CN113248629B - 一种从发酵液中提取三赞胶的方法及其产物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物多糖提取技术领域，具体公开了一种从发酵液中提取三赞胶的方法及其产物。本发明的一种从发酵液中提取三赞胶的方法，先以中性可溶性盐处理所述发酵液后，再加入乙醇使体系中乙醇的浓度达到30‑40％，之后调整所述体系的pH至1.0‑3.0，经分离操作后，将获得的粗品以乙醇浸泡，以获得乙醇浓度为72‑85％的物料体系，然后调整所述物料体系的pH至6.0‑8.0，并保证所述物料体系中乙醇的浓度为70‑82％，再次分离。本发明获得的产品具有凝胶强度大，产品粘度高，菌落总数低，产品合格率高等优势。同时，将所获得的母液经过蒸馏，可达到回收和再利用的效果，具有很高的可实用性，利于工业化生产。

Description

一种从发酵液中提取三赞胶的方法及其产物
技术领域
本发明涉及微生物多糖提取技术领域，具体地说，涉及一种从发酵液中提取三赞胶的方法及其产物。
背景技术
三赞胶是一种微生物多糖，属生物高分子聚合物。该产品因其水溶液粘度高，增稠性能好，且具有良好的热凝胶和凝胶热可逆性能，能均匀悬浮终产品中的固体微粒而常被用做增稠剂、稳定剂和凝固剂。该产品当前应用于食品领域中的中性植物蛋白饮料、酸性果蔬汁饮料以及肉灌肠类中，如专利CN108719730公布了三赞胶在悬浮稳定剂中的应用，利用三赞胶制备的悬浮体系具有良好的回复性，经运输过程的剧烈震荡或搅动后，仍可回复到原先的悬浮状态且该悬浮稳定剂制得的悬浮饮料，流动性好，不结冻，且具有良好的稳定性，不沉淀不析水，耐酸耐热性能好。专利CN110463770公布了一种基于三赞胶的稳定剂，其能够应用于大豆、花生、杏仁、核桃、椰子等植物蛋白饮料制作中，制得的植物蛋白饮料在常温条件下贮存6个月，饮料不分层、不析水、不絮凝。专利CN109674029则将三赞胶与多种组分复配，用于香肠的复配增稠剂，该复配增稠剂为香肠提供了非常强的保水保油效果，并且可以显著的提高香肠的口感。可以看出，因三赞胶独特的增稠，悬浮和凝胶性质，其在食品行业必然具有广阔的应用前景。
目前三赞胶的工业化生产是以鞘氨醇单胞菌为生产菌种，在碳源、氮源、无机盐等营养物质存在下，经过发酵、提取、干燥等工艺制成。如专利CN1995326中，采用鞘氨醇单胞菌CGMCCNo.1650接种到含有碳源、氮源及营养物质的培养基中；调节培养液的pH，进行通气搅拌发酵；发酵液则用中性盐调节等电点、沉降萃取、脱水后获得产品。专利CN110079569则将鞘氨醇单胞菌(Sphingomonassp.)CGMCCNo.1650接种到灭菌后且含有废糖蜜或废葡萄糖母液等碳源、氮源及营养物质的培养液中，通过调节过程参数，并在补充碳源的条件下进行通气发酵。结束后的发酵液通过酸沉降萃取得到纤维状三赞胶并采用强碱弱酸盐或二价碱调节pH制成膏状物料。而相应的，高校等科研机构，往往采取小试方法进行产品的提取，如科技文献(DOI:10.3969/j.i ssn.1005-652 1.2013.04.034)中将发酵液稀释10倍，离心去除不溶物，上清液中加入盐酸，调节pH至3.0左右，再用玻璃棒搅拌并充分振荡，将凝集沉淀下来后透析，再烘干粉碎产物。
具体地，对于三赞胶的提取，现有技术如CN 110079569A，先对发酵液加入氢氧化钠或氢氧化钾溶液进行预处理，再使用有机酸或无机酸进行等电萃取，分离后加入强碱弱酸盐或二价碱调节pH获得膏状物料。由于前期加入了碱性物质或溶液，后期再进行酸性调整，这无疑加大了酸的用量，造成了生产成本的增加。而纤维物料在进行中和过程中形成的膏状物料，存在搅拌混匀困难，易形成不均匀颗粒或块状料等缺点，因此其对搅拌设备的要求非常高，形成的膏状产品容易出现不均一，有团块物料，产品性能不均一等问题。同时，由于三赞胶属于微生物能利用的多糖类物质，极易被微生物分解利用而发生变质，因此膏状物料也加大了运输和储存的难度。
