CN111057711B

CN111057711B - 鞘氨醇单胞菌工程菌及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN111057711B
Application number: CN201911374275.0A
Authority: CN
Inventors: 胡炎华; 马挺; 吴萌萌; 史忠; 于宏艳
Original assignee: Langfang Meihua Bio Technology Development Co Ltd
Current assignee: Langfang Meihua Bio Technology Development Co Ltd
Priority date: 2019-12-25
Filing date: 2019-12-25
Publication date: 2022-01-18
Anticipated expiration: 2039-12-25
Also published as: CN111057711A

Abstract

本发明提供一种鞘氨醇单胞菌工程菌及其构建方法和应用。本发明以Sphingomonas sp.T‑3为出发菌株，利用基因过表达方法实现了三赞胶合成三个关键基因的高效转录，构建得到工程菌株MH‑10，通过优化发酵条件，有效提高了微生物多糖(三赞胶)的产量，具有广泛的工业应用价值。

Description

鞘氨醇单胞菌工程菌及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及代谢工程、基因工程和发酵工程技术领域，具体地说，涉及鞘氨醇单胞菌工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

微生物多糖是一类由微生物合成的由10个及以上单糖或衍生物经过糖苷键聚合形成的高分子聚合物。因其种类繁多、性能多样、生产周期短、不受气候和地理环境条件限制的优点，微生物多糖是一种与人们生活息息相关的生物技术产品，目前已在食品、饲料、医药、日化、石油开采等行业发挥着不可或缺的作用。

目前，已经发现且广泛应用的微生物多糖有纤维素、海藻酸、黄原胶、果聚糖、葡聚糖等，以及一类由鞘氨醇单胞菌属合成的微生物多糖，即鞘氨醇胶。主要包括：Sphingomonas elodea ATCC3161合成的结冷胶，Sphingomonas sp.ATCC31555合成的韦兰胶，Sphingomonas sp.ATCC53159合成的迪特胶，Sphingomonas sp.ATCC31961合成的鼠李胶等。此类鞘氨醇胶具有相对保守的主链结构，而侧链基团的种类、位置具有极大的多样性，这使鞘氨醇胶的结构和功能更加丰富，从而赋予了每一种鞘氨醇胶独特的物理性质。比如没有糖基侧链的结冷胶能形成凝胶，从而在食品、日化和医学上得到了广泛的应用；具有鼠李糖或甘露糖侧链的韦兰胶，能形成耐酸、耐碱、耐高温的高粘度的溶液，具有一个或两个鼠李糖侧链的迪特胶在低浓度条件下即可形成高粘度的溶液，在建筑、日化、采油等高技术领域应用广泛；随着生物技术的发展，越来越多的可产鞘氨醇胶的菌株被鉴定，而这些新发现的天然聚合物资源在未来的生物胶应用中必将发挥更加重要的作用。

鞘氨醇单胞菌属的菌株生产微生物多糖普遍产量低，主要原因一方面是菌株转化碳源合成多糖的效率较低，这与菌种本身的代谢水平有关；另一方面是发酵工艺尚需进一步优化。

鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.T-3是环境中筛选到的一株可合成新型多糖三赞胶的菌株。产物三赞胶的提取无需借助任何有机溶剂(乙醇、异丙醇、丙酮等)，只需要将发酵液pH调至3.0左右即可。三赞胶可作为增稠剂、凝胶剂、悬浮剂、乳化剂广泛应用于食品、日化、采油等行业中。但是目前，菌株合成多糖三赞胶的产量较低，尚有较大的提升空间。三赞胶作为一种有巨大应用潜力的工业技术产品，利用基因编辑技术提高产量，降低生产成本，可有效促进其工业化推广。

