CN102102086A - L-乳酸脱氢酶基因缺失的工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及L-乳酸脱氢酶基因缺失的工程菌及其构建方法与应用。利用PCR扩增L-乳酸脱氢酶基因(ldh)上下游序列ldh1、ldh2，并将克隆片段连接到基因敲除载体上，将构建好的敲除载体导入到谷氨酸棒杆菌中，利用同源重组的方法将菌株中的L-乳酸脱氢酶基因(ldh)沉默后筛选获得基因工程菌C.glutamicum Res167Δldh。本发明利用同源重组的方法使谷氨酸棒杆菌中L-乳酸脱氢酶基因沉默，从而得到产纯D-乳酸的基因工程菌。用本发明的工程菌进行乳酸发酵生产，其D-乳酸产量量达到20g/L以上，纯度为99％以上。本发明将在D-乳酸的工业化生产中发挥重要作用，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体的说涉及L-乳酸脱氢酶基因缺失突变株及其构建方法用于生产高光学纯度的D-乳酸。
背景技术
乳酸作为三大有机酸之一，根据其旋光性可分为D-乳酸、L-乳酸和D，L乳酸。目前，国际上主要由微生物发酵生产乳酸，其中，L-乳酸因具有广泛的生物兼容性，因而，得到了较早的开发和生产，其生产技术和产品已趋向于成熟。随着，D-乳酸新功能的发掘，其生产和应用的研究得到了人们越来越广泛的关注。
D-乳酸在食品、医药、化工、农业等方面应用极其广泛，尤其是乳酸的聚合物-聚乳酸(PLA)，因具有良好的生物相容性而易被生物降解，用其取代现今大量使用的聚乙烯塑料，成为解决当今日益严重的白色污染一种重要方法。乳酸根据其旋光性，其聚合后得到的聚乳酸分为聚L-乳酸(PLLA)、聚D-乳酸(PDLA)及聚D，L-乳酸(PDLLA)。PLLA最早得到了开发和生产，但由于其熔点低和降解速度慢等缺点，使得聚乳酸的应用遇到了阻碍。随着，PDLA和PLLA共混合物能够增加聚乳酸热稳定性和其生物降解速度的发现，聚乳酸的研究和应用得到了快速的发展。作为合成PDLA的原料，高纯度的D-乳酸的生产研究成为目前研究的热点。
D-乳酸的生产方法主要有：(1)化学合成法；(2)酶法；(3)微生物发酵法。微生物发酵生产乳酸是以淀粉、葡萄糖等原料经微生物发酵而得，与其它两种方法相比较，微生物发酵法可以通过菌种的选育、代谢的调控而生产专一性的D-乳酸，而且原料的来源广泛，生产成本低，产品纯度高，安全性好，因此，发酵法生产D-乳酸是目前生产乳酸的最重要方法。目前，D-乳酸的生产菌株主要包括乳酸菌、大肠杆菌以及酿酒酵母。乳酸菌作为最早应用于乳酸工业化生产的菌株，其具有发酵效率高、产量高的优势，但其原料成本和后续分离成本偏高，制约了D-乳酸工业的发展；大肠杆菌所需原料简单，并且可以以戊糖为唯一碳源生产乳酸，但其生产效率过于低下，无法满足工业化生产的需求；酿酒酵母具有良好的耐酸性，免去了中和剂的加入，降低了乳酸生产的后续分离成本，但其同样存在生产效率低下的问题。因而，目前D-乳酸工业化生产中所存在的关键性的问题在于如何在低原料成本下实现高效率、高光学纯度的D-乳酸生产。2005年Okino等人通过对厌氧条件下谷氨酸棒杆菌中有机酸代谢的研究，发现在厌氧条件下谷氨酸棒杆菌能够在相对简单的原料成本下实现有机酸的高效生产，其中乳酸为主要的有机酸产物。这一研究为解决D-乳酸工业化生产中的问题提供了 一种新的解决方式。本实验室通过对谷氨酸棒杆菌厌氧条件下代谢途径的初步分析发现，在厌氧条件下谷氨酸棒杆菌中生成的乳酸为L-乳酸和D-乳酸的混合酸，因而，本实验根据这一特性，设计了相应的实验方案，敲除了谷氨酸棒杆菌ATCC13032中的L-乳酸脱氢酶基因，在谷氨酸棒杆菌中实现了高光学纯度D-乳酸的生产。