CN110229771B - 菌株、其构建方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物基因工程领域，特别涉及菌株、其构建方法及应用。本发明以Xanthomonas campestris为出发菌株，利用基因工程技术失活了菌黄素合成途径的关键基因pigA，并导入了血红蛋白vgb基因，构建了一株黄原胶白色突变株(该菌株已委托中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏号为CGMCC No.14771)，能够产生白色黄原胶，其合成的黄原胶基本不含菌黄素，可减少未知突变对菌株造成的副作用，大量减少乙醇的使用量，节约资源及生产成本，具有广泛的工业应用价值。

Description

菌株、其构建方法及应用
技术领域
本发明涉及微生物基因工程领域，特别涉及菌株、其构建方法及应用。
背景技术
黄原胶(Xanthan)是由黄单胞菌属(Xanthomonas)产生的一种水溶性多糖高聚物，是国际上集增稠、悬浮、乳化、稳定于一体，性能最优越的生物胶，已广泛应用于食品、石油、地矿、医药、环境保护等行业。我国是黄原胶的主要产区，近几年全球对黄原胶的需求逐年上涨，我国黄原胶产量也一直呈现增长趋势。黄原胶的的全球销量从2011年的8.4万吨，上升到2015年的18.2万吨。食品加工和石油钻井、开采仍然会是国内外最主要的黄原胶消费领域。
黄原胶无味、无毒、食用安全，性质优良，被广泛的应用于食品领域，黄原胶在食品加工上应用时需要一定的白度。黄原胶合成的同时伴有菌黄素(Xanthomonadins)的产生，菌黄素是一种不溶于水的黄色素，附着于细胞膜外膜上，使菌落和产生的黄原胶呈黄色。工业生产上使用乙醇从发酵液中提黄原胶，菌黄素易溶于有机溶剂，但要达到食品行业应用的标准需要用大量乙醇对黄原胶进行脱色。另外一种解决黄原胶色素问题的方法是对野油菜黄单胞菌进行诱变，筛选无色黄原胶产生突变株。但是传统诱变产生的白色黄原胶生产菌，虽然产生的黄原胶是白色的，但菌株中潜在的未知的随机突变，对菌株生长及产物合成都有一定的副作用。而使用大量酒精脱色会造成酒精的浪费，且增加生产成本。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了菌株、其构建方法及应用。本发明利用基因工程技术敲除野油菜黄单胞菌的菌黄素合成关键基因，构建白色黄原胶工程菌株，其合成的黄原胶基本不含菌黄素，可减少未知突变对菌株造成的副作用，大量减少乙醇的使用量，节约资源及生产成本。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了野油菜黄单胞菌，敲除了pigA基因并具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
Ⅰ、具有SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列；
Ⅱ、具有SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
III、与SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
IV、如Ⅰ、Ⅱ或III所示序列的互补序列。
在本发明的一些具体实施方案中，对核苷酸序列的修饰包括成倍扩增。
在本发明的一些具体实施方案中，对核苷酸序列的取代为取代1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个碱基。
在本发明的一些具体实施方案中，核苷酸序列的缺失为缺失1个、2个、3个、4个、、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个碱基。
在本发明的一些具体实施方案中，对核苷酸序列的添加为添加1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个碱基。
在本发明的一些具体实施方案中，提供的野油菜黄单胞菌与SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列具有至少85％同源性的序列。
在本发明的一些具体实施方案中，提供的野油菜黄单胞菌与SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列具有至少90％同源性的序列。
在本发明的一些具体实施方案中，提供的野油菜黄单胞菌与SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的序列。
在本发明的一些具体实施方案中，提供的野油菜黄单胞菌与SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列具有至少97％同源性的序列。
在本发明的一些具体实施方案中，提供的野油菜黄单胞菌与SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列具有至少98％同源性的序列。