专利CN110760015A，虽通过在发酵液中加入双氧水或次氯酸钠，进行升温处理并对输送管道及设备进行消杀处理，但产品粘度仍然存在偏低的问题，且产品凝胶强度并未得到明显的提升。专利CN1995326B中公开了以鞘氨醇单胞菌(Sphingomonassp.)CGMCCNo.1650在以葡萄糖或蔗糖为培养基的碳源，在通风搅拌的条件下发酵，完成后的发酵液用可溶性中性盐调节等电点、沉降萃取、脱水后即得微生物多糖三赞胶。工艺路线简单，但其工艺未采取任何杀菌措施，所制备的产品菌落总数指标高，悬浮稳定性差，1％水溶液粘度低。如采用高温灭菌，则会使三赞胶质量指标下降，悬浮能力变差，影响应用效果。
其它如DOI:10.3969/j.i ssn.1005-652 1.2013.04.034，DOI:10.5897/AJMR11.1150，DOI:10.1016/j.carbpol.2018.02.027等科技论文，则采用高倍数去离子水稀释发酵液后离心去除菌体，再通过酸沉降和透析等方法进行三赞胶的提取和纯化。上述方法仅适合于实验室制备小量产品，无法实现工业化生产，不具备放大生产的应用价值，因此未被广泛应用。
综上所述，目前在产品提取过程中依然存在粘度及凝胶强度偏低，以及产品微生物数量难以控制等缺点。同时，现有技术中采用碱性物质回调一次分离后的纤维状物料，形成膏状物料并对该膏状物料进行烘干粉碎，该物料的pH调节过程对设备要求较高，需要大功率且效果好的搅拌设备，否则调节pH过程会形成不均匀物料影响产品质量。由于水分较高，对于烘干设备则同样要求较高，往往需要采用红外烘干，相对于常规烘干手段，该设备存在投入成本高，运行维护费用大等缺陷。
因此，仍需要对三赞胶的提取工艺进行进一步研究。
发明内容
针对现有技术的问题，本发明的目的是提供一种简便快捷、安全高效获得高凝胶强度和高粘度，同时耐盐性能更好的三赞胶产品的方法。
为了实现该目的，本发明的技术方案如下：
一种从发酵液中提取三赞胶的方法，所述方法先以中性可溶性盐处理所述发酵液后，再加入乙醇使体系中乙醇的浓度达到30-40％(v/v)，之后调整所述体系的pH至1.0-3.0，经分离操作后，将获得的粗品以乙醇浸泡，以获得乙醇浓度为72-85％(v/v)的物料体系，然后调整所述物料体系的pH至6.0-8.0，并保证所述物料体系中乙醇的浓度为70-82％(v/v)，再次分离。
本发明的发酵液指以微生物发酵形式产生的含有三赞胶的发酵液。
三赞胶经发酵后，溶液粘度会达到3000cp以上，除菌体外，发酵液中还会残留一定的残还原糖，无机离子，以及菌体生长过程中产生的各种代谢产物。为得到高性能，低菌落的三赞胶产品，本发明从产品性质及生产可行性等角度出发，先以中性可溶性盐(或其水溶液)处理发酵液，充分混合静置后，以乙醇(可采用50-100％浓度的乙醇溶液)调整发酵液中的可溶性三赞胶的浓度，并使体系中的乙醇保持在特定浓度，从而兼顾该体系中的水溶性和醇溶性杂质的充分溶出。之后通过调酸和沉降分离操作，使该部分杂质同菌体一起随乙醇溶液被去除，初步提高产品的三赞胶纯度。接下来，再次用乙醇(可采用无水乙醇和/或高浓度乙醇溶液)对分离后的剩余物料(粗纤维组分)进行浸泡，充分搅拌，调整物料体系在中性环境附近，并保持特定乙醇含量(不大幅下降)，从而既实现灭菌功能，又可在最后经第二次分离操作后，将残留的杂质和剩余菌体从产品中有效去除。该方式获得的三赞胶凝胶强度大、粘度高，且同时通过体系母液和乙醇的作用，克服了产品菌落总数偏高，生产过程烘干困难的缺点。
本发明中，所述中性可溶性盐为中性可溶性钠盐、钾盐或钙盐，优选为氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化亚铁和氯化镁；所述中性可溶性盐的添加量为0.1-1.0％(m/m)；
和/或，所述中性可溶性盐处理的时间为15-45min。
