CN104974946A

CN104974946A - 耐高渗透压的重组大肠杆菌及其应用

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Publication number: CN104974946A
Application number: CN201410138473.8A
Authority: CN
Inventors: 张学礼; 朱欣娜; 肖孟雍; 陈晶; 马延和
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2014-04-08
Filing date: 2014-04-08
Publication date: 2015-10-14
Anticipated expiration: 2034-04-08
Also published as: CN104974946B

Abstract

本发明涉及通过遗传工程改造大肠杆菌的领域。具体而言，本发明提供了一种含有突变的rpoB、cusS和/或mreC基因的重组大肠杆菌。本发明还涉及使用所述大肠杆菌用于生产如丁二酸等化工原料的用途。本发明还提供了使用所述大肠杆菌生产丁二酸等化工原料的方法，以及通过引入突变的rpoB、cusS和/或mreC基因而提高大肠杆菌耐渗透压能力的方法。

Description

耐高渗透压的重组大肠杆菌及其应用

发明领域

发明背景

微生物细胞的生理性能是微生物工程菌发酵的核心问题之一。良好的微生物工程菌需要具备以下生理特性：耐受高浓度的葡萄糖、耐受高浓度的产物、耐受高温和耐受低pH。

微生物细胞为了生存和生长，胞质内的渗透压保持在280-320mosM，平均为300mosM左右(Higgins et al.1987,Trends Biochem Sci12:339-344)。当培养基溶液的渗透压高于320mosM，细胞会发生收缩产生质壁分离现象。细胞生长减慢，在低生长速率情况下，大部分的基因会停止表达。大肠杆菌细胞同时会启动渗透压调节机制：吸收K⁺，积累脯氨酸，合成海藻糖，甜菜碱等两性离子化合物等；细胞外膜组分蛋白OmpC的合成增加(Postma et al.1996,Escherichia coli and Salmonella,2rd:1210-1224)。此外，在高渗透压条件下（23g/L NaCl，渗透压相当于800mosM），还有40个基因表达上调，107个基因表达下调(Weber et al.2002,J Bacteriol184:5502-5507)，这些基因的表达是否和渗透压调节相关还有待鉴定。

通过适应性进化可以提高菌株对高渗透压的耐受性，提高工程菌株的产量和产率。Liu等(Liu et al.2007,Biotechnol Bioeng97:825-832)在70g/l（渗透压相当于2392mosM）的NaCl中连续培养光滑球拟酵母，筛选得到耐高渗透压的突变株RS23。相对于野生型，突变株RS23丙酮酸的产量和产率增长41.1%和11.1%。Fang等(Fang et al.2011,World J Microbiol Biotechnol27:3009-3013)采用相同的手段，在42g/l（渗透压相当于1436mosM）的NaCl中连续培养琥珀酸放线杆菌，筛选得到耐高渗透压的突变株CH050。相对于野生型，突变株CH050丁二酸的产量和产率增长了37.5%和4.37%。但是，这些研究对菌株耐高渗透压的基因及相关机制并没有进行解析。

用无机盐培养基发酵常常需要葡萄糖作为碳源，在一定范围内，目标产物的产量会随着葡萄糖浓度的增加而增加。但若葡萄糖浓度过高，由于渗透压过大，将影响菌株的生长和代谢。另外，用中性pH进行有机酸发酵时，发酵产物有机酸盐会导致高渗透压，对细胞生长和代谢产生抑制作用。因此，微生物工程菌株对渗透压的耐受性尤为重要。

发明概述

在一个方面，本发明提供了一种重组大肠杆菌，其含有选自如下的一种或多种突变的基因：(a)突变的rpoB基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID No.:1所示氨基酸序列的位置D654的位置上含有修饰；(b)突变的cusS基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID No.:2所示氨基酸序列的位置G210的位置上含有修饰；和(c)突变的mreC基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID No.:3所示氨基酸序列的位置G24的位置上含有修饰。

在一个实施方案中，本发明的重组大肠杆菌中所述突变的rpoB基因所编码的多肽在对应于SEQ ID No.:1所示氨基酸序列的位置D654的位置上是用Y置换D。

在一个实施方案中，本发明的重组大肠杆菌中所述突变的cusS基因所编码的多肽在对应于SEQ ID No.:2所示氨基酸序列的位置G210的位置上是用V置换G。

在一个实施方案中，本发明的重组大肠杆菌中所述突变的mreC基因所编码的多肽在对应于SEQ ID No.:3所示氨基酸序列的位置G24的位置上是用D置换G。

在一个实施方案中，本发明提供了一种重组大肠杆菌，其含有如下的一种或多种突变的基因：(a)突变的rpoB基因，其核苷酸序列在对应于SEQ ID No.:4所示核苷酸序列的位置G1960的位置上含有修饰；(b)突变的cusS基因，其核苷酸序列在对应于SEQ ID No.:5所示核苷酸序列的位置G629的位置上含有修饰；和(c)突变的mreC基因，其核苷酸序列在对应于SEQ ID No.:6所示核苷酸序列的位置G71的位置上含有修饰。

在一个实施方案中，本发明的重组大肠杆菌中所述突变的rpoB基因的核苷酸序列在对应于SEQ ID No.:4所示核苷酸序列的位置G1960的位置上是用T置换G。

在一个实施方案中，本发明的重组大肠杆菌中所述突变的cusS基因的核苷酸序列在对应于SEQ ID No.:5所示核苷酸序列的位置G629的位置上是用T置换G。

在一个实施方案中，本发明的重组大肠杆菌中所述突变的mreC基因的核苷酸序列在对应于SEQ ID No.:6所示核苷酸序列的位置G71的位置上是用A置换G。

在一个实施方案中，本发明的重组大肠杆菌中还含有如下修饰：磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)中所涉及的一或多个基因表达的抑制、和/或磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)中所涉及的基因所编码的蛋白质活性的抑制；pflB和/或adhE基因表达的抑制、和/或pflB和/或adhE基因所编码的蛋白质活性的抑制；ldhA基因表达的抑制、和/或ldhA基因所编码的蛋白质活性的抑制；galP基因和/或外源glf基因表达的增强、和/或galP基因和/或外源glf基因所编码的蛋白质活性的增强；和pck基因表达的增强、和/或pck基因所编码的蛋白质活性的增强。

在一个实施方案中，本发明的重组大肠杆菌中的磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)中所涉及的一或多个基因的表达被抑制或者其所编码的蛋白质的活性被抑制，其中所述一或多个基因是选自如下的一或多个基因：编码PTS系统酶I的基因ptsI、编码PTS系统酶Hpr的基因ptsH、编码PTS系统酶IIA^Glc的基因crr和编码PTS系统酶IICB^Glc的基因ptsG。

在一个实施方案中，本发明的重组大肠杆菌中还含有如下的修饰：pta基因和ackA基因表达的抑制、和/或pta基因和ackA基因所编码的蛋白质活性的抑制；和aceA基因、aceB基因和dcuC基因表达的增强、和/或aceA基因、aceB基因和dcuC基因所编码的蛋白质活性的增强。

在一个实施方案中，本发明的重组大肠杆菌中还含有如下修饰：mgsA基因表达的抑制、和/或mgsA基因所编码的蛋白质活性的抑制。

在第二个方面，本发明提供了生产丁二酸的方法，所述方法包括：(a)发酵培养本发明的重组大肠杆菌;和(b)收获产生的丁二酸；以及任选地分离或纯化所述丁二酸。

在一个实施方案中，本发明生产丁二酸的方法中，发酵培养本发明的重组大肠杆菌的步骤包括使用高浓度的葡萄糖和/或高浓度丁二酸盐。

在第三个方面，本发明提供了使用本发明的重组大肠杆菌以用于生产丁二酸的用途。

在第四个方面，本发明提供了提高大肠杆菌耐渗透压能力的方法，所述方法包括在大肠杆菌中引入选自如下的一种或多种突变的基因：(a)突变的rpoB基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID No.:1所示氨基酸序列的位置D654的位置上含有修饰；(b)突变的cusS基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID No.:2所示氨基酸序列的位置G210的位置上含有修饰；和(c)突变的mreC基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID No.:3所示氨基酸序列的位置G24的位置上含有修饰。

