基多肽在SEQ IDNO:6的氨基酸残基位置751、784、797、796和/或1018-1020处或者在任何细菌RNAPβ'-亚基家族成员中的等同位置处包含至少一个突变。
9.如权利要求1所述的经修饰的细胞,其中所述变体β′-亚基多肽包含至少一个选自下组的突变:在SEQ ID NO:6的氨基酸残基751处的甲硫氨酸至异亮氨酸的取代(M751I)、在SEQ ID NO:6的氨基酸残基784处精氨酸至组氨酸的取代(R784H)、在SEQ ID NO:6的氨基酸残基797处的丝氨酸至苯丙氨酸的取代(S797F)、在SEQ ID NO:6的氨基酸残基796处的天冬氨酸至甘氨酸的取代(D796G)和/或SEQ ID NO:6的氨基酸残基1,018、1,019和1,020的缺失(ΔI1018-R1020)。
10.如权利要求7所述的经修饰的细胞,其中SEQ ID NO:8的变体β′-亚基多肽在SEQ IDNO:8的氨基酸残基位置751、784、797、796和/或1018-1020处或者在任何细菌RNAPβ'-亚基家族成员中的等同位置处包含至少一个突变。
11.如权利要求1所述的经修饰的细胞,其中所述变体β′-亚基多肽包含至少一个选自下组的突变:在SEQ ID NO:8的氨基酸残基751处的甲硫氨酸至异亮氨酸的取代(M751I)、在SEQ ID NO:8的氨基酸残基784处精氨酸至组氨酸的取代(R784H)、在SEQ ID NO:8的氨基酸残基797处的丝氨酸至苯丙氨酸的取代(S797F)、在SEQ ID NO:8的氨基酸残基796处的天冬氨酸至甘氨酸的取代(D796G)和/或SEQ ID NO:8的氨基酸残基1,018、1,019和1,020的缺失(ΔI1018-R1020)。
12.如权利要求1所述的经修饰的细胞,其进一步包含在编码变体RNAPβ-亚基多肽的rpoB基因中的至少一个突变。
13.如权利要求1所述的经修饰的细胞,其中相对于所述未经修饰的革兰氏阳性对照细胞,所表达的POI的增加量为至少5%。
14.如权利要求1所述的经修饰的细胞,其中相对于所述未经修饰的革兰氏阳性对照细胞,所表达的POI的增加量为至少10%。
15.如权利要求1所述的经修饰的细胞,其中所述芽孢杆菌属(Bacillus)细胞选自:枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、索诺拉沙漠芽孢杆菌(B.sonorensis)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、饲料芽孢杆菌(B.pabuli)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、黏琼脂芽孢杆菌(B.agaradhaerens)、秋叶氏芽孢杆菌(B akibai)、库拉奇芽孢杆菌(B.clarkii)、假坚强芽孢杆菌(B.pseudofirmus)、列城芽孢杆菌(B.lehensis)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、吉氏芽孢杆菌(B.gibsonii)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。
16.如权利要求1所述的经修饰的细胞,其中所述POI由所述经修饰的细菌细胞的外源基因或所述经修饰的细菌细胞的内源基因编码。
17.一种由权利要求1所述的经修饰的细胞产生的分离的目的蛋白(POI)。
18.一种用于在革兰氏阳性细菌细胞中增加目的蛋白(POI)的表达的方法,其包括:
(a)获得一种表达增加量的POI的经修饰的革兰氏阳性细菌细胞,其中所述经修饰的细菌细胞在编码变体RNA聚合酶(RNAP)β'-亚基多肽的rpoC基因中包含至少一个突变,和
(b)在表达所述POI的条件下培养所述经修饰的细胞,
其中所述表达增加量的POI的经修饰的细菌细胞是相对于未经修饰的革兰氏阳性细菌细胞中POI的表达而言的。
19.如权利要求18所述的方法,其中包含所述至少一个突变的编码变体β'-亚基多肽的所述rpoC基因衍生自野生型rpoC基因或其变体,所述rpoC基因与SEQ ID NO:5具有至少80%的序列同一性。
20.如权利要求18所述的方法,其中包含所述至少一个突变的编码变体β'-亚基多肽的所述rpoC基因衍生自野生型rpoC基因或其变体,所述rpoC基因与SEQ ID NO:7具有至少80%的序列同一性。
21.如权利要求18所述的方法,其进一步包含在编码变体RNAPβ-亚基多肽的rpoB基因中的至少一个突变。