本发明以特定中性盐处理配合后续提纯步骤，可提升产品强度，促进产品溶液的微凝胶状态形成，提升产品悬浮性，且能兼顾粘度和强度。
优选，在以中性可溶性盐处理所述发酵液的步骤中，所述中性可溶性盐为氯化钾，添加量为0.4～0.9％；或者，所述中性可溶性盐为氯化钠，添加量为0.5～1.0％；或者，所述中性可溶性盐为氯化钙，添加量为0.3～0.7％；或者，所述中性可溶性盐为氯化亚铁，添加量为0.3～0.5％；或者，所述中性可溶性盐为氯化镁，添加量为0.3～0.5％。
上述中性可溶盐的添加，既有利的提高了产品的粘度和凝胶强度，同时有助于替换发酵液中由原料引入的未知和复杂金属离子，保证灰分指标不超出标准要求的范围。同时，上述可溶性中性盐是低价易得的产品，可保证较少增加生产成本，同时有效提高产品性能。
更优选，所述中性可溶性盐为无水氯化钙，添加量为0.5％(m/m)。
本发明中，在将获得的粗品以乙醇浸泡时，乙醇的加入量与粗品的体积质量比为(1-10)：1mL/g；优选为4.75:1mL/g。
和/或，浸泡的时间为15-45min。
本发明在粗品浸泡时，可采用无水乙醇和/或高浓度乙醇溶液，从而利于保证后续特定乙醇浓度的实现。
本发明中，中性可溶性盐处理后，所述体系的pH调整前，加入的乙醇的浓度为70-100％，优选为75-95％。
本发明中，调整所述体系的pH至1.0-3.0时，采用的是3-12mol/L的无机酸溶液，优选为6-9mol/L的盐酸或硫酸溶液，或者10-20％(m/V)的柠檬酸溶液。
本发明中，将获得的粗品以乙醇浸泡后，获得乙醇浓度为74-84％(v/v)的物料体系，然后调整pH后保证所述物料体系中乙醇的浓度为73-82％(v/v)，以保证产品综合性能的提高。优选，浸泡30min。
本发明中，调整所述物料体系的pH时(可通过流加高浓度的碱溶液)所用的碱为浓度为30-40％(m/V)的液态氢氧化钠和/或氢氧化钾，以保证尽可能少的影响产品浸泡过程的酒精浓度，从而保证杂质和杂菌的去除；优选调整所述物料体系的pH至7.5～8.0，以保证产品pH符合标准。
本发明中，在再次分离后还包括烘干的步骤，烘干的温度为55-105℃，烘干的时间为2-10h。
本发明还包括将两次分离后含乙醇的溶液进行蒸馏再次利用的步骤，所述蒸馏的温度40-60℃，真空度为-0.08～-0.10MPa。
本发明中，可采用旋转蒸发设备进行蒸馏。
本发明还提供一种三赞胶产品，其根据上述的方法制备得到。
作为一个具体实施结果，该产品1％水粘度可达1050-1193mPa·s，1％氯化钾粘度可达1895-2396mPa·s，凝胶强度可达74.1-215.57g/cm2。菌落总数低、盐溶性好、耐盐性优。
本发明的产品为符合标准规定的三赞胶粉末状成品，可直接或复配应用于乳品、饮料、肉制品等食品领域，具有极大的生产、应用价值。
本发明的有益效果至少在于：
本发明利用母液，乙醇，酸、碱、盐等特定手段的综合效应，制备得到的三赞胶产品兼具凝胶强度大、产品粘度高、产品合格率高、菌落总数低、白度稳定、生产成本低等优点。且实际生产中，有机溶剂完全可以通过工业吸收手段控制其挥发，并且可通过精馏进行回收，回收成本低、操作简便。回收后的有机溶剂可以进一步反复使用，进一步降低了生产成本，具备高度的生产可放大性。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明具体实施方式部分所用的发酵液是将工程菌株MH-10(CN111057711 A，其出发菌株Sphingomonassp.T-3，菌株保藏编号为CGMCC 10150)接种于含有碳源、氮源、必要的营养物质的培养基中进行通气搅拌发酵，获得的发酵产物。
发酵培养基为：葡萄糖40g/L，玉米浆7.34g/L，MgSO4·7H2O 3.98g/L，CaCO33.34g/L，K2HPO4·7H2O 0.9g/L，pH 7.0。
发酵条件为：
0-20h，风量0.4～0.6vvm，温度30±0.5℃，搅拌200-400rpm；