发明内容

本发明的目的是提供一种鞘氨醇单胞菌工程菌及其构建方法和应用。

本发明构思如下：以Sphingomonas sp.T-3为出发菌株，利用基因过表达方法实现了三赞胶合成三个关键基因的高效转录，构建得到工程菌株MH-10，通过优化发酵条件，有效提高了微生物多糖(三赞胶)的产量，具有广泛的工业应用价值。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种基因表达盒，所述基因表达盒含有来自鞘氨醇单胞菌的pgmG、ssB和ssG基因。

优选地，所述pgmG、ssB和ssG基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1-3所示。

第二方面，本发明提供含有所述基因表达盒的生物材料，所述生物材料包括但不限于转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或工程菌或转基因细胞系。

第三方面，本发明提供所述基因表达盒，或者含有所述基因表达盒的生物材料在构建产三赞胶的工程菌中的应用。

第四方面，本发明提供一种鞘氨醇单胞菌工程菌，所述工程菌是将pgmG、ssB和ssG基因通过质粒导入鞘氨醇单胞菌中或通过基因工程手段整合到鞘氨醇单胞菌染色体上而成。

进一步地，所述工程菌是将pgmG、ssB和ssG基因构建到同一质粒上，或者将pgmG、ssB和ssG基因分别构建到不同质粒上，然后将重组质粒导入鞘氨醇单胞菌中得到的。

可选地，pgmG、ssB和ssG基因通过同一质粒(如pBBR1mcs-2)导入鞘氨醇单胞菌(如Sphingomonas sp.T-3菌株)中。Sphingomonas sp.T-3菌株保藏编号为CGMCC NO:10150，参见CN104651284A。

第五方面，本发明提供一种构建产三赞胶的工程菌(鞘氨醇单胞菌工程菌)的方法，将pgmG、ssB和ssG基因构建到同一质粒上，或者将pgmG、ssB和ssG基因分别构建到不同质粒上，然后将重组质粒导入鞘氨醇单胞菌中，得到过表达pgmG、ssB和ssG基因的工程菌。

第六方面，本发明提供所述工程菌，或者按照上述方法构建得到的工程菌在发酵生产三赞胶中的应用。

第七方面，本发明提供三赞胶的生产方法，包括在发酵培养基中对所述工程菌，或者按照上述方法构建得到的工程菌进行培养以生产三赞胶。

优选地，培养所述工程菌使用的发酵培养基配方为：葡萄糖40g/L，玉米浆7.34g/L，MgSO₄·7H₂O 3.98g/L，CaCO₃ 3.34g/L，K₂HPO₄·7H₂O 0.9g/L，pH 7.0。

发酵条件为：30℃，200rpm震荡培养，控制发酵体系pH为6.8～7.2。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明提供的鞘氨醇单胞菌工程菌MH-10，在优化微生物多糖(三赞胶)合成途径的基础上，对其相应的发酵工艺进行了优化，最终达到提高其微生物多糖产量的目的。相比于优化前三赞胶产量提升了23.9％左右，相比于原始菌株T-3，产量提升了35.9％左右。工程菌MH-10具有更高的糖胶转化率和三赞胶产量，工业应用前景广阔。

附图说明

图1为本发明实施例1中构建的重组质粒pBGBG的质粒框架图。

图2为本发明实施例3中摇瓶发酵条件下的三赞胶发酵产量。

图3为本发明实施例4中碳源种类(上)与葡萄糖浓度(下)对三赞胶发酵产量的影响。

图4为本发明实施例4中氮源种类(上)与玉米浆浓度(下)对三赞胶发酵产量的影响。

图5为本发明实施例4中磷酸盐种类(上)与K₂HPO₄·7H₂O浓度(下)对三赞胶发酵产量的影响。

图6为本发明实施例4中硫酸镁浓度对三赞胶发酵产量的影响。

图7为本发明实施例4中碳酸钙浓度对三赞胶发酵产量的影响。

图8为本发明实施例4中不同菌株合成三赞胶的产量比较。

图9为本发明实施例5中不同菌株和不同配方合成三赞胶流变性能的比较。

具体实施方式

本发明提供一种可高效合成三赞胶的工程菌构建方法，包括以下步骤：

A、通过基因工程技术构建关键基因的高表达质粒；

B、通过接合转移方法转移高表达质粒至Sphingomonas sp.T-3菌株中，构建获得工程菌株MH-10；

C、通过优化发酵培养基配方和发酵工艺，进一步提高三赞胶的产量。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中使用的培养基配方：

