CN101993850B - 一种生产d-乳酸基因工程菌及构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生产D-乳酸基因工程菌及构建方法和应用。以L-乳酸脱氢酶基因(ldh)缺失的菌株C.glutamicum Res 167Δldh为出发菌株，过表达外源D-乳酸脱氢酶基因，获得谷氨酸棒杆菌C.glutamicum Res 167Δldh/ldhA。保藏于中国微生物菌种保藏管理中心，保藏登记号为CGMCC No.4041。利用基因工程手段，在L-乳酸代谢途径缺失的谷氨酸棒杆菌中实现了外源D-乳酸脱氢酶基因的表达，成功构建了产高光学纯度D-乳酸的基因工程菌。用本发明的工程菌进行乳酸发酵生产，其D-乳酸产量达到40g/L以上，纯度为99％以上。本发明将在D-乳酸的工业化生产中发挥重要作用，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体的说涉及一种D-乳酸基因工程菌及其构建方法和在D-乳酸生产过程中的应用。
背景技术
乳酸作为三大有机酸之一，根据其旋光性可分为D-乳酸、L-乳酸和D，L乳酸。目前，国际上主要由微生物发酵生产乳酸，其中，L-乳酸因具有广泛的生物兼容性，因而，得到了较早的开发和生产，其生产技术和产品已趋向于成熟。随着，D-乳酸新功能的发掘，其生产和应用的研究得到了人们越来越广泛的关注。
D-乳酸在食品、医药、化工、农业等方面应用极其广泛，尤其是乳酸的聚合物-聚乳酸(PLA)，因具有良好的生物相容性而易被生物降解，用其取代现今大量使用的聚乙烯塑料，成为解决当今日益严重的白色污染一种重要方法。乳酸根据其旋光性，其聚合后得到的聚乳酸分为聚L-乳酸(PLLA)、聚D-乳酸(PDLA)及聚D，L-乳酸(PDLLA)。PLLA最早得到了开发和生产，但由于其熔点低和降解速度慢等缺点，使得聚乳酸的应用遇到了阻碍。随着，PDLA和PLLA共混合物能够增加聚乳酸热稳定性和其生物降解速度的发现，聚乳酸的研究和应用得到了快速的发展。作为合成PDLA的原料，高纯度的D-乳酸的生产研究成为目前研究的热点。
D-乳酸的生产方法主要有：(1)化学合成法；(2)酶法；(3)微生物发酵法。微生物发酵生产乳酸是以淀粉、葡萄糖等原料经微生物发酵而得，与其它两种方法相比较，微生物发酵法可以通过菌种的选育、代谢的调控而生产专一性的D-乳酸，而且原料的来源广泛，生产成本低，产品纯度高，安全性好，因此，发酵法生产D-乳酸是目前生产乳酸的最重要方法。目前，D-乳酸的生产菌株主要包括乳酸菌、大肠杆菌以及酿酒酵母。乳酸菌作为最早应用于乳酸工业化生产的菌株，其具有发酵效率高、产量高的优势，但其原料成本和后续分离成本偏高，制约了D-乳酸工业的发展；大肠杆菌所需原料简单，并且可以以戊糖为唯一碳源生产乳酸，但其生产效率过于低下，无法满足工业化生产的需求；酿酒酵母具有良好的耐酸性，免去了中和剂的加入，降低了乳酸生产的后续分离成本，但其同样存在生产效率低下的问题。因而，目前D-乳酸工业化生产中所存在的关键性的问题在于如何在低原料成本下实现高效率、高光学纯度的D-乳酸生产。2005年Okino等人通过对厌氧条件下谷氨酸棒杆菌中有机酸代谢的研究，发现在厌氧条件下谷氨酸棒杆菌能够在相对简单的原料成本下实现有机酸的高效生产，其中乳酸为主要的有机酸产物。这一研究为解决D-乳酸工业化生产中的问题提供了一种新的解决方式。本实验室通过对谷氨酸棒杆菌厌氧条件下代谢途径的初步分析发现，在厌氧条件下谷氨酸棒杆菌中生成的乳酸为L-乳酸和D-乳酸的混合酸，因而，本实验根据这一特性，设计了相应的实验方案，敲除了谷氨酸棒杆菌ATCC13032中的L-乳酸脱氢酶基因，在谷氨酸棒杆菌中实现了高光学纯度D-乳酸的生产。