20-24h，风量0.8～1.0vvm，温度30±0.5℃，搅拌400-500rpm；
24-48h，风量1.0～1.1vvm，温度30±0.5℃，搅拌500-650rpm；
48-72h，风量1.1～0.8vvm，温度30±0.5℃，搅拌650-700rpm。
发酵周期72h。
实施例1
本实施例提供一种本发明的提取三赞胶产品的方法，包括以下步骤：
(1)向发酵液中加入折合发酵液0.9％(m/m)的氯化钠(以水溶液形式添加)，搅拌均匀后静置15min。
(2)在步骤(1)所获得的溶液中，加入浓度为70％(v/v)的乙醇溶液至原料液中酒精含量达到35±5％(v/v)。
(3)在步骤(2)所获得的溶液中加入6mol/L的硫酸溶液，搅拌同时测定物料pH至1.75，获得具有纤维物料的沉降液。
(4)分离沉降液，获得纤维状物料团块及母液。
(5)在步骤(4)获得的200g物料团块中，加入400mL 95％(v/v)的乙醇溶液，搅拌调节物料中乙醇浓度至76.8％(v/v)，浸泡30min。
(6)在上述步骤(5)所获得的物料中，加入40％(m/V)的NaOH溶液，调节物料pH至7.82，且乙醇浓度为75.9％(v/v)。
(7)分离上述物料，获得纤维状湿成品和母液。
(8)85℃，烘干时间6h。
(9)将上述两次分离得到的母液，采用旋转蒸发设备进行蒸馏，蒸馏温度45℃，真空度-0.08～-0.10MPa。冷却后的馏出液组分经测定乙醇含量为85.2％(v/v)，回收后可再次利用到三赞胶的提取中。
(10)粉碎烘干后的产品，过80目筛，获得筛下物为成品。
实施例2
本实施例提供一种本发明的提取三赞胶产品的方法，具体如下：
(1)向发酵液中加入折合发酵液0.7％(m/m)的氯化钾(以水溶液形式添加)，搅拌均匀后静置20min。
(2)在步骤(1)所获得的溶液中，加入浓度为85.2％(v/v)的乙醇溶液(由上述实施例1中第9步获得)至原料液中酒精含量达到35±5％(v/v)。
(3)在步骤(2)所获得的溶液中加入6mol/L的盐酸溶液，搅拌同时测定物料pH至1.58，获得具有纤维物料的沉降液。
(4)分离沉降液，获得纤维状物料团块及母液。
(5)在步骤(4)获得的200g物料团块中，加入900mL 85.2％(v/v)的乙醇溶液(上述实施例1中第9步获得)，搅拌调节物料中乙醇浓度至75.2％(v/v)，浸泡30min。
(6)在上述步骤(5)所获得的物料中，加入40％(m/V)的KOH溶液，调节物料pH至7.79，且乙醇浓度为74.8％(v/v)。
(7)分离上述物料，获得纤维状湿成品和母液。
(8)105℃，烘干时间4h。
(9)将上述两次分离得到的母液，采用实施例1中的方法进行蒸馏，获得回收液。
(10)粉碎烘干后的产品、筛分，获得80目筛下物成品。
实施例3
本实施例提供一种本发明的提取三赞胶产品的方法，具体如下：
(1)向发酵液中加入折合发酵液0.5％(m/m)的无水氯化钙(以水溶液形式添加)，搅拌均匀后静置15min。
(2)在步骤(1)所获得的溶液中，加入浓度为85.2％(v/v)的乙醇溶液(上述实施例1中第9步获得)至原料液中酒精含量达到35±5％(v/v)。
(3)在步骤(2)所获得的溶液中加入6mol/L的盐酸溶液，搅拌同时测定物料pH至1.88，获得具有纤维物料的沉降液。
(4)分离沉降液，获得纤维状物料团块及母液。
(5)在步骤(4)获得的200g物料团块中，加入950mL 85.2％(v/v)的乙醇溶液(上述实施例1中第9步获得)，搅拌调节物料中乙醇浓度至77.4％(v/v)，浸泡30min。
(6)在上述步骤(5)所获得的物料中，加入40％(m/V)的NaOH溶液，调节物料pH至7.68，且乙醇浓度为76.1％(v/v)。
(7)分离上述物料，获得纤维状湿成品和母液。
(8)75℃，烘干时间5h。
(9)将上述两次分离得到的母液，采用实施例1中的方法进行蒸馏，获得回收液。
(10)粉碎烘干后的产品、筛分，获得80目筛下物成品。