本发明提供了野油菜黄单胞菌的构建方法，包括如下步骤：
步骤1：扩增获得pigA上下游同源臂基因，通过overlap PCR将pigA基因的上下游同源臂连接，以自杀质粒pLO3为骨架，向质粒上的多克隆位点插入pigA基因的上下游同源臂片段，构建获得菌黄素合成关键基因pigA基因的敲除质粒pLO3-pigA；
步骤2：将敲除质粒pLO3-pigA转化至E.coliS17菌株，获得转化子，得到重组菌株E.coliS17/pLO3-pigA；
步骤3：将所述重组菌株E.coliS17/pLO3-pigA接合转移至野生型野油菜黄单胞菌，Cmr、Tetr双抗平板筛选单交换菌株，蔗糖致死筛选获得缺失pigA基因的双交换菌株△pigA。
本发明还提供了构建方法获得的野油菜黄单胞菌。
本发明提供了野油菜黄单胞菌，在本发明提供的野油菜黄单胞菌中添加vgb基因，并具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
Ⅰ、具有SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列；
Ⅱ、具有SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
III、与SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
IV、如Ⅰ、Ⅱ或III所示序列的互补序列。
在本发明的一些具体实施方案中，对核苷酸序列的修饰包括成倍扩增。
在本发明的一些具体实施方案中，对核苷酸序列的取代为取代1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个碱基。
在本发明的一些具体实施方案中，核苷酸序列的缺失为缺失1个、2个、3个、4个、、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个碱基。
在本发明的一些具体实施方案中，对核苷酸序列的添加为添加1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个碱基。
在本发明的一些具体实施方案中，对核苷酸序列的成倍扩增为扩增1倍～20倍
在本发明的一些具体实施方案中，提供的野油菜黄单胞菌与SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列具有至少85％同源性的序列。
在本发明的一些具体实施方案中，提供的野油菜黄单胞菌与SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列具有至少90％同源性的序列。
在本发明的一些具体实施方案中，提供的野油菜黄单胞菌与SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的序列。
在本发明的一些具体实施方案中，提供的野油菜黄单胞菌与SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列具有至少97％同源性的序列。
在本发明的一些具体实施方案中，提供的野油菜黄单胞菌与SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列具有至少98％同源性的序列。
本发明还提供了野油菜黄单胞菌的构建方法，包括如下步骤：
步骤1：扩增获得pigA上下游同源臂基因，从pBBR-vgb质粒上扩增获得vgb基因，通过overlap PCR将pigA基因的上下游同源臂及vgb基因连接，获得重组片段；所述重组片段为pigA上游同源臂-vgb基因-pigA下游同源臂；向pLO3质粒的多克隆位点处插入重组片段，构建获得pigA基因敲除及添加vgb基因的重组质粒pLO3-vgb；
步骤2：将所述重组质粒pLO3-vgb转化至E.coliS17菌株，获得正确的转化子，得到重组菌株E.coliS17/pLO3-vgb；
步骤3：将所述重组菌株E.coliS17/pLO3-vgb接合转移至野生型野油菜黄单胞菌，Cmr、tetr双抗平板筛选单交换菌株，蔗糖致死筛选获得双交换重组子—pigA基因敲除及添加vgb基因的△pigA/vgb菌株。
本发明还提供了上述构建方法获得的野油菜黄单胞菌。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的野油菜黄单胞菌的保藏编号为CGMCC No.14771。
本发明还提供了上述野油菜黄单胞菌在生产白色黄原胶中的应用。
本发明还提供了一种生产白色黄原胶的方法，将本发明提供的野油菜黄单胞菌接种于培养基中发酵培养，收集发酵液。
在本发明的一些具体实施方案中，所述发酵培养的转速为200～230rpm，温度为28～30℃，时间为20～72h。
在本发明的一些具体实施方案中，包括如下步骤：
步骤1：挑取本发明提供的野油菜黄单胞菌单菌落接种到种子培养基，于200rpm、30℃培养20h，获得一级种子培养液；