(Calabia BP，Tokiwa Y (2007)Productionof D-lactic acid from sugarcane molasses，sugarcane juice and sugar beet juice by Lactobacillusdelbrueckii.Biotechnology Letters 29：1329-1332；Zhou S，Causey TB，Hasona A，Shanmugam KT，Ingram LO(2003)Production of optically pure D-lactic acid in mineral salts medium bymetabolically engineered Escherichia coli W3110.Applied and Environmental Microbiology69：399-407；Ishida N，Suzuki T， Tokuhiro K，Nagamori E，Onishi T， Saitoh S，Kitamoto K，Takahashi H(2006)D-Lactic acid production by metabolically engineered Saccharomycescerevisiae.Journal ofBioscience and Bioengineering 101：172-177)
目前，国内对D-乳酸产生菌的基因工程改造鲜有报道，更未见通过基因敲除阻断菌株中L-乳酸代谢途径的相关报道。因而，开发具有自主知识产权的L-乳酸脱氢酶基因缺失的工程菌，实现高光学纯度的D-乳酸生产，打破国外在这一领域的垄断地位，具有迫切的现实意义和应用价值。
发明内容
本发明的目的是针对目前国内缺乏基因工程菌产D-乳酸，开发一株L-乳酸脱氢酶基因缺失的工程菌用于产高光学纯度的D-乳酸，并提供一种L-乳酸脱氢酶基因缺失的构建方法。
从谷氨酸棒杆菌ATCC13032中分离克隆出L-乳酸脱氢酶基因的上游序列ldh1和下游序列ldh2，利用重叠PCR技术将其拼接成ldh1-ldh2，其作为ldh基因敲除的同源片段，与基因敲除载体pK18mobsacB连接，构建了谷氨酸棒杆菌中ldh基因的敲除载体，将其转化入宿主菌株，通过卡那抗性和蔗糖培养基的的双向筛选，建立了L-乳酸生物合成途径被阻断的基因敲除工程菌株C.glutamicum Res167Δldh。然后，通过基因敲除菌株的固体平板培养基生长实验，显示基因敲除菌株在以L-乳酸为唯一碳源的基本培养基上不能生长，证明了L-乳酸脱氢酶基因的缺失阻断了菌体中L-乳酸的代谢，提供了一株能够进行高光学纯度D-乳酸生产的基因工程菌。
因此，制备L-乳酸脱氢酶基因缺失的工程菌方法，主要包括以下步骤：
(1)根据谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组ldh编码基因的上下游DNA序列，设计PCR引物；
(2)以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，扩增ldh基因上下游片段ldh1和ldh2，利用重叠PCR进行拼接，构建基因敲除同源片段ldh1-ldh2；
(3)建立连入ldh1-ldh2的ldh编码基因的基因敲除载体pK18mobsacB-ldh；
(4)电转化制备谷氨酸棒杆菌ATCC13032的感受态细胞；
(5)利用卡那抗性的正向筛选和10％蔗糖培养基的反向筛选，筛选出阳性菌株，PCR验证得到L-乳酸脱氢酶基因缺失的工程菌C.glutamicum Res167Δldh。
本发明的谷氨酸棒杆菌达，为Res167Δldh(Corynebacterium glutamicum Res167Δldh)，已经于2010年7月2日，在北京市朝阳区北辰西路1号院3号的保藏于中国微生物菌种保藏管理中心进行了保藏，保藏编号分别为CGMCC No.3973。
对基因敲除菌株进行厌氧条件下的发酵试验，检测L-乳酸脱氢酶基因缺失的谷氨酸棒杆菌产乳酸的代谢情况。
本发明利用同源重组的方法使谷氨酸棒杆菌中L-乳酸脱氢酶基因沉默，从而得到产纯D-乳酸的基因工程菌。用本发明的工程菌进行乳酸发酵生产，其D-乳酸产量量达到20g/L以上，纯度为99％以上。本发明将在D-乳酸的工业化生产中发挥重要作用，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1：重叠PCR拼接ldh基因上下游同源片段示意图；
图2：重组载体pEASY-T1-ldh构建示意图；
图3：ldh基因敲除载体pK18mobsacB-ldh构建示意图。
具体实施方式
材料：
1.Taq Plus DNA聚合酶(天根生化科技有限公司，中国北京)。
2.T4连接酶以及EcoR I、HindIII等限制性内切酶(Fermentas公司产品，中国上海)。
3.质粒抽提试剂盒(天根生化科技有限公司，中国北京)。