在一个实施方案中，本发明的方法中所述突变的rpoB基因所编码的多肽在对应于SEQ ID No.:1所示氨基酸序列的位置D654的位置上是用Y置换D。

在一个实施方案中，本发明的方法中所述突变的cusS基因所编码的多肽在对应于SEQ ID No.:2所示氨基酸序列的位置G210的位置上是用V置换G。

在一个实施方案中，本发明的方法中所述突变的mreC基因所编码的多肽在对应于SEQ ID No.:3所示氨基酸序列的位置G24的位置上是用D置换G。

附图简述

图1：(A)野生型rpoB基因以及突变的rpoB基因(rpoB*)所编码的多肽的氨基酸序列(分别为SEQ ID No.:1(野生型)和SEQ ID No.:7(突变的))比对；(B)野生型rpoB基因(SEQ ID No.:4)以及突变的rpoB基因(rpoB*)(SEQ ID No.:10)的核苷酸序列比对。

图2：(A)野生型cusS基因以及突变的cusS基因(cusS*)所编码的多肽的氨基酸序列(分别为SEQ ID No.:2(野生型)和SEQ ID No.:8(突变的))比对；(B)野生型cusS基因(SEQ ID No.:5)以及突变的cusS基因(cusS*)(SEQ ID No.:11)的核苷酸序列比对。

图3：(A)野生型mreC基因以及突变的mreC基因(mreC*)所编码的多肽的氨基酸序列(分别为SEQ ID No.:3(野生型)和SEQ ID No.:9(突变的))比对；(B)野生型mreC基因(SEQ ID No.:6)以及突变的mreC基因(mreC*)(SEQ ID No.:12)的核苷酸序列比对。

图4：野生型大肠杆菌ATCC8739在含5%、20%和25%葡萄糖的无机盐培养基中的生长曲线。

图5：(A)野生型大肠杆菌ATCC8739和突变株MX-202（ATCC8739,rpoB*）、MX-204（ATCC8739,cusS*）、MX-206(ATCC8739,mreC*)在含20%葡萄糖的无机盐培养基中的生长曲线。(B)野生型大肠杆菌ATCC8739和突变株MX-202、MX-204、MX-206在含25%葡萄糖的无机盐培养基中的生长曲线。

图6：大肠菌株野生型ATCC8739在含不同浓度丁二酸二钠培养基中的生长曲线。

图7：(A)野生型大肠杆菌ATCC8739和突变株MX-202（ATCC8739,rpoB*）、MX-204（ATCC8739,cusS*）、MX-206(ATCC8739,mreC*)含43g/L丁二酸二钠培养基中的生长曲线。(B)野生型大肠杆菌ATCC8739和突变株MX-202（ATCC8739,rpoB*）、MX-204（ATCC8739,cusS*）、MX-206(ATCC8739,mreC*)含86g/L丁二酸二钠培养基中的生长曲线。

发明详述

除非另有说明，所有技术和科学术语都具有本领域所知的常见含义。所有专利、专利申请、公开出版物、序列、以及其他公开材料均援引加入本文，除非另有说明。

在一个实施方案中，本发明的重组大肠杆菌中同时含有2种所述突变的基因。在一个实施方案中，本发明的重组大肠杆菌中同时含有3种所述突变的基因。

在一个实施方案中，本发明的重组大肠杆菌中含有如下突变的基因：(a)突变的rpoB基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID No.:1所示氨基酸序列的位置D654的位置上含有修饰；和(b)突变的cusS基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID No.:2所示氨基酸序列的位置G210的位置上含有修饰。

在一个实施方案中，本发明的重组大肠杆菌中含有如下突变的基因：(a)突变的rpoB基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID No.:1所示氨基酸序列的位置D654的位置上含有修饰；和(c)突变的mreC基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID No.:3所示氨基酸序列的位置G24的位置上含有修饰。

在一个实施方案中，本发明的重组大肠杆菌中含有如下突变的基因：(b)突变的cusS基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID No.:2所示氨基酸序列的位置G210的位置上含有修饰；和(c)突变的mreC基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID No.:3所示氨基酸序列的位置G24的位置上含有修饰。

在一个实施方案中，本发明的重组大肠杆菌中含有如下突变的基因：(a)突变的rpoB基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID No.:1所示氨基酸序列的位置D654的位置上含有修饰；(b)突变的cusS基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID No.:2所示氨基酸序列的位置G210的位置上含有修饰；和(c)突变的mreC基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID No.:3所示氨基酸序列的位置G24的位置上含有修饰。

本发明的重组大肠杆菌中所述的突变的基因的增加了丁二酸的产量和产率，和/或所述突变的基因增加了该重组大肠杆菌对于葡萄糖的耐受性和/或丁二酸盐的耐受性。另外，本发明的重组大肠杆菌中所述的突变的基因之间还具有协同效应、和/或加合效应。

在本发明的实施方案中，对应的位置是通过与相应的序列进行序列比对而确定的。例如，对应于SEQ ID No.:1所示氨基酸序列的位置D654的位置，是通过与SEQ ID No.:1所示氨基酸序列进行序列比对而确定的对应于SEQ ID No.:1中D654的位置。

术语“突变”具有本领域内常用的含义，是指在核苷酸序列中插入、添加、缺失、或者置换一或多个核苷酸，或者是指在多肽序列中插入、添加、缺失、或者置换一或多个氨基酸。

如本文所用，rpoB基因(Genbank No.ACA79637.1)编码RNA聚合酶β亚基。在本发明的一个实施方案中，所使用的初始大肠杆菌菌株中的野生型rpoB基因的核苷酸序列如SEQ ID No.:1所示，其所编码的多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.:4所示。在一个实施方案中，本发明的重组大肠杆菌中所包含的突变的rpoB基因含有对应于如下突变：G1960T(参见图1B)；而所述突变的rpoB基因所编码的多肽具有对应于如下突变的一个氨基酸置换：D654Y(参见图1A)。

如本文所用，cusS基因(Genbank No.ACA79044.1)编码双元调控组氨酸激酶(EC No:2.7.13.3)。在本发明的一个实施方案中，所使用的初始大肠杆菌菌株中的野生型cusS基因的核苷酸序列如SEQ ID No.:2所示，其所编码的多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.:5所示。在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌中所包含的突变的cusS基因含有对应于如下突变：G629T(参见图2B)；而所述突变的cusS基因所编码的多肽具有对应于如下突变的一个氨基酸置换：D210V(参见图2A)。

如本文所用，mreC基因(Genbank No.ACA76134.1)编码杆状决定蛋白。在本发明的一个实施方案中，所使用的初始大肠杆菌菌株中的野生型mreC基因的核苷酸序列如SEQ ID No.:3所示，其所编码的多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.:6所示。在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌中所包含的突变的mreC基因含有对应于如下突变：G71A(参见图3B)；而所述突变的mreC基因所编码的多肽具有对应于如下突变的一氨基酸置换：G24D(参见图3A)。

在一个实施方案中，所述突变的rpoB基因编码的多肽序列包含SEQ ID No.:7所示序列。在一个实施方案中，所述突变的rpoB基因序列包含SEQ ID No.:10所示序列。