(Calabia BP，Tokiwa Y(2007)Productionof D-lactic acid from sugarcane molasses，sugarcane juice and sugar beet juice by Lactobacillusdelbrueckii.Biotechnology Letters 29：1329-1332；Zhou S，Causey TB，Hasona A，Shanmugam KT，Ingram LO(2003)Production of optically pure D-lactic acid in mineral salts medium bymetabolically engineered Escherichia coli W3110.Applied and Environmental Microbiology69：399-407；Ishida N，Suzuki T，Tokuhiro K，Nagamori E，Onishi T，Saitoh S，Kitamoto K，Takahashi H(2006)D-Lactic acid production by metabolically engineered Saccharomycescerevisiae.Journal of Bioscience and Bioengineering 101：172-177)
目前，由于相关技术的限制和手段的缺乏，国内对D-乳酸产生菌的基因工程改造鲜有报道，而相对于传统的诱变和进化等菌种改造技术，基因工程手段具有良好的可知性和定向性。因而，开发具有自主知识产权的D-乳酸基因工程菌，打破发达国家在这一领域的垄断地位，具有迫切的现实意义和应用价值。
发明内容
本发明的目的是针对目前国内产D-乳酸基因工程菌的缺乏，开发一株产高纯度D-乳酸的基因工程菌，并提供一种上述产D-乳酸基因工程菌的构建方法。
以L-乳酸脱氢酶基因(ldh)缺失的菌株C.glutamicum Res 167Δldh为出发菌株，过表达外源D-乳酸脱氢酶基因，获得谷氨酸棒杆菌C.glutamicum Res 167Δldh/ldhA。
构建步骤如下：
(1)根据保加利亚乳杆菌ATCC 11842中D-乳酸脱氢酶编码基因(ldhA)的DNA序列，设计PCR引物；
(2)以ATCC 11842的基因组DNA为模板，扩增ldhA基因片段；
(3)建立连入ldhA编码基因的基因表达载体pXJM 19/ldhA；
(4)电转化制备L-乳酸脱氢酶基因缺失的谷氨酸棒杆菌感受态细胞；
(5)筛选具有氯霉素抗性的阳性菌落，PCR验证得到导入外源D-乳酸脱氢酶基因表达载体的基因工程菌株C.glutamicum Res 167Δldh/ldhA。
(6)对重组菌株进行厌氧条件下的发酵试验，检测外源D-乳酸脱氢酶基因表达前后菌体中乳酸的代谢情况。
本发明的产高纯度D-乳酸的基因工程菌，为棒杆菌属谷氨酸棒杆菌C.glutamicum Res167Δldh/ldhA，保藏于中国微生物菌种保藏管理中心，保藏登记号为CGMCC No.4041。
PCR的引物序列为：
primer 1：5′-GGCTAGGAGCTCTGTAAGAAAATCTGTAGGT-3′(下划线为引入的Sac I酶切位点)
primer2：5′-TGAGCTCTAGAAAAGGAGGAGGGACAATTAATGACT-3′(下划线为引入的Xba I酶切位点)
从保加利亚乳杆菌ATCC 11842中分离克隆出D-乳酸脱氢酶基因(D-lactate dehydrogenase，ldhA)与谷氨酸棒杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体pXJM19连接，构建了谷氨酸棒杆菌中外源ldhA基因的表达载体，通过电转化或接合转移将其转化入宿主菌株，通过氯霉素抗性培养基的筛选，建立了表达外源D-乳酸脱氢酶基因的工程菌株C.glutamicum Res167Δldh/ldhA。然后，对构建的基因工程菌株进行发酵实验，实验结果表明构建的基因工程菌株具有生产高纯度D-乳酸的特性。
本发明利用基因工程手段，在L-乳酸代谢途径缺失的谷氨酸棒杆菌中实现了外源D-乳酸脱氢酶基因的表达，成功构建了产高光学纯度D-乳酸的基因工程菌。用本发明的工程菌进行乳酸发酵生产，其D-乳酸产量达到40g/L以上，纯度为99％以上。本发明将在D-乳酸的工业化生产中发挥重要作用，具有广阔的应用前景。
本发明的优点表现为：于L-乳酸代谢途径缺失的基因工程菌中表达了外源的D-乳酸脱氢酶基因，构建的基因工程菌具有如下特性：能够生产高光学纯度的D-乳酸；外源基因的导入提高了菌体D-乳酸的生产能力。这样就避免了D，L乳酸的混合对聚乳酸性能的影响，降低了后续混酸分离的成本，为PDLA的生产提供了优质的原料，对D-乳酸生产菌株的进一步开发和改造提供了实验基础。