步骤2：将所述一级种子培养液以1％(v/v)的接种量接种到种子培养基中，于200rpm、30℃培养20h，获得二级种子培养液；
步骤3：将所述二级种子培养液以以10％(v/v)的接种量接种到种子培养基中，于230rpm、28℃培养72h，收集发酵液。
在本发明的一些具体实施方案中，种子培养基(g/L)包括：蔗糖，20g；蛋白胨，3g；酵母粉，1g；牛肉膏，5g；pH 7.0±0.02。发酵培养基(g/L)：玉米淀粉，50g；鱼蛋白胨，4g；碳酸钙，4g。
本发明以Xanthomonas campestris MHZ-20000(公司内部编号)为出发菌株，利用基因工程技术失活了菌黄素合成途径的关键基因pigA，并导入了血红蛋白vgb基因，构建了一株黄原胶白色突变株Xanthomonas campestris MHZ-20001-2(公司内部编号，该菌株已委托中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏号为CGMCCNo.14771)，能够产生白色黄原胶，其合成的黄原胶基本不含菌黄素，可减少未知突变对菌株造成的副作用，大量减少乙醇的使用量，节约资源及生产成本，具有广泛的工业应用价值。
生物保藏说明
生物材料：MHZ-20001-2；分类命名：野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)；于2017年09月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号为CGMCCNo.14771。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示pigA基因上下游同源臂和vgb基因PCR扩增产物电泳图；其中，M为DNAMarker DL2000，泳道1为pigA上游同源臂PCR产物，泳道2为vgb基因PCR产物，泳道3为pigA下游同源臂PCR产物；
图2示pigA上下游同源臂及vgb基因overlap PCR扩增产物电泳图；其中，M为DNAMarker DL15000，泳道1为重组DNA片段；
图3示pigA基因敲除、vgb敲入的原理图；
图4示MHZ-20001-2双交换验证；其中，M为DNA Marker DL2000，泳道1为MHZ-20001-2，泳道2和3为MHZ-20000；
图5示MHZ-20000(左)和MHZ-20001-2(右)在平板上的生长状况；
图6示MHZ-20000(左)和MHZ-20001-2(右)在摇瓶中的生长状况；
图7示CO差异色谱验证vgb基因的表达产物VHB；
图8示GPC测定合成的黄原胶的分子量；其中，图8(A)示MHZ-20000；图8(B)示MHZ-20001-2；
图9示流变仪测定黄原胶的流变性能：其中，图9(A)示MHZ-20000和MHZ-20001-1合成的黄原胶的流变特性，其中，
Figure BDA0001589173200000061
代表MHZ-20000，
Figure BDA0001589173200000062
代表MHZ-20001-1；图9(B)示MHZ-20000和MHZ-20001-2合成的黄原胶的流变特性，其中，
Figure BDA0001589173200000071
(黑色)代表MHZ-20000，
Figure BDA0001589173200000072
(黑色)代表MHZ-20001-2；
图10示红外光谱技术对黄原胶进行定性；其中，野生型为MHZ-20000，改造型为MHZ-20001-2。
具体实施方式
本发明公开了菌株、其构建方法及应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明以Xanthomonas campestrisMHZ-20000(公司内部编号)为出发菌株，利用基因工程技术失活了菌黄素合成途径的关键基因pigA，并导入了血红蛋白vgb基因，构建了一株黄原胶白色突变株Xanthomonas campestris MHZ-20001-2(公司内部编号，该菌株已委托中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏号为CGMCCNo.14771)，能够产生白色黄原胶，具有广泛的工业应用价值。
因此，本发明的第一个目的在于提供一种白色黄原胶基因工程生产菌的构建方法。
白色黄原胶基因工程生产菌的构建方法，包括以下步骤：
(1)从MHZ-20000基因组上扩增pigA上下游同源臂基因，通过overlap PCR将pigA基因的上下游同源臂连接，以自杀质粒pLO3为骨架，向质粒上的多克隆位点插入pigA基因的上下游同源臂片段，构建菌黄素合成关键基因pigA基因的敲除质粒pLO3-pigA；
(2)将重组质粒pLO3-pigA转化至E.coliS17菌株，筛选正确的转化子，得到重组菌株E.coliS17/pLO3-pigA；