在一个实施方案中，所述突变的cusS基因编码的多肽序列包含SEQ ID No.:8所示序列。在一个实施方案中，所述突变的cusS基因序列包含SEQ ID No.:11所示序列。

在一个实施方案中，所述突变的mreC基因编码的多肽序列包含SEQ ID No.:9所示序列。在一个实施方案中，所述突变的mreC基因序列包含SEQ ID No.:12所示序列。

在一个实施方案中，所述突变的基因的表达可以被增强、或者抑制。

如本文所用，术语“基因表达增强”，其具有本领域内熟知的含义，是指基因表达强度的增强，并导致基因转录后产生的mRNA数量的增加。基因表达增强可以通过如下方式实现，例如但不限于：在基因前引入强启动子、增加基因的拷贝数、或者增强mRNA的稳定性等。如本文所用，术语“基因所编码的蛋白活性增强”具有本领域内熟知的含义，是指基因转录翻译后产生的蛋白活性的增加。其可以例如通过基因表达强度的增强、增加酶在细胞中的含量、氨基酸位点的突变来实现。实现“基因的表达增强”以及“基因所编码的蛋白质的活性增强”的各种技术手段是本领域技术人员熟知的。

在本发明中，基因表达增强可以例如通过引入强启动子来实现。在本发明的一些实施方案中，使用的强启动子例如是：Ppck*(SEQ ID No.:13)(Zhang et al.,2009,Appl Environ Microbiol75:7807-7813)、M1-37(SEQ ID No.:14)、或M1-93(SEQ ID No.:15)(Lu et al.,2012,Appl Microbiol Biotechnol93:2455-2426)。

在一个实施方案中，本发明的重组大肠杆菌中所述的突变的基因可以位于质粒中。在一个实施方案中，本发明的重组大肠杆菌中所述的突变的基因可以位于染色体中。

如本文所用，术语“质粒”具有本领域熟知的定义，其是以附加体形式存在于细胞中的非染色体DNA并且能够自主复制的DNA分子。本发明中可以使用的质粒例如有：pEASY-Blunt和pKD46等。

如本文所用，术语“染色体”具有本领域熟知的定义。在一些实施方案中，本发明所涉及的经修饰的基因位于染色体中。将经修饰的基因整合至染色体的技术是本领域技术人员熟知的，例如可以参见Michael R.Green和Joseph Sambrook的"Molecular Cloning:A Laboratory Manual"(Fourth Edition)。

在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有选自如下的一或多种修饰：磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)所涉及的一或多个基因表达的抑制、和/或磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)所涉及的基因所编码的蛋白质活性的抑制；pflB基因表达的抑制、和/或pflB所编码的蛋白质活性的抑制；ldhA基因表达的抑制、和/或ldhA基因所编码的蛋白质活性的抑制；galP基因和/或外源glf基因表达的增强、和/或galP基因；和pck基因表达的增强、和/或pck基因所编码的蛋白质活性的增强。

在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌中磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)所涉及的一或多个基因表达的抑制、和/或磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)中所涉及的一或多个基因所编码的蛋白质活性的抑制，其中所述一或多个基因是选自如下的一或多种基因：编码PTS系统酶I的基因ptsI、编码PTS系统酶Hpr的基因ptsH、编码PTS系统酶IIA^Glc的基因crr和编码PTS系统酶IICB^Glc的基因ptsG。

在本发明中，ptsI基因(GenBank No:ACA76928.1、NC_010468.1)编码一种磷酸转移酶，其被称为磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶I(EC No:2.7.3.9)。ptsH基因(GenBank No:ACA76929.1)编码磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶Hpr(EC No:2.7.1.69)。crr基因(GenBank No:ACA76927.1)编码磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶IIAGlc(EC No:2.7.1.69)。ptsG基因(GenBank No:ACA78131.1)编码磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶IICBGlc(EC No:2.7.1.69)。

在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有选自如下的一或多种修饰：ptsI基因表达的抑制、和/或ptsI基因所编码的蛋白质的活性抑制；pflB基因表达的抑制、和/或pflB基因所编码的蛋白质活性的抑制；ldhA基因表达的抑制、和/或ldhA基因所编码的蛋白质活性的抑制；galP基因表达的增强、和/或galP基因所编码的蛋白质活性的增强；和pck基因表达的增强、和/或pck基因所编码的蛋白质活性的增强。

在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有选自如下修饰：ptsI基因表达的抑制、和/或ptsI基因所编码的蛋白质的活性抑制；pflB基因表达的抑制、和/或pflB所编码的蛋白质活性的抑制；ldhA基因表达的抑制、和/或ldhA基因所编码的蛋白质活性的抑制；galP基因表达的增强、和/或galP基因所编码的蛋白质活性的增强；和pck基因表达的增强、和/或pck基因所编码的蛋白质活性的增强。

在本发明中，pflB基因(GenBank No:ACA78322.1)编码丙酮酸甲酸裂解酶(Pyruvate formate lyase)(EC No:2.3.1.54)。ldhA基因(GenBank No:ACA77176.1)编码乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase A)(EC No:1.1.1.28)。galP基因(GenBank No:ACA76443.1)编码半乳糖MFS转运蛋白。pck基因(GenBank No:ACA75988.1)编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶,又称作PCK酶(EC No:4.1.1.49)。

如本文所用，术语“基因表达的抑制”具有本领域内熟知的含义，是指基因表达强度的降低，从而导致基因转录后产生的mRNA数量的减少。基因表达的抑制可以通过如下方式实现，例如但不限于：基因的敲除、减少基因的拷贝数、改变基因的启动子(例如使用弱启动子)等。如本文所用，术语“基因所编码的蛋白质的活性抑制”具有本领域内熟知的含义，是指基因转录翻译后产生的蛋白活性的降低。其可以例如通过基因表达强度的降低、基因中核苷酸的插入或缺失、氨基酸位点的突变来实现。实现“基因表达的抑制”以及“基因所编码的蛋白质的活性抑制”的各种技术手段是本领域技术人员熟知的。

在第二方面，本发明提供了一种生产化工原料的方法，其中包括培养本发明的重组大肠杆菌的步骤。

在一个实施方案中，本发明的方法包括培养本发明的重组大肠杆菌的步骤，以及任选的分离或纯化所得的化工原料的步骤。

本发明的方法可以用于生产各种可通过微生物发酵产生的化工原料，包括但不限于：丁二酸、D-乳酸、L-乳酸、乙醇、丁醇和1,3-丙二醇等。

在一个实施方案中，本发明所述的“培养”包括种子培养和发酵培养。

如本文所用，术语“种子培养”是指将用于发酵的菌种在固体培养基上活化后，再经过摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种的过程。

如本文所用，术语“发酵培养”是指利用微生物菌种，在适宜的条件下，将培养基组分经过特定的代谢途径转化为某些特定产物的过程。

在一个实施方案中，本发明的方法中包括将本发明的大肠杆菌厌氧发酵。

如本文所用，术语“厌氧发酵”是指利用厌氧发酵菌株，在隔绝空气的条件下，经特定代谢途径将培养基组分转化为某些特定产物的过程。

在一个实施方案中，本发明的方法中的培养过程不进行任何通气步骤。

在一个实施方案中，本发明中对大肠杆菌进行培养的方法包括以下步骤：

(1)将本发明的重组大肠杆菌接种于种子培养基，在适宜大肠杆菌生长的条件下培养一段时间得到种子液；

(2)将种子液接种于发酵培养基，在厌氧条件下培养。

本发明的方法中可以使用本领域中常规用于培养大肠杆菌的各种培养条件，例如培养基、培养温度、培养时间和是否摇动以及摇动速度等。本领域技术人员根据需要可以选择适当的培养条件。本发明的方法中所使用的培养条件以及发酵条件是本领域技术人员熟知的(诸葛健等，1994，工业微生物实验技术手册，中国轻工业出版社)。