实施例4
本实施例提供一种本发明的提取三赞胶产品的方法，具体如下：
(1)向发酵液中加入折合发酵液0.4％(m/m)的氯化亚铁(以水溶液形式添加)，搅拌均匀后静置15min。
(2)在步骤(1)所获得的溶液中，加入浓度为85.2％(v/v)的乙醇溶液(上述实施例1中第9步获得)至原料液中酒精含量达到35±5％(v/v)。
(3)在步骤(2)所获得的溶液中加入20％(m/V)的柠檬酸溶液，搅拌同时测定物料pH至1.82，获得具有纤维物料的沉降液。
(4)分离沉降液，获得纤维状物料团块及母液。
(5)在步骤(4)获得的200g物料团块中，加入850mL 85.2％(v/v)的乙醇溶液(上述实施例1中第9步获得)，搅拌调节物料中乙醇浓度至75.2％(v/v)，浸泡30min。
(6)在上述步骤(5)所获得的物料中，加入40％(m/V)的NaOH溶液，调节物料pH至7.77，且乙醇浓度为74.9％(v/v)。
(7)分离上述物料，获得纤维状湿成品和母液。
(8)105℃，烘干时间4h。
(9)将上述两次分离得到的母液，采用实施例1中的方法进行蒸馏，获得回收液。
(10)粉碎烘干后的产品、筛分，获得80目筛下物成品。
实施例5
本实施例提供一种本发明的提取三赞胶产品的方法，具体如下：
(1)向发酵液中加入折合发酵液0.4％(m/m)的氯化镁(以水溶液形式添加)，搅拌均匀后静置15min。
(2)在步骤(1)所获得的溶液中，加入浓度为85.2％(v/v)的乙醇溶液(上述实施例1中第9步获得)至原料液中酒精含量达到35±5％(v/v)。
(3)在步骤(2)所获得的溶液中加入6mol/L的盐酸溶液，搅拌同时测定物料pH至1.93，获得具有纤维物料的沉降液。
(4)分离沉降液，获得纤维状物料团块及母液。
(5)在步骤(4)获得的200g物料团块中，加入1300mL 85.2％(v/v)的乙醇溶液(上述实施例1中第9步获得)，搅拌调节物料中乙醇浓度至74.8％(v/v)，浸泡30min。
(6)在上述步骤(5)所获得的物料中，加入40％(m/V)的KOH溶液，调节物料pH至7.98，且乙醇浓度为74.2％(v/v)。
(7)分离上述物料，获得纤维状湿成品和母液。
(8)105℃，烘干时间4h。
(9)将上述两次分离得到的母液，采用实施例1中的方法进行蒸馏，获得回收液。
(10)粉碎烘干后的产品、筛分，获得80目筛下物成品。
实施例6
本实施例提供一种本发明的提取三赞胶的方法，其与实施例3的方法一致，区别仅在于：步骤(5)为：在步骤(4)获得的200g物料团块中，加入900mL 85.2％(v/v)的乙醇溶液(上述实施例1中第9步获得)，以及95％(v/v)的乙醇溶液1100mL，搅拌调节物料中乙醇浓度至83.4％(v/v)，浸泡30min。步骤(6)为：在上述步骤(5)所获得的物料中，加入40％(m/V)的NaOH溶液，调节物料pH至7.78，且乙醇浓度为82％(v/v)。其余步骤与实施例3相同。
对比例1
本对比例提供一种三赞胶提取方法(参考CN1995326 B)，具体如下：
(1)将发酵液使用乙酸，调节至pH 4.80，然后加入0.9％(m/m)的氯化钠粉末，搅拌溶解后静置15min沉降。
(2)分离沉降液，获得纤维状物料团块。
(3)在步骤(2)获得的团块辅料中，缓慢加入碳酸钠粉末，并不断搅拌形成膏状物料，直至物料pH 7.39。
(4)105℃，烘干时间6h至物料干燥无发粘部分。
(5)粉碎筛分，获得80目筛下物成品。
对比例2
本对比例提供一种三赞胶提取方法(参考CN110079569 A)，具体如下：
(1)在发酵液中加入3.5g/L氢氧化钾(以溶液形式)，搅拌均匀。
(2)6mol/L的盐酸调节至pH 3.05，升温至80℃。
(3)分离沉降液，获得纤维状物料团块。
(4)在步骤3获得的团块辅料中，缓慢加入碳酸钠粉末，并不断搅拌形成均一的膏状物料，直至物料pH 7.09。