TPG液体培养基：葡萄糖10g/L,蛋白胨5g/L，酵母粉3g/L，牛肉浸粉3g/L。

种子培养基：蔗糖10g/L，蛋白胨2.5g/L，酵母粉1.5g/L，K₂HPO₄ 2.5g/L，MgSO₄0.1g/L，pH 7.0。

优化后发酵培养基：葡萄糖40g/L，玉米浆7.34g/L，MgSO₄·7H₂O 3.98g/L，CaCO₃3.34g/L，K₂HPO₄·7H₂O 0.9g/L，pH 7.0。

其中，玉米浆是玉米生产的副产品，其生产过程及其典型化学组成参照陈璥主编《玉米淀粉工业手册》，中国轻工业出版社，2009年，第一版P116-125。

以下实施例中使用的引物序列信息如表1所示：

表1引物序列信息

引物名称	序列(5’-3’)
		pgmG1	atggtggaggcaatgttggt
pgmG2	tcaggtgatgacgctgggct
		ssB1	gtggcggcccaagcggccac
ssB2	tcagaaggcattgcggtgca
		ssG1	atggcgacttcccccttccg
ssG2	ctacgccatttcatcctcct

以下实施例中使用的菌株及质粒信息如表2所示：

表2菌株及质粒信息

实施例1三赞胶合成关键基因高表达载体及重组菌的构建

研究表明，基因pgmG、ssB和ssG是三赞胶合成的关键基因。使用基因组提取试剂盒提取Sphingomonas sp.T-3菌株的总DNA，靶基因的扩增以T-3基因组为模板，分别使用引物pgmG1/pgmG2、ssB1/ssB2以及ssG1/ssG2，利用PrimeSTAR DNA聚合酶(Takara Bio,Tokyo,Japan)分别扩增pgmG、ssB和ssG三个基因(SEQ ID NO:1-3)，将获得的目的基因条带通过胶回收试剂盒进行纯化回收，获得目的片段。首先将片段pgmG及pBBR1mcs-2质粒同时使用限制性酶KpnI、EcoRI在37℃条件下酶切90min。将酶切后的片段使用试剂盒进行PCR纯化回收，将两者的回收产物用T4DNA连接酶于16℃过夜连接，得到重组质粒pBG，并将重组质粒转入E.coli S17感受态细胞中进行重组质粒的扩增，挑取测序正确的单菌落进行甘油保存。按照相同的方法依次连接ssB基因至pBG获得pBGB重组质粒，最终在pBGB重组质粒的基础上连接ssG基因获得重组质粒pBGBG(质粒框架图见图1)。将重组质粒pBGBG转入E.coli S17感受态细胞中进行重组质粒的扩增，挑取测序正确的单菌落，即为重组菌E.coli s17/pBGBG。

实施例2基因工程菌株MH-10的构建

在平板培养基挑取Sphingomonas sp.T-3单菌落接种至含氯霉素的5ml种子培养基，30℃恒温摇床中200rpm培养24h，挑取E.coli s17/pBGBG的单菌落至含有卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃恒温摇床中200rpm培养8h，两株菌各取5ml 6000rpm离心5min收集菌体，用10mmol/L的MgSO₄溶液洗涤两次，离心，再用200ul的MgSO₄溶液重悬菌体，将T-3和E.coli s17/pBGBG按照2:1的比例混匀后抽滤至孔径放置在0.22um的滤膜上，将菌体朝上的滤膜置于无抗性平板上，于30℃恒温培养箱中培养12h进行接合转移。用200ul MgSO₄溶液洗涤滤膜上的菌体，梯度稀释后涂布于含有氯霉素和卡那霉素的双抗平板上，于30℃恒温培养箱中培养72h。在双抗平板上挑取单菌落至5ml含双抗的种子液体培养基中，30℃恒温摇床中200rpm培养36h。使用通用引物为M13R/M13F进行菌落PCR验证，确定正确的重组菌株，命名为MH-10，甘油管保存在-80℃。