在一个实施方案中，本发明的培养条件包括但不限于：温度为30-45℃，例如30-31℃、31-32℃、32-33℃、33-34℃、34-35℃、35-36℃、36-37℃、37-38℃、38-39℃、39-40℃、40-41℃、41-42℃、42-43℃、43-44℃、或44-45℃。

在一个实施方案中，本发明的培养条件包括但不限于：种子培养的时间为6-16小时，例如6-7小时、7-8小时、8-9小时、9-10小时、10-11小时、11-12小时、12-13小时、13-14小时、14-15小时、或15-16小时。

在一个实施方案中，本发明的培养条件包括但不限于：发酵培养的时间为2-5天，例如2天、3天、4天、或5天。

在一个实施方案中，本发明的培养条件包括但不限于：将本发明的重组大肠杆菌按照0.1-10%(V/V)的接种量接种于种子培养基，例如0.1%、0.5%、1%、2.5%、5%、或10%。。

在一实施方案中，本发明的培养条件包括但不限于：将种子液按照终浓度OD₅₅₀=0.05-0.5的接种量接种于发酵培养基，例如OD₅₅₀为0.05-0.1、0.1-0.2、0.2-0.3、0.3-0.4或0.4-0.5。

在一实施方案中，可以使用常用于大肠杆菌的培养基。用于本发明的大肠杆菌的培养基可以包括合适的氮源，例如有机含氮化合物或无机含氮化合物或其混合物。在一实施方案中，所述有机含氮化合物例如选自豆饼粉、花生饼粉、牛肉膏、鱼粉、酵母膏、蛋白胨、玉米浆中的一种或任意几种的混合物，所述无机含氮化合物选自硝酸盐(如硝酸钠、硝酸钾、硝酸钙)，铵盐(如磷酸铵、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵)中的一种或任意几种的混合物。在一实施方案中，用于本发明的大肠杆菌的培养基可以包括合适的碳源，例如选自葡萄糖、淀粉、淀粉水解糖、果糖、糊精、乳糖、半乳糖、木糖、蔗糖、甘油、麦芽糖、脂肪酸、乙酸、丙酮酸、和富马酸中的一种或任意几种的混合物。

在一个实施方案中，本发明的方法中所使用的种子培养基和发酵培养基由以下成分组成(溶剂为水)：

大量元素：葡萄糖、KH₂PO₄、K₂HPO₄、(NH₄)₂HPO₄、MgSO₄·7H₂O、和甜菜碱-KCl；

微量元素：FeCl₃·6H₂O、CoCl₂·6H₂O、CuCl₂·2H₂O、ZnCl₂、Na₂MoO₄·2H₂O、MnCl₂·4H₂O₂、和H₃BO₃。

在一个实施方案中，本发明的培养基由以下成分组成(溶剂为水)：

大量元素：葡萄糖20-120g/L，KH₂PO₄2-5g/L、K₂HPO₄4-8g/L、(NH₄)₂HPO₄3-5g/L、MgSO₄·7H₂O0.1-0.3g/L、以及甜菜碱-KCl0.1-1g/L；

微量元素：FeCl₃·6H₂O1-5μg/L、CoCl₂·6H₂O0.05-1μg/L、CuCl₂·2H₂O0.05-1μg/L、ZnCl₂0.05-1μg/L、Na₂MoO₄·2H₂O0.05-1μg/L、MnCl₂·4H₂O₂0.1-1μg/L,H₃BO₃0.01-0.5μg/L。

在一个实施方案中，本发明生产丁二酸的方法中，发酵培养本发明的重组大肠杆菌的步骤包括使用高浓度的葡萄糖和/或高浓度的丁二酸盐。在一个实施方案中发酵培养本发明的重组大肠杆菌的步骤包括使用高浓度的葡萄糖和/或高浓度的丁二酸二钠。

在一个实施方案中，本发明所述的高浓度葡萄糖是指100g/L以上的葡萄糖，例如100-150g/L、100-200g/L、100-250g/L、100-300g/L。在一个实施方案中本发明所述的高浓度葡萄糖是至少110g/L、至少120g/L、至少130g/L、至少140g/L、至少150g/L、至少160g/L、至少170g/L、至少180g/L、至少190g/L、至少200g/L、至少210g/L、至少220g/L、至少230g/L、至少240g/L、至少250g/L、至少260g/L、至少270g/L、至少280g/L、至少290g/L、至少300g/L甚至更高的葡萄糖。

在一个实施方案中，本发明所述的高浓度丁二酸盐是指29g/L以上的丁二酸盐，例如29-50g/L、29-60g/L、29-70g/L、29-80g/L、29-90g/L、29-100g/L、29-150g/L、29-200g/L、29-250g/L、29-300g/L。在一个实施方案中，本发明所述的丁二酸盐的浓度是例如至少29g/L、至少30g/L、至少40g/L、至少50g/L、至少60g/L、至少70g/L、至少80g/L、至少90g/L、至少100g/L、至少110g/L、至少120g/L、至少130g/L、至少140g/L、至少150g/L、至少160g/L、至少170g/L、至少180g/L、至少190g/L、至少200g/L、至少250g/L、至少300g/L，例如至少43g/L、至少57g/L、至少71g/L、至少86g/L甚至更高的丁二酸二钠。在一个实施方案中，本发明所述的高浓度丁二酸盐是高浓度的丁二酸二钠。

在一个实施方案中，本发明中对大肠杆菌进行培养的具体方法如下：

将菌株厌氧发酵，包括以下步骤：

(1)种子培养：将1/3-1/2体积的种子培养基置于三角瓶中，高温高压灭菌。冷却后将本发明的重组大肠杆菌按照0.1-10%(V/V)的接种量接种于种子培养基，在37℃以及摇动的条件下培养6-16小时得到种子液，用于发酵培养基接种；

(2)发酵培养：将1/3-1/2体积的发酵培养基体积置于厌氧发酵罐中，将种子液按照终浓度OD₅₅₀=0.05-0.5的接种量接种于发酵培养基，37℃培养2-5天，得到发酵液。

在一个实施方案中，本发明生产化工原料的方法中还包括从发酵液中收集、提取、分离和/或纯化所得的化工原料的步骤。

在第三方面，本发明涉及本发明的重组大肠杆菌在生产丁二酸中的用途。

在第四个方面，本发明提供了提高大肠杆菌耐渗透压能力的方法，所述方法包括在大肠杆菌中引入选自如下的一种或多种突变的基因：(a)突变的rpoB基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID No.:1所示氨基酸序列的位置D654的位置上含有修饰；(b)突变的cusS基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID No.:2所示氨基酸序列的位置G210的位置上含有修饰；和(c)突变的mreC基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID No.:3所示氨基酸序列的位置G24的位置上含有修饰。在一个实施方案中，本发明所述的提高大肠杆菌耐渗透压能力的方法是提高大肠杆菌耐受高浓度葡萄糖和/或高浓度丁二酸盐的能力的方法。在一个实施方案中，所述丁二酸盐是丁二酸二钠。

在一个实施方案中，本发明提供了提高大肠杆菌耐渗透压能力的方法，所述方法包括在大肠杆菌中引入选自如下的一种或多种突变的基因：(a)突变的rpoB基因，其核苷酸序列在对应于SEQ ID No.:4所示核苷酸序列的位置G1960的位置上含有修饰；(b)突变的cusS基因，其核苷酸序列在对应于SEQ ID No.:5所示核苷酸序列的位置G629的位置上含有修饰；和(c)突变的mreC基因，其核苷酸序列在对应于SEQ ID No.:6所示核苷酸序列的位置G71的位置上含有修饰。