(5)105℃，烘干时间6h至物料干燥无发粘部分。
(6)粉碎筛分，获得80目筛下物成品。
对比例3
本对比例提供一种三赞胶提取方法(参考CN110760015 A)，具体如下：
(1)在发酵液中加入30％的过氧化氢溶液，加入量为发酵液的0.02％(m/m)，搅拌均匀后，将发酵液在水浴锅中升温至料温70℃。
(2)6mol/L的盐酸调节至pH 2.05。
(3)分离沉降液，获得纤维状物料团块。
(4)在步骤3获得的团块辅料中，缓慢加入碳酸钠粉末，并不断搅拌形成均一的膏状物料，直至物料pH 7.18。然后在膏状物料中加入0.5％(m/m)的氯化钠。
(5)在上述步骤4的物料中加入75％的乙醇溶液，加量为上述物料的0.5％(m/m)。整个实验过程中所有的实验工器具采用75％乙醇的消毒酒精棉擦拭干净。
(6)105℃，烘干时间6h至物料干燥无发粘部分。
(7)粉碎筛分，获得80目筛下物成品。
对比例4
本对比例提供一种三赞胶提取方法，具体如实施例3所述，区别仅在于：步骤(2)中加入乙醇溶液至原料液中酒精含量达到25±5％(v/v)。
对比例5
本对比例提供一种三赞胶提取方法，具体如实施例3所述，区别仅在于：步骤(6)中加入浓度为10％(m/V)的NaOH溶液，调节物料pH至7.89，此时乙醇浓度为68.8％(v/v)。产品无法形成易分离的纤维物料，故进一步添加95％(v/v)乙醇520mL，至溶液中酒精浓度达到76.8％(v/v)，然后进行后续操作。
对比例6
本对比例提供一种三赞胶提取方法，具体如实施例3所述，区别仅在于：步骤(1)中，向发酵液中加入折合发酵液0.2％(m/m)氯化钙(以水溶液形式添加)。
实验例
本实验例对上述各实施例和对比例中获得的成品(产品)，采用如下方法进行测定：
一、产品溶液粘度的测定(1％水溶液/1％KCl溶液)
1.仪器与设备
a)分析天平：精确至0.001g；
b)500mL玻璃量杯；
c)电动搅拌器；
d)Brookfield LV-DV II Pro粘度计(测定误差±5％，或其他同等性能粘度计)；
2.测定条件
a)转子型号：63号转子，如超出设备测量量程，则采用64号转子；
b)转速：60转/分钟；
c)温度：25±1℃；
3.检测方法及步骤
a)1％水溶液的制备：用洁净、干燥的称量纸准确称取3g试样(精确至0.001g)。量取297g蒸馏水(精确至0.001g)倒入搅拌杯中。开启搅拌器，转速1000转/分钟，将试样慢慢加入搅拌杯中，并开始计时搅拌1.5～3h，至样品溶解充分。停止搅拌，取出烧杯，用搅拌棒或其他类似物上下翻动溶液几次。
b)1％氯化钾溶液的制备：用洁净、干燥的称量纸准确称取3g试样及3gKCl粉末(分别精确至0.001g)。量取294g蒸馏水(精确至0.001g)倒入搅拌杯中。开启搅拌器，转速1000转/分钟，将事先充分混合的试样及KCl粉末慢慢加入搅拌杯中，并开始计时搅拌1.5～3h，至样品溶解充分。停止搅拌，取出烧杯，用搅拌棒或其他类似物上下翻动溶液几次。
c)在上述测定条件下分别测定并读出粘度值(3个平行样，取算术平均值)，即为水溶液和氯化钾溶液粘度。
二、产品凝胶强度测定
1.仪器与设备
a)分析天平：精确至0.001g；
b)高速搅拌器；
c)500mL玻璃烧杯；
d)恒温箱(温度范围：5℃～50℃)；
e)TA.XT Plus物性测定仪(质构仪)，英国StableMicroSystem；
f)水浴锅(控温范围：室温～100℃)。
2.测试条件
a)探头形状与尺寸：P/0.5柱形探头，接触面积126.68mm2。
b)探头测试移动速度：10mm/s。
3.检测方法及步骤
a)称取3g试样(精确至0.001g)，在转速800r/min搅拌的条件下慢慢加入到装有300mL蒸馏水的盛液杯中，搅拌15min。将试样溶液倒入烧杯中，置于95℃的水浴锅内加热，用玻璃棒间断搅拌3次，每次搅拌5～10下，加热30min后取出烧杯，去掉上层泡沫，趁热将胶溶液倾入平底容器，液面高度为4cm，静置，自然冷却至凝胶后，放入恒温箱中20℃静置20h，待测。