22.如权利要求18所述的方法,其中相对于所述未经修饰的革兰氏阳性对照细胞,所表达的POI的增加量为至少5%。
23.一种由权利要求18所述的方法产生的分离的目的蛋白(POI)。
24.一种用于获得表达增加量的POI的经修饰的革兰氏阳性细菌细胞的方法,其包括:
(a)将至少一个rpoC基因修饰引入亲本革兰氏阳性细菌细胞,和
(b)选择表达增加量的POI的一个或多个子代细胞。
25.一种包含经修饰的rpoC基因的整合载体,所述经修饰的rpoC基因在编码变体的RNA聚合酶(RNAP)β'-亚基多肽的rpoC基因中包含至少一个突变。
26.一种革兰氏阳性细菌细胞,其包含如权利要求25所述的整合质粒。
27.一种用于获得转化的芽孢杆菌属宿主细胞的方法,其包括:
(a)将外源多核苷酸转化到芽孢杆菌属宿主细胞中,所述芽孢杆菌属宿主细胞通过至少一个拷贝的引入的第一核酸构建体而成为感受态,所述引入的第一核酸构建体包含启动子区域5'并且与编码经修饰的rpoC多肽的多核苷酸有效地连接,其中所述经修饰的rpoC多肽包含与SEQ ID NO:8的90%序列同一性和在SEQ ID NO:8的位置796处的天冬氨酸至甘氨酸的取代,其中所述编码rpoC多肽的多核苷酸对于在引入所述第一核酸构建体之前是非感受态的芽孢杆菌属宿主细胞而言是外源的,和
(b)分离包含外源多核苷酸的芽孢杆菌属宿主细胞的转化体。
28.如权利要求27所述的方法,其中所述感受态芽孢杆菌属宿主细胞进一步包含至少一个拷贝的引入的第二核酸构建体,所述引入的第二核酸构建体包含启动子区域5'并且与编码ComK多肽的多核苷酸有效地连接以使所述宿主细胞更具感受态。
29.一种从权利要求27所述的方法获得的转化的芽孢杆菌属宿主细胞。
30.一种获得感受态芽孢杆菌属宿主细胞的方法,其包括:
(a)向非感受态芽孢杆菌属宿主细胞中引入至少一个拷贝的第一核酸构建体,所述第一核酸构建体包含启动子区域5'并且与编码经修饰的rpoC多肽的多核苷酸有效地连接,其中所述经修饰的rpoC多肽包含与SEQ ID NO:8的90%序列同一性和SEQ ID NO:8的位置796处的天冬氨酸至甘氨酸的取代,其中所述编码rpoC多肽的多核苷酸对于芽孢杆菌属宿主细胞是外源的,和
(b)分离感受态芽孢杆菌属宿主细胞,所述感受态芽孢杆菌属宿主细胞包含步骤(a)的引入的多核苷酸。
31.如权利要求30所述的方法,其中所述感受态芽孢杆菌属宿主细胞进一步包含至少一个拷贝的引入的第二核酸构建体,所述引入的第二核酸构建体包含启动子区域5'并且与编码ComK多肽的多核苷酸有效地连接。
32.一种从权利要求30所述的方法获得的感受态芽孢杆菌属宿主细胞。
33.一种感受态芽孢杆菌属宿主细胞,其包含至少一个拷贝的第一核酸构建体,所述第一核酸构建体包含启动子区域5'并与编码经修饰的rpoC多肽的多核苷酸有效地连接,所述经修饰的rpoC多肽包含与SEQ ID NO:8的90%的序列同一性和在SEQ ID NO:8的位置796处的天冬氨酸至甘氨酸的取代,其中所述编码rpoC多肽的多核苷酸对于在引入所述第一核酸构建体之前是非感受态的芽孢杆菌属宿主细胞而言是外源的。
34.一种用于获得转化的芽孢杆菌属宿主细胞的方法,其包括:
(a)将外源多核苷酸转化到芽孢杆菌属宿主细胞中,所述芽孢杆菌属宿主细胞通过至少一个拷贝的引入的第一核酸构建体而成为感受态,所述引入的第一核酸构建体包含启动子区域5'并且与编码rpoB多肽的多核苷酸有效地连接,其中经修饰的rpoB多肽包含与SEQID NO:4的90%序列同一性并且包含SEQ ID NO:4的位置478处的缬氨酸残基,其中所述编码rpoB多肽的多核苷酸对于在引入第一核酸构建体之前是非感受态的芽孢杆菌属宿主细胞而言是外来的,和
(b)分离包含所述外源多核苷酸的芽孢杆菌属宿主细胞的转化体。
35.一种从权利要求34所述的方法获得的转化的芽孢杆菌属宿主细胞。
36.一种获得感受态芽孢杆菌属宿主细胞的方法,其包括:
(a)向非感受态芽孢杆菌属宿主细胞中引入至少一个拷贝的第一核酸构建体,所述第一核酸构建体包含启动子区域5'并且与编码rpoB多肽的多核苷酸有效地连接,其中所述rpoB多肽包含与SEQ ID NO:4的90%序列同一性并且包含SEQ ID NO:4的位置478处的缬氨酸残基,其中所述编码rpoB多肽的多核苷酸对于芽孢杆菌属宿主细胞而言是外源的,和
(b)分离感受态芽孢杆菌属宿主细胞,所述感受态芽孢杆菌属宿主细胞包含步骤(a)的引入的多核苷酸。
37.一种从权利要求36所述的方法获得的转化的芽孢杆菌属宿主细胞。
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