在一个实施方案中，本发明所述方法包括在大肠杆菌中同时引入2种所述突变的基因。在一个实施方案中，本发明所述方法包括在大肠杆菌中同时引入3种所述突变的基因。

在一个实施方案中，本发明的方法中包括在大肠杆菌中引入如下的突变的基因：(a)突变的rpoB基因，其核苷酸序列在对应于SEQ ID No.:4所示核苷酸序列的位置G1960的位置上含有修饰；和(b)突变的cusS基因，其核苷酸序列在对应于SEQ ID No.:5所示核苷酸序列的位置G629的位置上含有修饰。

在一个实施方案中，本发明的方法中包括在大肠杆菌中引入如下的突变的基因：(a)突变的rpoB基因，其核苷酸序列在对应于SEQ ID No.:4所示核苷酸序列的位置G1960的位置上含有修饰；和(c)突变的mreC基因，其核苷酸序列在对应于SEQ ID No.:6所示核苷酸序列的位置G71的位置上含有修饰。

在一个实施方案中，本发明的方法中包括在大肠杆菌中引入如下的突变的基因：(b)突变的cusS基因，其核苷酸序列在对应于SEQ ID No.:5所示核苷酸序列的位置G629的位置上含有修饰；和(c)突变的mreC基因，其核苷酸序列在对应于SEQ ID No.:6所示核苷酸序列的位置G71的位置上含有修饰。

在一个实施方案中，本发明的方法中包括在大肠杆菌中引入如下的突变的基因：(a)突变的rpoB基因，其核苷酸序列在对应于SEQ ID No.:4所示核苷酸序列的位置G1960的位置上含有修饰；(b)突变的cusS基因，其核苷酸序列在对应于SEQ ID No.:5所示核苷酸序列的位置G629的位置上含有修饰；和(c)突变的mreC基因，其核苷酸序列在对应于SEQ ID No.:6所示核苷酸序列的位置G71的位置上含有修饰。

在一个实施方案中，本发明的方法中所述突变的rpoB基因的核苷酸序列在对应于SEQ ID No.:4所示核苷酸序列的位置G1960的位置上是用T置换G。

在一个实施方案中，本发明的方法中所述突变的cusS基因的核苷酸序列在对应于SEQ ID No.:5所示核苷酸序列的位置G629的位置上是用T置换G。

在一个实施方案中，本发明的方法中所述突变的mreC基因的核苷酸序列在对应于SEQ ID No.:6所示核苷酸序列的位置G71的位置上是用A置换G。

在一个实施方案中，术语“耐渗透压能力”是指耐受高浓度葡萄糖和/或高浓度丁二酸盐的能力。

实施例

本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：菌株Suc-T110和HX-024的构建

以野生型大肠杆菌ATCC8739为起始菌株，敲除乳酸脱氢酶基因ldhA，敲除丙酮酸甲酸裂解酶编码基因pflB，敲除磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶I基因ptsI，激活半乳糖MFS转运蛋白GalP，激活磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK，得到菌株Suc-T110(具体构建过程可参见中国专利申请201310198953.9，以及Tan et al.,Appl Environ Microbiol.2013,79:4838-4844)。

从Suc-T110出发，继续敲除磷酸乙酰转移酶基因pta和乙酸激酶基因ackA，激活苹果酸合成酶AceA和异柠檬酸裂解酶AceB，激活二羧酸Dcu转运蛋白DcuC，得到菌株NZ-037。

再将NZ-037经过1080代进化后获得菌株HX021。

从重组大肠杆菌菌株HX021出发，敲除mgsA基因(GenBank No.ACA78263.1)，获得重组大肠杆菌HX023。

HX023经过360代进化后获得菌株HX024。HX024以保藏号CGMCC No.7259(2013年2月25日，分类命名：大肠埃希氏菌Escherichia coli)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)。

提取重组大肠杆菌HX024的基因组DNA，对其进行基因组测序，由深圳华大基因科技有限公司完成。

重测序发现3个基因发生了单碱基突变（表1）：rpoB基因(GenBank No:ACA79157.1)含有1个点突变：G1960T，导致RpoB蛋白的1个氨基酸位点突变：D654Y；cusS基因含有1个点突变：G629T，导致CusS蛋白的1个氨基酸位点突变G210V；mreC基因含有1个点突变：G71A，导致MreC蛋白的1个氨基酸位点突变：G24D。

表1、重组大肠杆菌HX024的基因组测序发生突变的基因

实施例2：重组大肠杆菌NZ-502的构建

(1)构建质粒pXZ-CS，用于基因敲除、基因表达调控和外源基因整合。

质粒构建操作步骤共四步：

第一步，以pACYC184质粒(Mok et al.,1991,Nucleic Acids Res19:2321-2323)DNA为模板，使用引物184-cat-up/184-cat-down(SEQ ID No.:16/SEQ ID No.:17)，扩增得到氯霉素抗性基因，基因片段大小为994bp，包含有氯霉素基因启动子序列，称为片段I。

扩增体系为：NewEngland Biolabs Phusion5X缓冲液10μl、dNTP(每种dNTP各10mM)1μl、DNA模板20ng、引物(10μM)各2μl、Phusion High-Fidelity DNA聚合酶(2.5U/μl)0.5μl、蒸馏水33.5μl，总体积为50μl。

扩增条件为98℃预变性2分钟(1个循环)；98℃变性10秒、56℃退火10秒、72℃延伸30秒(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。

第二步，以芽孢杆菌Bacillus subtilis sp subtilis168DNA(该菌购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，CGMCC No.1.1390)为模板，使用引物Bs-sacB-up/Bs-sacB-down(SEQ ID No.:18/SEQ ID No.:19)进行PCR扩增果聚糖蔗糖转移酶基因(sacB)，基因片段大小为1618bp，含有sacB基因启动子序列，称为片段II。扩增体系和扩增条件参考实施例3(1)第一步。

第三步，将第一步得到的片段I和第二步得到的片段II分别用限制性内切酶SacI(NEB公司)在37℃酶切30分钟；PCR纯化试剂盒清洗(Gel/PCR Extration Kit，购自BioMIGA生物技术有限公司)；各取20ng片段I和片段II，加入1μl10XT4连接缓冲液(NEB公司)、1μl T4-DNA快连酶(NEB公司)，补充蒸馏水至10μl，25℃反应5分钟；以酶连片段为底物，取1μl，用引物184-cat-up/Bs-sacB-down(SEQ ID No.:16/SEQ ID No.:19)PCR扩增，扩增体系和扩增条件参考实施例2(1)第一步，得到含有cat-sacB连接片段III。

第四步，将PCR获得的片段III取1μl，加入1μl pEASY-blunt simple载体(试剂盒，北京全式金生物技术有限公司)，25℃反应15分钟；氯化钙转化法：加入50μl Trans10感受态细胞(购自北京全式金生物技术有限公司)中进行，冰浴30分钟。42℃热激30秒，立即置于冰上2分钟。加入250μl LB培养基，200rpm，37℃孵育1小时。取200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)和氯霉素(终浓度为34μg/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，进行菌落PCR验证，引物为M13-F/M13-R(SEQ ID No.:20/SEQ ID No.:21)。送样测序分析，结果正确的为阳性克隆，得到质粒pXZ-CS。

构建的质粒所用引物见表3，质粒见表4。

(2)重组大肠杆菌NZ-502的构建

从重组大肠杆菌Suc-T110出发出发，采用两步同源重组的方法将rpoB*突变基因整合替换野生型rpoB基因，获得重组大肠杆菌NZ-502，共分为以下三步：

第一步，以pXZ-CS为模板，使用引物rpoB-QC-cat-up/rpoB-QC-sacB-down(SEQ ID No.:22/SEQ ID No.:23)扩增，得到大小约2700bp的PCR片段，其中含2618bp氯霉素基因(cat)和果聚糖蔗糖转移酶基因(sacB)的DNA片段和左右各50bp的同源臂片段，称为DNA片段I。