附图说明
图1：重组载体pEASY-T1-ldhA构建示意图；
图2：ldhA基因表达载体pXJM 19-ldhA构建示意图。
具体实施方式
材料：
1.Taq Plus DNA聚合酶(天根生化科技有限公司，中国北京)。
2.T4连接酶以及XbalI、Sac I等限制性内切酶(Fermentas公司产品，中国上海)。
3.质粒抽提试剂盒(天根生化科技有限公司，中国北京)。
4.DNA凝胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司，中国北京)。
5.基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司，中国北京)。
6.质粒载体pXJM 19、pEASY-T1(北京全式金生物技术有限公司)。
7.谷氨酸棒杆菌Res167Δldh(CGMCC 3973)、DH5α(北京全式金生物技术有限公司)。
8.氯霉素、氨苄青霉素(Sigma公司)。
9.LB液体培养基(g/L)：酵母浸粉5，蛋白胨10，氯化钠10高压灭菌。
10.Gene Pulser XcellTM型电穿孔仪(BIO-RAD公司产品，美国)。
实施例1：基因敲除载体的构建：
一、保加利亚乳杆菌中D-乳酸脱氢酶基因的克隆
(1)根据保加利亚乳杆菌ATCC 11842中ldhA基因DNA序列(NCBI-GI：4085369)，设计引物PCR扩增其结构基因，引物序列如下：
primer1：5′-GGCTAGGAGCTCTGTAAGAAAATCTGTAGGT-3′(下划线为引入的Sac I酶切位点)
primer2：5′-TGAGCTCTAGAAAAGGAGGAGGGACAArTAATGACT-3′(下划线为引入的Xba I酶切位点)
以保加利亚乳杆菌ATCC 11842的基因组DNA为模板，在引物primer1，primer2的引导下，PCR克隆ldhA基因序列，PCR的扩增条件和体系如下：
所得的PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测，得到大小为1000bp左右的电泳条带，将PCR产物切胶、纯化，与T载体，pEASY-T1连接后(图1)，转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，在氨苄青霉素的抗性平板上筛选阳性转化子，提质粒，用限制性内切酶Sac I和Xba I进行双酶切验证，经酶切获得1000bp大小的酶切片段，表明获得了插入序列正确的重组质粒，命名为pEASY-T1-ldhA。
二、基因表达载体构建
用EcoR I和Hind III对重组载体，pEASY-T1-ldhA进行双酶切，回收酶切产物，将其与用同样的内切酶双酶切处理过的pxJM 19载体进行连接(图2)，22℃连接两小时后转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，在氯霉素的抗性平板上筛选阳性转化子，提质粒，用限制性内切酶Xbal，I和Sac I进行双酶切验证，经酶切获得1000bp大小的酶切片段，表明获得了插入序列正确的重组质粒，命名为pXJM 19-ldhA，经测序后其序列如下所示：
ATGACTAAAATTTTTGCTTACGCAATTCGTGAAGATGAAAAGCCATTCTTGAAGGAATGGGAAGACGCTCACAAGGACGTCGAAGTTGAATACACTGACAAGCTTTTGACCCCAGAAACTGTTGCTTTGGCAAAGGGTGCTGACGGTGTTGTTGTTTACCAACAACTTGACTACACCGCTGAAACTCTGCAAGCTTTGGCAGACAACGGCATCACTAAGATGAGCCTGCGTAACGTTGGTGTTGACAACATCGACATGGCTAAGGCTAAGGAACTTGGCTTCCAAATCACCAACGTTCCGGTTTACTCACCAAACGCCATCGCAGAACACGCTGCTATCCAAGCTGCCCGCATCCTGCGTCAAGACAAGGCTATGGACGAAAAGGTTGCCCGTCACGACTTGCGTTGGGCACCAACTATCGGCCGTGAAGTTCGCGACCAAGTTGTTGGTGTTATAGGTACTGGCCACATCGGTCAAGTCTTCATGCAAATCATGGAAGGCTTCGGCGCTAAGGTTATCGCTTACGACATCTTCCGCAACCCAGAATTGGAAAAGAAGGGCTACTACGTAGACTCACTTGACGACCTGTACAAGCAAGCTGACGTTATTTCCCTGCACGTTCCTGACGTTCCAGCTAACGTTCACATGATCAACGACGAGTCAATCGCTAAAATGAAGCAAGACGTAGTTATCGTTAACGTATCACGTGGTCCATTGGTTGACACTGACGCGGTTATCCGTGGTTTGGACTCAGGCAAGATCTTCGGTTACGCAATGGACGTTTACGAAGGTGAAGTTGGCATCTTCAACGAAGACTGGGAAGGCAAGGAATTCCCAGACGCACGTTTAGCTGACTTAATCGCTCGTCCAAACGTTCTGGTAACTCCACACACTGCTTTCTACACTACTCACGCTGTTCGCAACATGGTAGTTAAGGCCTTCGACAACAACCTTGAATTGGTTGAAGGCAAGGAAGCTGAAACTCCAGTTAAGGTTGGCTAA
测序结果与原有序列比对，其相似率为99％，仅在300bp处发生一个碱基的突变，未发生移码和缺失现象，并且翻译后的氨基酸序列与初始序列相同，说明构建的基因表达载体pXJM 19-ldhA可用于谷氨酸棒杆菌中外源D-乳酸脱氢酶基因的表达。
实施例2：ldhA基因重组菌株的筛选
将构建好的D-乳酸脱氢酶基因表达载体pXJM 19电转化入谷氨酸棒杆菌Res 167Δldh的感受态细胞，其转化条件为：25δF，600Ω，2.5k V电击，脉冲时间10～12ms，将菌液涂布在10μg/ml氯霉素的BHIS平板上培养24小时，挑选阳性菌落，提取质粒，用引物primer1和primer2进行PCR扩增。其扩增结果均与预期值相符，表明所挑取的阳性菌落为导入重组载体pXJM19-ldhA的菌株，将其命名为C.glutamicum Res 167Δldh/ldhA。
实施例3：重组菌株的发酵试验
(1)种子培养基配方(g/L)：葡萄糖40，尿素2，酪蛋白氨基酸7，酵母抽提物2，磷酸氢二钾0.5，磷酸二氢钾0.5，七水硫酸亚铁6mg，七水合硫酸镁0.5，四水合硫酸锰0.25，维生素B10.2mg，生物素0.2mg，水1000mL。调节pH7.5。
(2)发酵培养基(g/L)：葡萄糖40，磷酸氢二钾0.5，磷酸二氢钾0.5，七水硫酸亚铁6mg，七水合硫酸镁0.5，四水合硫酸锰0.25，维生素B10.2mg，生物素0.2mg，水1000mL。调节pH7.5。
一、种子的制得：
配种子培养基，每个1L的锥形瓶中装300mL培养基，包好以后灭菌。将保存在冰箱里的长有菌种的斜面取出，每个试管加1mL无菌水，用接种针将斜面上的菌体刮下制得菌悬液。在每瓶种子培养基中加5mL菌悬液。30℃，220rpm培养10h，获得较高菌体浓度的种子。
二、发酵
将步骤一培养的种子液5000rpm离心10min，收集菌体沉淀，用发酵培养基洗涤一次，然后重悬在发酵培养基中，倒入装有1.5L发酵培养基的NBS公司3L自动发酵罐中，使发酵液中菌体的终浓度达到10g/L，发酵过程中自动流加NH4OH来保持pH稳定在7.5左右。转速为50rpm。N2流率为2.5L/min，以便获得厌氧环境。通过手动添加0.1mL 30％的消泡剂水溶液来控制泡沫。发酵4～8h后取样，测定发酵产物中D-乳酸的产量最高为40g/L，纯度达到99％以上。
Claims (2)
1.一种产高纯度D-乳酸的基因工程菌，其特征是为棒杆菌属谷氨酸棒杆菌C.glutamicum Res 167Δldh/ldhA，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为CGMCC No.4041，保藏日期2010年7月28日。
2.如权利要求1所述的产高纯度D-乳酸的基因工程菌在生产高纯度D-乳酸中的应用。
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