实施例3基因工程菌株MH-10的摇瓶发酵

(1)将基因工程菌MH-10单菌落接种至5ml的TPG液体培养基中，30℃振荡培养24h；

(2)将步骤(1)制得的培养液接种至100ml的种子培养基中，30℃振荡培养24h；

(3)以6～10％的接种量将步骤(2)制得的种子液接种至含有初始发酵培养基的玻璃摇瓶中，30℃，恒定pH 6.8～7.2，200rpm，震荡培养72h；

(4)将步骤(3)中的发酵液用稀盐酸调节pH至3.0左右，烘干得到微生物多糖，称重，与原始菌株对比产量，结果如图2所示。相比于原始菌株T-3，工程菌株MH-10合成三赞胶产量提升了9.7％。

其中，初始发酵培养基：葡萄糖40.0g/L，蛋白胨2.5g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，碳酸钙1.5g/L，pH7.0。

实施例4基因工程菌株MH-10的发酵培养基优化

以下优化实验均采用与实施例3相同的发酵条件进行。

1、碳源优化：在选择最佳碳源种类的基础上，在培养基中加入一定量的碳源，使发酵培养基的碳源终浓度分别为4.0％、4.5％、5.0％、5.5％、6.0％，测定发酵转化率及碳源残留量，以确定碳源的最佳加入量，结果如图3所示。最终确定碳源为葡萄糖，浓度为4.0％。

2、氮源优化：在发酵培养基中加入等量、不同种类的氮源，如硫酸铵、氯化铵、磷酸氢二铵、硝酸钠、硝酸钾、硝酸铵、尿素、实验室豆粉、工业豆饼粉、精制蛋白胨、工业蛋白胨、鱼粉蛋白胨、鱼粉、玉米浆，振荡培养72h后测定产物量。在选择最佳氮源种类的基础上，设置不同的氮源浓度梯度，确定最佳氮源加入量，结果如图4所示。结果表明，有机氮源的效果优于无机氮源，无机氮源中硝酸钠效果最好，有机氮源中豆饼粉效果较好，玉米浆效果最佳。以玉米浆为氮源，随玉米浆用量的增加，产物量和转化率都提高，最佳的玉米浆用量为0.8％。

3、无机盐对发酵的影响：在发酵培养基中加入等量、不同种类的磷酸盐，选择最佳磷酸盐种类，进而确定磷酸盐最佳加入量，结果如图5所示。由此发现，磷酸盐种类对发酵转化率的影响不大，比较而言，Na₂HPO₄/NaH₂PO₄组合以及K₂HPO₄·7H₂O的效果最好，从成本考虑，选择K₂HPO₄·7H₂O为培养基的磷酸盐。进一步进行K₂HPO₄·7H₂O浓度梯度实验，选择0～0.72％的6个不同的磷酸盐加入量，进行摇瓶发酵，结果如图5所示，磷酸盐加入量为0.09％时，发酵转化率最高。

4、采用相同方法研究Mg²⁺、CaCO₃对发酵转化率的影响

镁离子是许多重要酶(如己糖磷酸化酶、柠檬酸脱氢酶、羧化酶等)的激活剂。镁离子不但影响基质的氧化，还影响蛋白质的合成。因此考察MgSO₄·7H₂O对三赞胶的影响，在0～0.5％的范围内，以产物转化率为主要指标，选出最佳浓度。试验结果表明MgSO₄·7H₂O浓度为0.2％时转化率最高(图6)。