第二步，将DNA片段I用于第一次同源重组：首先将pKD46质粒(Datsenko and Wanner2000,Proc Natl Acad Sci USA97:6640-6645，质粒购买于美国耶鲁大学CGSC大肠杆菌保藏中心)通过氯化钙转化法转化至重组大肠杆菌Suc-T110，然后将DNA片段I电转至带有pKD46的重组大肠杆菌Suc-T110。

电转条件为：首先准备带有pKD46质粒的重组大肠杆菌Suc-T110的电转化感受态细胞(Dower et al.,1988,Nucleic Acids Res16:6127-6145)；将50μl感受态细胞置于冰上，加入50ng DNA片段I，冰上放置2分钟，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1ml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75rpm，30℃孵育2小时。取200μl菌液涂在含有氨苄(终浓度为50ug/ml)和氯霉素(终浓度为34ug/ml)的LB平板上，37℃过夜培养后，挑选5个单菌落进行PCR验证，使用引物cat-up/rpoB-down(SEQ ID No.24:/SEQ ID No.:25)进行验证，挑选一个正确的单菌落，命名为NZ-501。

第三步，以重组大肠杆菌HX024基因组DNA为模板，用引物rpoB-up/rpoB-down(SEQ ID No.:26/SEQ ID No.:25)扩增出795bp DNA片段II。DNA片段II用于第二次同源重组。将DNA片段II电转化至菌株NZ-501。

电转条件为同实施例2(2)第二步，电击后迅速将1ml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75转，30℃孵育4小时。将菌液转移至含有10%蔗糖的没有氯化钠的LB液体培养基(250ml烧瓶中装50ml培养基)，培养24小时后在含有6%蔗糖无氯化钠的LB固体培养基上划线培养。用引物为rpoB-up/rpoB-down(SEQ ID No.:26/SEQ ID No.:25)PCR验证，正确的菌落扩增产物为795bp的片段，测序分析正确的克隆，将其命名为NZ-502(表2)。

rpoB*突变基因整合使用的引物序列见表3。

表2、本发明构建的重组大肠杆菌

表3、本发明中使用的引物

表4、本发明中使用的质粒

实施例3：重组大肠杆菌NZ-504构建

从重组大肠杆菌Suc-T110出发，按实施例2(2)部分中两步同源重组的方法将cusS*突变基因整合替换野生型cusS基因，获得重组大肠杆菌NZ-504。使用的引物序列见表3，其中引物的命名对应于rpoB*突变基因过程中所使用的引物的名称，仅将rpoB替换为cusS。

实施例4：重组大肠杆菌NZ-506构建

从重组大肠杆菌Suc-T110出发，按实施例2(2)部分中两步同源重组的方法将mreC*突变基因整合替换野生型mreC基因，获得重组大肠杆菌NZ-506。使用的引物序列见表3，其中引物的命名对应于rpoB*突变基因过程中所使用的引物的名称，仅将rpoB替换为mreC。

实施例5：高浓度葡萄糖对重组大肠杆菌Suc-T110、NZ-502、NZ-504和NZ-506发酵生产丁二酸的影响

使用低浓度（5%）和高浓度（12%）的葡萄糖对重组大肠杆菌Suc-T110、NZ-502、NZ-504和NZ-506进行发酵。

种子培养基由以下成分组成(溶剂为水)：

大量元素：葡萄糖20g/L，KH₂PO₄3.5g/L、K₂HPO₄6.55g/L、(NH₄)₂HPO₄3.5g/L、MgSO₄·7H₂O0.12g/L、和甜菜碱-KCl0.15g/L。

微量元素：FeCl₃·6H₂O1.5μg/L、CoCl₂·6H₂O0.1μg/L、CuCl₂·2H₂O0.1μg/L、ZnCl₂0.1μg/L、Na₂MoO₄·2H₂O0.1μg/L、MnCl₂·4H₂O0.2μg/L,H₃BO₃0.05μg/L。

发酵培养基大部分和种子培养基相同，区别是葡萄糖浓度为50或120g/L、另外还加入了100mM KHCO₃。

Suc-T110、NZ-502、NZ-504和NZ-506厌氧发酵，包括以下步骤：

(1)种子培养：250ml三角瓶中种子培养基为100ml，115℃灭菌15min。冷却后将重组大肠杆菌Suc-T110、NZ-502、NZ-504和NZ-506按照1%(V/V)的接种量接种于种子培养基，在37℃和100rpm的条件下培养12小时得到种子液，用于发酵培养基接种。

(2)发酵培养：500ml厌氧罐中发酵培养基体积为250ml，将种子液按照终浓度OD₅₅₀=0.1的接种量接种于发酵培养基，37℃，150rpm，发酵3天，得到发酵液。中和剂为2.4M K₂CO₃和1.2M KOH。

发酵液为发酵罐内所有物质。培养过程中没有通任何气体。

分析方法：使用安捷伦(Agilent-1200)高效液相色谱仪对第3天发酵液中的组分进行测定。发酵液中的葡萄糖和有机酸浓度测定采用伯乐(Biorad)公司的Aminex HPX–87H有机酸分析柱。发酵结果见表5。

使用低浓度葡萄糖（5%，渗透压为278mosM），发酵72小时，Suc-T110丁二酸产量为273mM，转化率为1.12mol/mol。使用高浓度葡萄糖（12%，渗透压为667mosM），Suc-T110丁二酸产量和转化率为192mM和0.82mol/mol，分别为低浓度葡萄糖时的70%和73%，说明高浓度的葡萄糖对Suc-T110的丁二酸生产有抑制。

使用低浓度葡萄糖（5%，渗透压为278mosM），发酵72小时，NZ-502丁二酸产量为326mM，转化率为1.24mol/mol。使用高浓度葡萄糖（12%，渗透压为667mosM），NZ-502丁二酸产量和转化率为321mM和1.18mol/mol，分别为低浓度葡萄糖时的98%和95%，说明高浓度的葡萄糖对NZ-502的丁二酸生产基本没有抑制，表明引入的rpoB*突变能使重组菌Suc-T110耐受高浓度葡萄糖。

使用低浓度葡萄糖（5%，渗透压为278mosM），发酵72小时，NZ-504丁二酸产量为307mM，转化率为1.16mol/mol。使用高浓度葡萄糖（12%，渗透压为667mosM），NZ-504丁二酸产量和转化率为269mM和1.14mol/mol，分别为低浓度葡萄糖时的88%和98%，说明高浓度葡萄糖对NZ-504丁二酸生产的抑制变弱，表明引入的cusS*突变能使重组菌Suc-T110耐受高浓度葡萄糖。

使用低浓度葡萄糖（5%，渗透压为278mosM），发酵72小时，NZ-506丁二酸产量为312mM，转化率为1.16mol/mol。使用高浓度葡萄糖（12%，渗透压为667mosM），NZ-506丁二酸产量和转化率为348mM和1.34mol/mol，分别为低浓度葡萄糖时的112%和116%，说明高浓度的葡萄糖对NZ-502的丁二酸生产没有抑制，表明引入的mreC*突变能使重组菌Suc-T110耐受高浓度葡萄糖。表5、高浓度葡萄糖对重组大肠杆菌Suc-T110、NZ-502、NZ-504和NZ-506发酵生产丁二

酸的影响

^a使用500ml的发酵罐，发酵培养基为250ml。发酵培养基葡萄糖浓度为5%，加入了100mMKHCO₃。使用的中和剂为2.4M K₂CO₃和1.2M KOH。