b)用物性测定(质构)仪测定3个平行样，取算术平均值。
三、产品菌落总数测定
菌落总数检测依照《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》(GB4789.2-2016)中记载的方法进行。3个平行样，取算术平均值。
四、产品耐盐性能测试
1.仪器与设备
a)分析天平：精确至0.001g；
b)高速搅拌器；
c)500mL玻璃烧杯；
d)恒温培养箱；
e)Brookfield LV-DV II Pro粘度计(测定误差±5％，或其他同等性能粘度计)；
2.测定条件
a)转子型号：63号转子；
b)转速：60转/分钟；
c)温度：25±1℃；
3.检测方法及步骤
a)称取1.5g试样及54g NaCl(分别精确至0.001g)混合均匀，在转速1000r/min搅拌的条件下慢慢加入到装有300mL蒸馏水的烧杯中，搅拌2h。停止搅拌，取出烧杯，用搅拌棒或其他类似物上下翻动溶液几次。
b)在上述测定条件下分别测定并读出初始粘度值。
c)上述溶液置于55℃培养箱中，每隔5天，取出，并按上述测定条件重新测定溶液粘度(3个平行样，取算术平均值)，观察时间20天。
与初始粘度相比，对比各测定时间的粘度下降比例。
五、灰分测试
1.仪器与设备
a)分析天平：精确至0.001g；
b)箱式电阻炉(马弗炉)；
c)瓷坩埚：50mL；
d)盐酸、硝酸或过氧化氢溶液；
2.检测方法及步骤
a)先把用1∶1的盐酸烧煮过的瓷坩埚洗净，置高温炉中升温至650℃左右，维持30min，稍冷后取出冷却，称重计为W0。
b)称取约3克样品于坩埚内(称完后将样品摊平)，记录样品质量计为W1。用电炉将样品炭化至无烟，移入650℃马弗炉中灰化3小时，如灰化不完全，可取出冷却后，加入数滴硝酸或过氧化氢等，蒸干后再移入高温炉中灰化至白色，移入干燥器内，冷至室温，称重计为W2。
3.计算
灰分(％)＝(W2-W0)/W1
W0:坩埚的质量，g
W1:样品的质量，g
W2:坩埚和样品灰化后的总质量，g
3个平行样，取算术平均值。平行样结果允许误差为0.2％，结果保留1位小数。
六、白度测定
1.仪器与设备
a)白度计(型号：WSB-3)；
2.检测方法及步骤
a)开机预热30分钟；
b)小心按下试样座滑筒压板，并将黑筒放在试样座上至刚好吻合，然后让滑筒缓缓升至测量孔口，稍等待显示值稳定后按调零键，使显示值自动归零(允差±0.1)；
c)将黑筒取下，将工作标准白板盖旋开，放上工作标准白板，待显示值稳定后，按校正键进行校正，使显示值与工作标准白板上的白度值一致(允差±0.1)；
d)将样品盛放在粉末器中，用表面光洁的玻璃板或刮片将样品表面用力压平，再继续将样品倒在粉末器中，再用力压平，重复此项操作2-3次，保证样品表面光滑平整；
e)将已压平的样品小心放在卡槽上，待屏幕上示数稳定后第一次读数，手将卡槽下压，转动样品粉末器进行第二次读数，重复上述操作一次，测定三次后按“平均”键，此时屏幕显示值为样品白度值，记录数据。
f)再次按“平均”键，退出“平均状态”，测量下一个样品。结果保留2位小数。
各测试结果见表1和表2。
表1各实例和对比例中所得产品的指标测定结果(AVE±SD)
Figure BDA0003067396570000171
Figure BDA0003067396570000181
注：粘度超出2000cp的实施例结果，为采用64#转子测定结果。
表2耐盐性测试数据(单位：mPa·s，AVE±SD)
Figure BDA0003067396570000182
从上述结果可以看出，本发明所获得的产品，在相同搅拌过程后，其溶液粘度稳定，变化很小，不会出现随时间延长而粘度过分增大的现象，说明产品的盐溶性非常好。同时，经过55℃，20d的高温货架期实验，产品粘度稳定性非常好，说明产品耐盐性能优越。