4.DNA凝胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司，中国北京)。
5.基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司，中国北京)。
6.质粒载体pEASY-T1、pK18mobsacB(北京全式金生物技术有限公司，ATCC87097)。
7.谷氨酸棒杆菌ATCC13032、DH5α(北京全式金生物技术有限公司)。
8.卡那霉素、氨苄青霉素(Sigma公司)。
9.BHIS培养基(g/L)：牛脑心浸粉18.5、山梨醇91分别灭菌后混合。
10.LB液体培养基(g/L)：酵母浸粉5，蛋白胨10，氯化钠10高压灭菌。
11.Gene Pulser XcellTM型电穿孔仪(BIO-RAD公司产品，美国)。
实施例1：基因敲除载体的构建：
一、L-乳酸脱氢酶基因上下游序列的拼接
(1)根据谷氨酸棒杆菌中ldh基因(NCBI-GI：58036263)上下游DNA序列，设计引物PCR扩增其上下游序列，引物序列如下：
uldh1：5′-CCAAGGTGCCGACACTAAT-3′
dldh1：5′-CGGTGATTTCGCAACTCCAACATCTCCTG-3′
uldh2：5′-TTGGAGTTGCGAAATCACCGACCACGAGA-3′
dldh2：5′-GCTTCCAGACGGTTTCATC-3′
以谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组DNA为模板，在引物uldh1、dldh1和uldh2、dldh2的引导下，PCR克隆ldh基因的上下游同源臂序列，PCR的扩增条件和体系如下：
反应体系 扩增条件
成分 体积 温度 时间
uldh1(10pM) 1μl 95℃ 2min
缓冲液 5μl 72℃ 1min
模板 1μl 72℃ 10min
去离子水 37.5μl 4℃ 30min
聚合酶 0.5μl
总体积 50μl
所得的PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测，得到大小为700bp～800bp之间的电泳条带，将PCR产物切胶、纯化，以纯化后的PCR产物为模板，利用重叠PCR对上下游片段进行拼接(图1)，将其与T载体pEASY-T1连接后，转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，在氨苄青霉素的抗性平板上筛选阳性转化子，提质粒，用限制性内切酶EcoRI和HindIII进行双酶切验证，经酶切获得1500bp大小的酶切片段，表明获得了插入序列正确的重组质粒，命名为pEASY-T1-ldh(图2)，为了保证重组片段的正确性，对PCR产物进行测序，测序后产物基因序列如下：
AAGGTGCCGACACTAATGCCCGCGATCGTCTCCTTCGGTCCAAAATTCTTCTGCCCAATCAGCCGGATTTGGGTGCGATGCCTGATCAATCCCACAACCG TGGTGGTCAACGTGATGGCACCAGTTGCGATGTGGGTGGCGTTGTAAATTTTCCTGGATACCCGCCGGTTGGTTCTGGGGAGGATCGAGTGGATTCC C G T CGCTGCCGCATGCCCCACCGCTTGTAAAACAGCCAGGTTAGCAGCCGTAACCCACCACGGTTTCGGCAACAATGACGGCGAGAGAGCCCACCAC AT TG CG ATTTCCGCTCCGATAAAGCCAGCGCCCATATTTGCAGGGAGGATTCGCCTGCGGTTTGGCGACATTCGGATCCCCGGAACTAGCTCTGCAA TGA CCT GCG CGCCGAGGGAGGCGAGGTGGGTGGCAGGTTTTAGTGCGGGTTTAAGCGTTGCCAGGCGAGTGGTGAGCAGAGACGCTAGTCTGGGGAG CGAA ACCA TATT GAGTCATCTTGGCAGAGCATGCACAATTCTGCAGGGCATAGGTTGGTTTTGCTCGATTTACAATGTGATTTTTTCAACAAAAATA ACACT T GGT CTGAC