^b使用500ml的发酵罐，发酵培养基为250ml。发酵培养基葡萄糖浓度为12%，加入了100mM KHCO₃。使用的中和剂为2.4M K₂CO₃和1.2M KOH。

实施例6：含不同浓度丁二酸二钠的培养基对重组大肠杆菌Suc-T110、NZ-502、NZ-504和NZ-506发酵生产丁二酸的影响

使用含不同浓度的丁二酸二钠的无机盐培养基对重组大肠杆菌Suc-T110进行发酵。

种子培养基和发酵培养基组成同实施例5，发酵培养基含葡萄糖浓度50g/L，100mM KHCO₃，另外还加入了0g/L、29g/L或43g/L的丁二酸二钠。

种子培养、发酵培养和分析方法同实施例5，中和剂为2.4M K₂CO₃和1.2M KOH。

结果如表6所示：

在5%的葡萄糖（渗透压为278mosM）和0g/L丁二酸二钠（渗透压为0mosM）的培养基中，发酵96h，Suc-T110丁二酸产量为280mM；在5%的葡萄糖（渗透压为278mosM）和29g/L丁二酸二钠（渗透压为537mosM）的培养基中，发酵96h，Suc-T110丁二酸产量为181mM，为0g/L丁二酸二钠时的65%；在5%的葡萄糖（渗透压为278mosM）和43g/L丁二酸二钠（渗透压为796mosM）的培养基中，发酵96h，Suc-T110丁二酸产量为13mM，为0g/L丁二酸二钠时的5%。随着丁二酸二钠浓度的增加，重组大肠杆菌Suc-T110丁二酸产量显著下降，说明高浓度的丁二酸二钠对Suc-T110的生长和丁二酸生产有很大的抑制。

在5%的葡萄糖（渗透压为278mosM）和29g/L丁二酸二钠（渗透压为537mosM）的培养基中，发酵96h，NZ-502、NZ-504和NZ-506丁二酸产量分别为227、245和271mM，为相同发酵条件下Suc-T110的125%、135%和150%。

在5%的葡萄糖（渗透压为278mosM）和43g/L丁二酸二钠（渗透压为796mosM）的培养基中，发酵96h，NZ-502、NZ-504和NZ-506丁二酸产量分别为79、77和99mM，为相同发酵条件下Suc-T110的608%、592%和762%。表明引入的rpoB*、cusS*和mreC*突变均能提高使重组菌Suc-T110耐受高浓度丁二酸二钠的能力。

表6、含不同浓度丁二酸二钠的培养基对重组大肠杆菌Suc-T110、NZ-502、NZ-504和NZ-506

发酵生产丁二酸的影响

^a使用500ml的发酵罐，发酵培养基为250ml。发酵培养基中除加入了100mM KHCO₃，还加入了0g/L的丁二酸二钠。使用的中和剂为2.4M K₂CO₃和1.2M KOH。

^b使用500ml的发酵罐，发酵培养基为250ml。发酵培养基中除加入了100mM KHCO₃，还加入了29g/L的丁二酸二钠。使用的中和剂为2.4M K₂CO₃和1.2M KOH。

^c使用500ml的发酵罐，发酵培养基为250ml。发酵培养基中除加入了100mM KHCO₃，还加入了43g/L的丁二酸二钠。使用的中和剂为2.4M K₂CO₃和1.2M KOH。

实施例7：重组大肠杆菌MX-202的构建

从野生大肠杆菌ATCC8739出发，按实施例2中的方法将rpoB*突变基因整合。获得重组大肠杆菌MX-202。使用的引物序列见表3，其中引物的命名相同于rpoB*突变基因还原过程中所使用的引物的名称。

实施例8：重组大肠杆菌MX-204的构建

从野生大肠杆菌ATCC8739出发，按实施例3的方法将cusS*突变基因整合，获得重组大肠杆菌NZ-504。使用的引物序列见表3，其中引物的命名对应于rpoB*突变基因过程中所使用的引物的名称，仅将rpoB替换为cusS。

实施例9：重组大肠杆菌MX-206的构建

从野生大肠杆菌ATCC8739出发，按实施例4方法将mreC*突变基因整合，获得重组大肠杆菌MX-206。使用的引物序列见表3，其中引物的命名对应于rpoB*突变基因过程中所使用的引物的名称，仅将rpoB替换为mreC。

实施例10：高浓度葡萄糖对野生型大肠杆菌ATCC8739生长的影响

使用不同浓度的葡萄糖培养基对大肠杆菌ATCC8739进行发酵。

种子培养基和发酵培养基组成同实施例5，发酵培养基含葡萄糖浓度为50g/L、200g/L、250g/L，不添加KHCO₃。

种子培养、发酵培养同实施例5，中和剂为6M KOH。

每6h测定OD_550nm值，绘制生长曲线。生长曲线见图4。

使用低浓度葡萄糖（5%，渗透压为278mosM），ATCC8739于12h达到生长最大值，OD_550nm约6左右；使用高浓度葡萄糖（20%，渗透压为1112mosM），生长30h达到最大值，OD_550nm约6左右；使用更高浓度葡萄糖（25%，渗透压为1390mosM）时，最终48h达到最大值，OD_550nm为3.78。

在相同时间点12h，使用高浓度葡萄糖（20%，渗透压为1112mosM）培养基，ATCC8739生长的OD_550nm值是低浓度葡萄糖（5%，渗透压为278mosM）的7%；使用更高浓度葡萄糖（25%，渗透压为1390mosM）时，OD_550nm值是葡萄糖浓度为5%时的1.6%。

随着培养基中葡萄糖浓度的增加，野生型大肠杆菌ATCC8739的生长受影响，延迟期增长，说明高浓度的葡萄糖对ATCC8739生长抑制。

实施例11：高浓度葡萄糖对重组大肠杆菌MX-202、MX-204和MX-206生长的影响

使用不同浓度的葡萄糖培养基对重组大肠杆菌MX-202、MX-204和MX-206进行发酵。

种子培养基和发酵培养基组成同实施例5，发酵培养基含葡萄糖浓度为200g/L、250g/L，不添加KHCO₃。

种子培养、发酵培养同实施例5，中和剂为6M KOH。

每6h测定OD_550nm值，绘制生长曲线。生长曲线见图5。

使用高浓度的葡萄糖（20%，渗透压为1112mosM）培养基，18h时，MX-202、MX-204和MX-206的OD_550nm值为5.63、4.83、4.32，相对于野生型在相同时间点（图4，OD_550nm值为2.85），OD_550nm分别提高了118%、87%和67%；在发酵终点的30h，MX-202、MX-204和MX-206的OD_550nm值为6.89、6.84、6.45，相对于野生型在相同时间点（图4，OD_550nm值为5.89），OD550nm提高了17%、17%、10%（图5A）。

使用更高浓度的葡萄糖（25%，渗透压为1390mosM）培养基，36h时，MX-202、MX-204和MX-206的OD_550nm值为2.26、2.45、1.7，相对于野生型在相同时间点（图4，OD_550nm值为1.56），OD_550nm提高了45%、57%和9%；在发酵终点的48h，MX-202、MX-204和MX-206的OD_550nm值为4.47、4.51、4.3，相对于野生型在相同时间点（图4，OD_550nm值为3.79），OD550nm提高了18%、19%、13%（图5B）。

随着葡萄糖浓度的提高，重组大肠杆菌MX-202、MX-204和MX-206菌株生长能力降低，延迟期增长；但在相同条件下，相对于野生型ATCC8739，生长有显著提高；说明rpoB*、cusS*、mreC*单基因突变能显著提高野生型菌株对高浓度葡萄糖的耐受性。