为验证本发明工艺的稳定性，对每个实施例进行了3次不同批次的重复实验，获得的结果是：实施例1-6各批次的实验结果均非常成功。具体表现是：产品菌落数稳定，不仅达到了规定的≤5000CFU/g的标准，同时比现有技术获得了菌落总数更低的产品，甚至达到了其它亲水胶体在国外标准中规定的≤2000CFU/g的水平。产品的水粘度和氯化钾粘度均表现出较高的水平，且凝胶强度均不同程度的优于现有技术。同时，产品的白度相对稳定(＞60)，且产品灰分符合相关标准，与现有技术产品相比，灰分略低或相当。这表明，虽然改进的提取工艺引入了金属盐离子，但在产品制备过程中，大量的杂质金属离子被通过母液的形式排除，而保留下来的主要为工艺引入的有效离子，这不仅保证了产品灰分，同时提高了产品的凝胶强度和粘度。实施例1-6的各批次，实验成品合格率达到了100％，可为产品的生产做出重要贡献。
同时，产品制备过程中的两次母液，经旋转蒸发浓缩，完全达到了回收利用的目的，生产可通过精馏塔的精馏回收，获得浓度更高的成品乙醇溶液，具有很高的生产实用性。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种从发酵液中提取三赞胶的方法，其特征在于，所述发酵液为以微生物发酵形式产生的含有三赞胶的发酵液，所述方法先以中性可溶性盐处理所述发酵液后，再加入浓度为70-100％的乙醇使体系中乙醇的浓度达到30-40％(v/v)，之后采用3-12mol/L的无机酸溶液或者10-20％(m/V)的柠檬酸溶液调整所述体系的pH至1.0-3.0，经分离操作后，将获得的纤维状物料团块以乙醇浸泡，以获得乙醇浓度为74-84％(v/v)的物料体系，然后以浓度为30-40％(m/V)的液态氢氧化钠和/或氢氧化钾调整所述物料体系的pH至6.0-8.0，并保证所述物料体系中乙醇的浓度为73-82％(v/v)，再次分离获得纤维状湿成品；
在以中性可溶性盐处理所述发酵液的步骤中，所述中性可溶性盐为氯化钾，添加量为0.4～0.9％；或者，所述中性可溶性盐为氯化钠，添加量为0.5～1.0％；或者，所述中性可溶性盐为氯化钙，添加量为0.3～0.7％；或者，所述中性可溶性盐为氯化亚铁，添加量为0.3～0.5％；或者，所述中性可溶性盐为氯化镁，添加量为0.3～0.5％。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述中性可溶性盐处理的时间为15-45min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在将获得的纤维状物料团块以乙醇浸泡时，乙醇的加入量与纤维状物料团块的体积质量比为(1-10)：1mL/g；
和/或，浸泡的时间为15-45min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，中性可溶性盐处理后，所述体系的pH调整前，加入的乙醇的浓度为75-95％。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，调整所述体系的pH至1.0-3.0时，采用的是6-9mol/L的盐酸或硫酸溶液。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将获得的纤维状物料团块以乙醇浸泡30min。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，调整所述物料体系的pH至7.5～8.0。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，在再次分离获得纤维状湿成品后还包括烘干的步骤，烘干的温度为55-105℃，烘干的时间为2-10h。
9.一种三赞胶产品，其特征在于，根据权利要求1-8任一项所述的方法制备得到。
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