CaCO₃在发酵培养基中主要起pH缓冲剂的作用，加入过多无法利用时，就会以沉淀的形式留在产品中，从而影响产品质量。实验结果(图7)表明，CaCO₃加入越多发酵转化率越高，摇瓶发酵结束后，将发酵液于10000r/min离心15min观察碳酸钙残留情况，结合对发酵转化率的影响，选择0.3％为最优加入量。

上述实验结果表明，合成三赞胶的最佳碳源为葡萄糖，氮源种类对产物的合成影响显著，最佳无机氮源为硝酸钠，最佳有机氮源为玉米浆。单因素实验表明，碳源的最佳浓度为40g/L，最佳玉米浆浓度为8g/L；K₂HPO4·7H₂O、MgSO₄·7H₂O和CaCO₃的最佳浓度为0.9g/L、2g/L和3g/L。优化得到最佳培养基配方：葡萄糖40g/L，玉米浆7.34g/L，MgSO₄·7H₂O3.98g/L，CaCO₃ 3.34g/L，K₂HPO₄·7H₂O 0.9，pH 7.0。三次发酵工程菌株MH-10获得三赞胶产量为28.9g/L±0.12％，相比于优化前产量提升了23.9％左右，相比于原始菌株T-3，产量提升了35.9％左右(图8)。

可以看出，本发明构建的工程菌MH-10的具有更高的糖胶转化率和三赞胶产量，该菌株工业应用前景广阔。

实施例5基因工程菌株MH-10与出发菌株产生三赞胶的性能对比

将T-3与MH-10两菌株分别在实施例3所用的初始发酵培养基中，采用与实施例3相同的发酵条件获得三赞胶样品，同时将MH-10在实施例4中优化后的培养基获得发酵样品，并对所获得的三赞胶样品进行流变性能测定。测定方法如下：将三赞胶溶于超纯水中配制成10mg/ml的溶液，然后采用TA流变仪进行流变性能测定。检测温度为25℃，剪切速率范围为0.001s^-1-1000s^-1。结果显示，工程菌株合成三赞胶具有比原始菌株较高的低剪切粘度。培养基优化后其低剪切粘度进一步得到提升(图9)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 廊坊梅花生物技术开发有限公司

<120> 鞘氨醇单胞菌工程菌及其构建方法和应用

<130> KHP191116613.9

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1644

<212> DNA

<213> 鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)