实施例12：高浓度丁二酸二钠对大肠杆菌ATCC8739发酵的影响

使用不同浓度的丁二酸二钠培养基对大肠杆菌ATCC8739进行发酵。

种子培养基和发酵培养基组成同实施例5，发酵培养基含葡萄糖浓度50g/L，不添加KHCO₃，另外还加入了0g/L、29g/L、43g/L、57g/L、71g/L、86g/L的丁二酸二钠。

种子培养、发酵培养同实施例5，中和剂为6M KOH。

每6h测定OD_550nm值，绘制生长曲线。生长曲线见图6。

野生型ATCC8739在不含丁二酸二钠（0g/L，渗透压分别为0mosM）培养基中，12h时达到生长最大值，OD_550nm约6左右；当培养基中含29g/L、43g/L、57g/L、71g/L、86g/L丁二酸二钠时（渗透压分别为537mosM、796mosM、1056mosM、1314mosM、1593mosM），12h时，OD_550nm值分别为4.74、3.12、2.27、1.64、0.31，是不含丁二酸二钠（0g/L，渗透压分别为0mosM）时的76%、50%、36%、26%、5%。

随着培养基中丁二酸二钠浓度的增加，野生型大肠杆菌ATCC8739的生长受影响，说明高浓度的丁二酸二钠对野生型大肠杆菌ATCC8739菌株生长有抑制作用。

实施例13：高浓度丁二酸二钠对重组大肠杆菌MX-202、MX-204和MX-206发酵的影响

使用含不同浓度丁二酸二钠的无机盐培养基对重组大肠杆菌MX-202、MX-204和MX-206进行发酵。

种子培养基和发酵培养基组成同实施例5。发酵培养基含葡萄糖浓度50g/L，不添加KHCO₃，另外还加入了43g/L和86g/L的丁二酸二钠。

种子培养、发酵培养同实施例5，中和剂为6M KOH。

每6h测定OD_550nm值，绘制生长曲线。生长曲线见图7。

在含高浓度的丁二酸二钠（43g/L，渗透压为796mosM）培养基中生长，12h时，MX-202、MX-204和MX-206的OD_550nm值分别为：4.42、4.23、4.04，相对于野生型（OD_550nm值为3.12），OD_550nm值分别提高了42%、36%和29%。

在含更高浓度的丁二酸二钠（86g/L，渗透压为1593mosM）培养基中生长，36h时，MX-202、MX-204和MX-206的OD_550nm值分别为：2.14、1.93、1.88，相对于野生型（OD_550nm值为1.77），OD_550nm值分别提高了21%、9%和6%。

在含高浓度的丁二酸盐培养基中生长，随着丁二酸盐浓度的增加重组大肠杆菌MX-202、MX-204和MX-206菌株生长有所减低，但在相同条件下，相对于野生型ATCC8739，突变菌株生长能力都有显著提高；说明rpoB*、cusS*、mreC* 单基因突变能显著提高野生型菌株对高浓度丁二酸盐的耐受性。

参考文献：

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Zhang X,Jantama K,Shanmugam KT,Ingram LO(2009)Reengineering Escherichia coli for succinate production in mineral salts medium.Appl Environ Microbiol75:7807-7813.

Claims

1.一种重组大肠杆菌，其含有选自如下的一种或多种突变的基因：

(a)突变的rpoB基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID No.:1所示氨基酸序列的位置D654的位置上含有修饰；

(b)突变的cusS基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID No.:2所示氨基酸序列的位置G210的位置上含有修饰；和

(c)突变的mreC基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID No.:3所示氨基酸序列的位置G24的位置上含有修饰。

2.权利要求1的重组大肠杆菌，其中所述突变的rpoB基因所编码的多肽在对应于SEQ ID No.:1所示氨基酸序列的位置D654的位置上是用Y置换D。

3.权利要求1的重组大肠杆菌，其中所述突变的cusS基因所编码的多肽在对应于SEQ ID No.:2所示氨基酸序列的位置G210的位置上是用V置换G。

4.权利要求1的重组大肠杆菌，其中所述突变的mreC基因所编码的多肽在对应于SEQ ID No.:3所示氨基酸序列的位置G24的位置上是用D置换G。

5.权利要求1的重组大肠杆菌，其含有如下的一种或多种突变的基因：

(a)突变的rpoB基因，其核苷酸序列在对应于SEQ ID No.:4所示核苷酸序列的位置G1960的位置上含有修饰；

(b)突变的cusS基因，其核苷酸序列在对应于SEQ ID No.:5所示核苷酸序列的位置G629的位置上含有修饰；和

(c)突变的mreC基因，其核苷酸序列在对应于SEQ ID No.:6所示核苷酸序列的位置G71的位置上含有修饰。

6.权利要求5的重组大肠杆菌，其中所述突变的rpoB基因的核苷酸序列在对应于SEQ ID No.:4所示核苷酸序列的位置G1960的位置上是用T置换G。

7.权利要求5的重组大肠杆菌，其中所述突变的cusS基因的核苷酸序列在对应于SEQ ID No.:5所示核苷酸序列的位置G629的位置上是用T置换G。

8.权利要求5的重组大肠杆菌，其中所述突变的mreC基因的核苷酸序列在对应于SEQ ID No.:6所示核苷酸序列的位置G71的位置上是用A置换G。

9.权利要求1-8任一项的重组大肠杆菌，其还含有如下修饰：

磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)中所涉及的一或多个基因表达的抑制、和/或磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)中所涉及的基因所编码的蛋白质活性的抑制；

pflB和/或adhE基因表达的抑制、和/或pflB和/或adhE基因所编码的蛋白质活性的抑制；

ldhA基因表达的抑制、和/或ldhA基因所编码的蛋白质活性的抑制；

galP基因和/或外源glf基因表达的增强、和/或galP基因和/或外源glf基因所编码的蛋白质活性的增强；和

pck基因表达的增强、和/或pck基因所编码的蛋白质活性的增强。

10.权利要求9的重组大肠杆菌，其中所述磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)中所涉及的一或多个基因是选自如下的一或多个基因：编码PTS系统酶I的基因ptsI、编码PTS系统酶Hpr的基因ptsH、编码PTS系统酶IIA^Glc的基因crr和编码PTS系统酶IICB^Glc的基因ptsG。

11.权利要求9的重组大肠杆菌，其中所述大肠杆菌还含有如下的修饰：

pta基因和ackA基因表达的抑制、和/或pta基因和ackA基因所编码的蛋白质活性的抑制；和

aceA基因、aceB基因和dcuC基因表达的增强、和/或aceA基因、aceB基因和dcuC基因所编码的蛋白质活性的增强。

12.权利要求11的重组大肠杆菌，其中所述大肠杆菌中还含有如下修饰：

mgsA基因表达的抑制、和/或mgsA基因所编码的蛋白质活性的抑制。

13.生产丁二酸的方法，所述方法包括：

(a)发酵培养权利要求1-12任一项的重组大肠杆菌;和

(b)收获产生的丁二酸；任选地分离或纯化所述丁二酸。

14.权利要求1-12任一项的重组大肠杆菌在生产丁二酸中的用途。

15.提高大肠杆菌耐渗透压能力的方法，所述方法包括在大肠杆菌中引入选自如下的一种或多种突变的基因：

16.权利要求15的方法，其中所述突变的rpoB基因所编码的多肽在对应于SEQ ID No.:1所示氨基酸序列的位置D654的位置上是用Y置换D。

17.权利要求15的方法，其中所述突变的cusS基因所编码的多肽在对应于SEQ ID No.:2所示氨基酸序列的位置G210的位置上是用V置换G。

18.权利要求15的方法，其中所述突变的mreC基因所编码的多肽在对应于SEQ ID No.:3所示氨基酸序列的位置G24的位置上是用D置换G。