CACATTTTCGGACATAATCGGGCATAATTAAAGGTGTAACAAAGGAATCCGGGCACAAGCTCTTGCTGATTTTCTGAGCTGC TTTGTG GGTTGT CCGGTT AGGGAAATCAGGAAGTGGGATCGAAAATGAAAGAAACCGTCGGTAACAAGATTGTCCTCATTGGCGCAGGAGATGTTGG AGTTGCG AAATCAC CGACCAC GAGATGGAACGCTTCAAGCATTCCGCAAATACCCTGCGCGAAATTCAGAAGGAGTTCTTCTAAATCTTTGGCGCCT AGTTGGCG ACGCAAGT GTTTCATT GGAACACTTGCGCTGCCAACTTTTTGGTTTACGGGCACAATGAAACTGTTGGATGGAATTTAGAGTGTTTGTA GCTTAAGGA GCTCAAATG AATGAGTTT GACCAGGACATTCTCCAGGAGATCAAGACTGAACTCGACGAGTTAATTCTAGAACTTGATGAGGTGACAC AAACTCACAG CGAGGCCATC GGGCAGGTCT CCCCAACCCATTACGTTGGTGCCCGCAACCTCATGCATTACGCGCATCTTCGCACCAAAGACCTCCG TGGCCTGCAGC AACGCCTCTCC TCTGTGGGAGC TACCCGCTTGACTACCACCGAACCAGCAGTGCAGGCCCGCCTCAAGGCCGCCCGCAATGTTATC GGAGCTTTCGCA GGTGAAGGCCCA CTTTATCCACCC TCAGATGTCGTCGATGCCTTCGAAGATGCCGATGAGATTCTCGACGAGCACGCCGAAATTC TCCTTGGCGAACC CCTACCGGATACT CCATCCTGCATCA TGGTCACCCTGCCCACCGAAGCCGCCACCGACATTGAACTTGTCCGTGGCTTCGCCAA
测序结果与原有序列相比相似率为99％，仅发生两个碱基的突变，说明构建的同源片段ldh1-ldh2可用于谷氨酸棒杆菌中ldh基因敲除实验。
二、基因敲除载体构建
用EcoRI和HindIII对重组载体pEASY-T1-ldh进行双酶切，回收酶切产物，将其与用同样的内切酶双酶切处理过的pK18mobsacB载体进行连接，22℃连接两小时后转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，在卡纳霉素的抗性平板上筛选阳性转化子，提质粒，用限制性内切酶EcoRI和HindIII进行双酶切验证，经酶切获得1500bp大小的酶切片段，表明获得了插入序列正确的重组质粒，命名为pK18mobsacB-ldh(图3)。
实施例2：同源重组后单交换菌株的筛选
将构建好的L-乳酸脱氢酶基因敲除型载体pK18mobsacB-ldh电转化入谷氨酸棒杆菌ATCC13032的感受态细胞，其转化条件为：25μF，600Ω，2.5kV电击，脉冲时间10～12ms，将菌液涂布在25μg/ml的卡那霉素的BHIS平板上培养24～48小时，挑选阳性菌落，并用含25μg/ml卡那霉素的10％蔗糖平板对初筛的转化菌落进行复筛确认，挑取能够在卡那霉素抗性平板上生长而不能在含10％蔗糖的卡那霉素抗性平板上生长的菌落，提取复筛后阳性菌落的基因组DNA，用扩增ldh1-ldh2的上下游引物dldh1和uldh2进行PCR扩增。另外用扩增sacB基因部分片段的引物s1和s2进行PCR扩增，其扩增结果均与预期值相符，表明所挑取的阳性菌落为已发生单交换的菌株，即基因敲除载体pK18mobsacB-ldh已经整合到C.glutamicum ATCC13032的基因组中，命名整合后的菌株为C.glutamicum Res 167L。
实施例3：ldh基因敲除菌株的筛选
将发生单交换的菌株C.glutamicum Res167L接入到不含有抗生素的液体LB培养基中过夜培养，然后收集菌液，离心浓缩后涂布在含有10％蔗糖的LB培养基上，挑取长出的阳性菌株，分别点在含有卡那霉素和不含有卡那霉素的固体LB平板上，挑取在不含抗生素平板上能够生长，而在含有抗生素的平板上不能生长的菌落摇菌，进一步用扩增ldh1-ldh2的上下游引物dldh1和uldh2进行菌落PCR。另外用扩增ldh的引物和ldh1-ldh-ldh2片段的内部扩增引物up1和down1进行PCR扩增。三对PCR引物的扩增结果均与预期值相符，表明筛选的菌株为双交换菌株，即为ldh基因敲除菌株C.glutamicum Res167Δldh。