<400> 1

atggtggagg caatgttggt tcagattgtc gagacggtag cgtttgacga ccagaagccg 60

ggcacgtcgg gcctgcgcaa gaaagtccgc gtgttccagc agccgaacta tgccgagaat 120

ttcgtgcagt cggtgttcga ctcgctcgaa ggctatgccg gcgatacgct ggtggtcggc 180

ggcgacgggc gcttcctcaa ccgcgaggtg atccaggtcg tgctgcgcat ggccgcggcc 240

aacggcttcg gccgcgtgat cgtcggccag ggcggcattc tttcgacccc ggcggcgagc 300

catgtgatcc ggaaatatgg cgccttcggc ggcctcgtcc tgtccgccag ccacaatccc 360

ggcgggccgg acgaggattt cgggatcaaa tataatatcg gcaatggcgg ccccgcgccg 420

gagagcgtga ccgatgcgat ccatgcgcgc tcgctgacca tcacccgcta caagacgctc 480

gagacgcccg acatcgatct cgacgcgatc ggcacgcacg acgtcgccgg catggcggtg 540

gaagtgatcg atccggtcgc cgactatgcc gaactgatgg agacgctgtt cgacttcgcc 600

gcgatccgcg cgctgctcgg caccggcttc acgatcagct tcgacgcgat gagcgccgtt 660

accggcccct atgcgaccga aatcttcgag cgccggctgg gcgcgcccgc cggcaccgtc 720

gtcaacggca cccccctgcc cgacttcggg caccatcatc ccgaccccaa cctcgtccac 780

gccaaggatc tctacgatcg gctgatgcag gcggacggtc ccgatttcgg cgccgcctcg 840

gatggggacg gcgatcgcaa cctgatcatc ggcaagcagc gttatgtgac gccgtcggac 900

tcgctggcgg tgctcgccgc gaacgcgcat ctggcgccgg gctatgcctc cggcctcgcc 960

ggcatcgcgc gctcgatgcc gacgagcggc gccgccgacc gcgtcgccgc cgcgctcggc 1020

atcccgctct acgagacccc gaccggctgg aaattcttcg gcaacctgct cgatgccggc 1080

ctcgcgacga tctgcggcga ggaaagcgcc ggcaccggat ccagccatgt ccgcgagaag 1140

gacgggatct gggcggtgct gctgtggctc aacatcctcg cggcgcggcg ggaatcggtc 1200

gcggcgatca tggcggacca ttgggcgcgc tacggccgca actattacgc ccggcacgac 1260

tatgaggcga tcgccaccga ccgggccaac gcgctgatgg cgaagctgcg cgacagtctg 1320

gcgacgctgg ccggcaccga aacgcctgcg ggcgcggtgc aggctgccga cgatttcagc 1380

tataccgacc ctaccgacgg atcggtgagc gcgaagcagg gcgtgcgcat cctgttcgcc 1440

gaaggctcgc gcctcgtctt ccgcctgtcg ggcacgggaa cgcagggcgc gacgttgcgg 1500

ctctatatcg agcgttacga gccggcgggt ggcgatctcg ggctcgagcc gggcgacgcg 1560

ctggcgccgc tgatcgctgc ggcggagcag ctagcatcga tccgcgaatt caccggcatg 1620

gacgagccca gcgtcatcac ctga 1644

<210> 2

<211> 1407

<212> DNA

<213> 鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)

<400> 2

gtggcggccc aagcggccac gctgccctcc gcaccggatt tcgactcgat tccgcccctt 60

ccggcggacc ttccccgtcc caagaagacg cggcggcttg cgatctcgct ggcggtgctg 120

gcgggagaca tcatcgcgat cacgctggcc ttcgtgctcg tcggcctgat ccgtttcgac 180

ggcgtgctcg ccagcgacac caccaacatg ctggtcgcga tcctgccggt ctatctcggc 240

acggcgctca acagcaacgc ctatgacacg cgggcggtga gccagtggcg catgggcatg 300

taccgcgcca cgacctcgct gctgttcacc agcggcgcgg cgatcctcgc ggtcttcttc 360

ctgaaggcga ccggcgattt ctcgcgcctc gtgttcggct tcggcgtcgc caccgccttc 420

gcgctgctcg tcgtgcagcg cttcgccttc tcccgcgtgg cgcgccgcgc gctgggcaac 480

agcgcgctga ccgaaatcat catccgcgac aatgtcgata tcgacgccag cggcggccga 540

ttcgtcatcg acgccaagcg ctatcgcctc gcgcccgcca tcgacgatcc ggtgatgatg 600

gatcggctgg gctgcgtgct caagaacgcc gaccgcgtga tcgtcgcctg cgcgcccaag 660

gatcgccagc gctgggcgct cgcgctgaag ggcgcggacg tcaacgccga ggtacttgcg 720

ccggaactcg atgcgatcgg cccgcttcag ctcggccgtc tcggcggtcg cacgaccttg 780

caggttgcga ccggccgcct cggcattacc gatcgcacct tgaagcgcat gctcgatctg 840

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gtgaagctcg acagccccgg ccccgtcttc ttcgtccagc agcggatcgg ccagggcaac 960

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<210> 3

<211> 1380

<212> DNA

<213> 鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)