(3)将重组菌株E.coliS17/pLO3-pigA接合转移至MHZ-20000，Cmr、Tetr双抗平板筛选单交换菌株，蔗糖致死筛选缺失pigA基因的双交换菌株△pigA，命名为MHZ-20001-1；
(4)将MHZ-20000和MHZ-20001-1在相同条件下发酵。
(5)测定MHZ-20000和MHZ-20001-1两株菌所产黄原胶的产量、发酵液黏度、流变特性、及相同乙醇量提取所得产品的白度。测得MHZ-20000和MHZ-20001-1所合成的黄原胶流变特性基本相同，且相同乙醇量提取的黄原胶样品，二者白度有明显差异。但MHZ-20001-1的发酵产量略低于MHZ-20000，发酵液粘度与MHZ-20000基本相同。野油菜黄单胞菌为好氧菌，将透明颤菌血红蛋白基因vgb导入MHZ-20001-1能增加其产量及发酵液黏度。
(6)从MHZ-20000基因组上扩增pigA上下游同源臂基因，从pBBR-vgb质粒上扩增vgb基因，通过overlap PCR将pigA基因的上下游同源臂及vgb基因连接，vgb基因位于中间位置，向pLO3质粒的多克隆位点处插入重组的三片段，构建pigA基因敲除及添加vgb基因质粒pLO3-vgb；
(7)按上述步骤(2)和步骤(3)构建△pigA/vgb菌株，命名为MHZ-20001-2；
(8)CO差异色谱测定vgb基因的表达，血红蛋白VHb和CO结合在420nm处出现特征吸收峰，CO差异色谱显示MHZ-20001-2在420nm有显著的吸收峰，而MHZ-20000在420nm处没有吸收峰。这个结果显示了基因工程菌株中合成的血红蛋白VHb有生物活性。
将MHZ-20000、MHZ-20001-2按步骤(4)的方法发酵，并检测两株菌分别在低溶氧、中溶氧、高溶氧条件下的产量及发酵液黏度，测定两株菌所产黄原胶的产量、分子量、流变特性、及提取所用的乙醇量。
本发明的第二个目的，根据如上所述的方法构建获得一株白色黄原胶基因工程生产菌MHZ-20001-2。
本发明的第三个目的，通过发酵如上所述白色黄原胶基因工程菌，提供一种白色黄原胶生产方法。
本发明以Xanthomonas campestrisMHZ-20000(公司内部编号)为出发菌株，利用基因工程技术失活了菌黄素合成途径的关键基因pigA，并导入了血红蛋白vgb基因，构建了一株黄原胶白色突变株Xanthomonas campestris MHZ-20001-2(公司内部编号，该菌株已委托中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏号为CGMCCNo.14771)，能够产生白色黄原胶，具有广泛的工业应用价值。
MP1719697
本发明利用基因工程技术敲除野油菜黄单胞菌的菌黄素合成关键基因，构建白色黄原胶工程菌株，其合成的黄原胶基本不含菌黄素，可减少未知突变对菌株造成的副作用，大量减少乙醇的使用量，节约资源及生产成本。
本发明提供的菌株、其构建方法及应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
以下实施例中使用的引物序列信息如表1所示
表1、引物序列信息
Figure BDA0001589173200000091
Figure BDA0001589173200000101
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：敲除质粒pLO3-pigA的构建：
使用提取试剂盒提取MHZ-20000的基因组，pigA的上下游同源臂以MHZ-20000基因组为模板，分别使用引物pigA-1SF/pigA-1SR和pigA-1XF/pigA–1XR及PrimeSTAR DNA聚合酶(TakaraBio,Tokyo,Japan)扩增。通过overlap PCR将上下游DNA片段连接，将产物通过电泳检测，并将目的基因条带通过胶回收试剂盒进行纯化回收，获得重组片段。将重组片段及pLO3质粒同时使用限制性酶SacI和XbaI进行酶切，37℃，90min，将酶切后的片段使用试剂盒进行PCR纯化回收，将两者的回收产物用T4DNA连接酶于16℃过夜连接，得到重组质粒pLO3-pigA，并将重组质粒转入E.coli S17感受态细胞中进行重组质粒的扩增，挑取测序正确的单菌落进行甘油保存。
实施例2：敲除质粒pLO3-vgb的构建：
vgb基因来源于本实验室保存的E.coli S17/pBBR-vgb,使用提取试剂盒提取pBBR-vgb质粒，以该质粒为模板PCR,使用引物Pvgb-F/Pvgb-R及PrimeSTAR DNA聚合酶扩增vgb基因，将产物通过电泳检测，并将目的基因条带通过胶回收试剂盒进行纯化回收，获得目的基因vgb。使用提取试剂盒提取MHZ-20000的基因组，pigA的上下游同源臂以MHZ-20000基因组为模板，分别使用引物pigA-2SF/pigA-2SR和pigA-2XF/pigA–2XR及PrimeSTARDNA聚合酶扩增。通过overlap PCR将上下游DNA片段及vgb基因连接，连接方式为pigA上游同源臂-vgb基因-pigA下游同源臂，将产物通过电泳检测，并将目的基因条带通过胶回收试剂盒进行纯化回收，获得重组的三片段。将三片段及pLO3质粒同时使用限制性酶SacI和XbaI进行酶切，37℃，90min，将酶切后的片段使用试剂盒进行PCR纯化回收，将两者的回收产物用T4DNA连接酶于16℃过夜连接，得到重组质粒pLO3-vgb，并将重组质粒转入E.coli S17感受态细胞中进行重组质粒的扩增，挑取测序正确的单菌落进行甘油保存。