实施例4：ldh基因敲除菌株的应用
(1)种子培养基配方(g/L)：葡萄糖40，尿素2，酪蛋白氨基酸7，酵母抽提物2，磷酸氢二钾0.5，磷酸二氢钾0.5，七水硫酸亚铁6mg，七水合硫酸镁0.5，四水合硫酸锰0.25，维生素B10.2mg，生物素0.2mg，水1000mL。调节pH7.5。
(2)发酵培养基(g/L)：葡萄糖40，磷酸氢二钾0.5，磷酸二氢钾0.5，七水硫酸亚铁6mg，七水合硫酸镁0.5，四水合硫酸锰0.25，维生素B10.2mg，生物素0.2mg，水1000mL。调节pH7.5。
一、种子的制得：
配种子培养基，每个1L的锥形瓶中装300mL培养基，包好以后灭菌。将保存在冰箱里的长有菌种的斜面取出，每个试管加1mL无菌水，用接种针将斜面上的菌体刮下制得菌悬液。在每瓶种子培养基中加5mL菌悬液。30℃，220rpm培养10h，获得较高菌体浓度的种子。
二、发酵
将步骤一培养的种子液5000rpm离心10min，收集菌体沉淀，用发酵培养基洗涤一次，然后重悬在发酵培养基中，倒入装有1.5L发酵培养基的NBS公司3L自动发酵罐中，使发酵液中菌体的终浓度达到10g/L，发酵过程中自动流加NH4OH来保持pH稳定在7.5左右。转速为50rpm。N2流率为2.5L/min，以便获得厌氧环境。通过手动添加0.1mL30％的消泡剂水溶液来控制泡沫。发酵4～8h后取样，测定发酵产物中D-乳酸的产量最高为20g/L，纯度达到99％以上。
Claims (5)
1.L-乳酸脱氢酶基因缺失的工程菌，其特征在于所述基因工程菌为谷氨酸棒杆菌Res167Δldh(Corynebacterium glutamicum Res167Δldh)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.3973。
2.L-乳酸脱氢酶基因缺失的工程菌的构建方法，其特征是基因工程菌是利用PCR扩增L-乳酸脱氢酶基因(ldh)上下游序列ldh1、ldh2，并将克隆片段连接到基因敲除载体上，将构建好的敲除载体导入到谷氨酸棒杆菌中，利用同源重组的方法将菌株中的L-乳酸脱氢酶基因(ldh)沉默后筛选获得基因工程菌。
3.如权利要求2所述的方法，其特征是步骤如下：
(1)根据谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组ldh编码基因的上下游DNA序列，设计PCR引物；
(2)以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，扩增ldh基因上下游片段ldh1和ldh2，利用重叠PCR进行拼接，构建基因敲除同源片段ldh1-ldh2；
(3)建立连入ldh1-ldh2的ldh编码基因的基因敲除载体pK18mobsacB-ldh；
(4)电转化制备谷氨酸棒杆菌ATCC13032的感受态细胞；
(5)利用卡那抗性的正向筛选和10％蔗糖培养基的反向筛选，筛选出阳性菌株，PCR验证得到L-乳酸脱氢酶基因缺失的工程菌C.glutamicum Res167Δldh。
4.根据权利要求3所述的方法制备方法，其特征在于所述的PCR的引物序列为：
uldh1：5′-CCAAGGTGCCGACACTAAT-3′
dldh1：5′-CGGTGATTTCGCAACTCCAACATCTCCTG-3′
uldh2：5′-TTGGAGTTGCGAAATCACCGACCACGAGA-3′
dldh2：5′-GCTTCCAGACGGTTTCATC-3′
s1：5′-TTGTGCGTAACTAACTTGC-3′
s2：5′-AGATGTTTTCTTGCCTTTG-3′
up1：5′-GCTTGTAAAACAGCCAGG-3′
down1：5′-GTGGTAGTCAAGCGGGTAG-3′。
5.L-乳酸脱氢酶基因缺失的谷氨酸棒杆菌应用，其特征在于应用于发酵生产D-乳酸。
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