<400> 3

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ttcctcagtt cggcgctgct gggcatcgcg ctgatccttg gcggcggcgg cgcgcgcttc 120

cccgccaccg agatcgttgt gcagtgcaca gccctgatcg tgctcgtgta catgctcgcg 180

gaatatcgcc gcgaccgggc cgcgctgttc gactggctgg gaatcggctt cgtgctgctg 240

gtgctgctgc tgccgctggt gcaactgatc ccgctgccgc ccgcgacctg gcgggcactg 300

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ccgctcagcc tgattccgga tgcgacggtg tcgatgtggc tgaccctgat cgtgcccgtc 420

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agcgacgccg tctatttcta caacacctcg cagcagggat tgcccaccgg cgtgttcgcc 600

aaccgcaatc accaggcatt gctgatggtg ctggcgctgc tcacggcctg gctgctcgcg 660

cgcgaccggc ggcgcaaggg ccgcgcgctg gcgatacgat ggggtctgtt cgggctgatg 720

gcgctgttcg cagccgcagc attggccacc gcctcgcgca ccggctcggt gctgctgctg 780

ctcgcgctcg cggccgtgtt cgtgccgatg gtggtgcgcc atcgccgccg ctctgcgctg 840

atcggcggca gcatcgccgg ggtgaccgtt ctgctggtcg cgatcctggt gcagaccggc 900

gcgttccagc gcctgatggg ccgcttcgcg ctggatgacg acaaccgctt tcacttctgg 960

cccgacgtga cctacgcgat cggctcggtg tggccgttcg gctcgggata cggcacgttc 1020

gacccctatt tccgctcgat cgagagcctc gattcgctgg gcagccattt catcaaccat 1080

gcccacaacg actatctgga actggcgctg gaaggcggcc tgcccgcggt ggtggcgatg 1140

gcgttgttcg cgctcttcct cctggtcgca gcatggcgca tgctgcggca tcggcagccg 1200

gggcccgaag gcggccgcgg ctggatcgcg ctggcaggga tattcctcgc aatgttgcat 1260

agcctcgtcg attatccatt gcgcaccttc gcagttgcag cattattcgc tctgctctgt 1320

ggcctgctgg tgcgggcgct gcgcccggct tcgagcgcag aggaggatga aatggcgtag 1380

Claims

1.鞘氨醇单胞菌工程菌，其特征在于，所述工程菌是将pgmG、ssB和ssG基因通过质粒导入鞘氨醇单胞菌中或通过基因工程手段整合到鞘氨醇单胞菌染色体上而成；

其中，pgmG、ssB和ssG基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1-3所示；

所述鞘氨醇单胞菌为Sphingomonas sp.T-3。

2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌是将pgmG、ssB和ssG基因构建到同一质粒上，或者将pgmG、ssB和ssG基因分别构建到不同质粒上，然后将重组质粒导入鞘氨醇单胞菌中得到的。

3.根据权利要求2所述的工程菌，其特征在于，pgmG、ssB和ssG基因通过同一质粒导入鞘氨醇单胞菌中；

其中，所述质粒为pBBR1mcs-2。

4.构建产三赞胶的工程菌的方法，其特征在于，将pgmG、ssB和ssG基因构建到同一质粒上，或者将pgmG、ssB和ssG基因分别构建到不同质粒上，然后将重组质粒导入鞘氨醇单胞菌中，得到过表达pgmG、ssB和ssG基因的工程菌；

所述鞘氨醇单胞菌为Sphingomonas sp.T-3。

5.权利要求1-3任一项所述工程菌，或者按照权利要求4所述方法构建得到的工程菌在发酵生产三赞胶中的应用。

6.三赞胶的生产方法，其特征在于，包括在发酵培养基中对权利要求1-3任一项所述工程菌，或者按照权利要求4所述方法构建得到的工程菌进行培养以生产三赞胶。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，培养所述工程菌使用的发酵培养基配方为：葡萄糖40g/L，玉米浆7.34g/L，MgSO₄·7H₂O 3.98g/L，CaCO₃ 3.34g/L，K₂HPO₄·7H₂O0.9g/L，pH 7.0。