实施例3：白色黄原胶突变基因工程菌株的构建：
在平板培养基挑MHZ-20000单菌落接种至含Cmr的5ml种子培养基，30℃恒温摇床中200rpm培养14h，挑取E.coli s17/pLO3-vgb的单菌落至含有tetr的LB液体培养基中，于37℃恒温摇床中200rpm培养8h，两株菌各取5ml6000rpm离心5min收集菌体，用10mmol/L的MgSO4溶液洗涤两次，离心，再用200ul的MgSO4溶液重悬菌体，将MHZ-20000和E.coli s17/pLO3-vgb按照2:1的比例混匀后抽滤至孔径放置在0.22μm的滤膜上，将菌体朝上的滤膜置于无抗性平板上，于30℃恒温培养箱中培养12h进行接合转移。用200μlMgSO4溶液洗涤滤膜上的菌体，梯度稀释后涂布于含有Cmr和tetr的双抗平板上，于30℃恒温培养箱中培养72h。pLO3为自杀载体，在MHZ-20000中无法复制，当pLO3-vgb接合转移至MHZ-20000后，其会通过上游同源臂或下游同源臂交换整合入基因组。在双抗平板上挑取单菌落至5ml含双抗的种子液体培养基中，30℃恒温摇床中200rpm培养16h。使用引物为pigA 1F/pigA1R进行菌落PCR验证单交换重组子，PCR产物琼脂糖凝胶电泳，观察是否具有目的条带。双交换重组子的筛选，将单交换重组子接种于无抗性的5ml种子培养基中，30℃恒温摇床中200rpm培养16h，传代两次，然后将其涂布至10％蔗糖平板上于30℃恒温培养箱中培养72h。挑取单菌落至5ml试管中，30℃，200rpm培养16h，使用引物pigA2F/pigA2R进行菌落PCR验证，确定正确的双交换重组子，命名为MHZ-20001-2。
实施例4.CO差异色谱：
将MHZ-20000和MHZ-20001-2挑单菌至液体培养基，30℃、200rpm培养16h，4℃，8000rpm离心5min，收集菌体细胞，用0.1M磷酸缓冲液洗涤三次。然后，将细胞重新悬浮在4ml磷酸缓冲液中，并在冰上进行超声波破碎。4℃，12000rpm，离心15min，弃沉淀，保留上清。向上清液中加入过量连二亚硫酸钠母液，使其终浓度为2.5mg/ml，震荡，充分混匀，将样品分成两等份，一份用CO鼓泡3分钟(约3-4气泡/s)，另一份用空气鼓泡。然后使用Bio-drop分光光度计扫描样品400-500nm范围内的光吸收值。
实施例5.发酵：
挑单菌落接种到5ml种子培养基，200rpm、30℃培养20h，然后以1％的接种量接种到100ml的种子培养基中，在200rpm、30℃培养20h，然后以10％的接种量接种到100/500ml摇瓶中，28℃、230rpm条件下培养72h。
种子培养基(g/L)：蔗糖，20g；蛋白胨，3g；酵母粉，1g；牛肉膏，5g；pH 7.0±0.02。发酵培养基(g/L)：玉米淀粉，50g；鱼蛋白胨，4g；碳酸钙，4g。
不同溶氧条件的发酵：方法和上述发酵方法相同，通过改变相同摇瓶内发酵液的装液量来改善溶氧，其中低溶氧装液量为180/500ml摇瓶，中等溶氧条件装液量为135/500ml摇瓶，高溶氧装液量为90/500ml摇瓶。
实施例6.黄原胶产量的测定：
向发酵液中加入三倍体积的乙醇(v/v)，将黄原胶沉淀，过滤，将沉淀放入烘箱90℃干燥6h，精密天平称重，产量计算按照每100g发酵液产生的黄原胶质量。
实施例7.发酵液黏度的测定：
取适量发酵液，在室温下使用布氏粘度计LV-DV_II+测定，使用64号转子，转速为60rpm，每次测定重复三次。
实施例8.黄原胶分子量的测量：
黄原胶的分子量测定使用凝胶渗透色谱(GPC)进行测定，流动相为超纯水，流速为0.3ml/min，柱温为50℃。将黄原胶溶于超纯水中(1mg/ml)，用0.22mm的滤器过滤，进样。
实施例9.黄原胶流变特性的评估：
黄原胶的流变特性通过TA流变仪进行测定，将黄原胶溶于超纯水中(10mg/ml)，检测条件为25℃，剪切速率范围为0.001s-1-1000s-1。
实施例10.黄原胶白度的测量：
黄原胶白度的测量使用荧光白度计，将待测样品放入测量盒里，压实，把表面刮平，放入仪器测量。
实施例11.黄原胶红外定性：
使用红外光谱仪对黄原胶样品进行定性分析。
表2.MHZ-20000、MHZ-20001-1和MHZ-20001-2产量及发酵液黏度的比较
MHZ-20000 MHZ-20001-1 MHZ-20001-2
产量(g/100g) 3.28±0.08 3.12<sup>**</sup>±0.05 3.37<sup>*</sup>±0.07
发酵液黏度/cp 5039±47 5009±25 5087±31
注：*示与野生型MHZ-20000相比，具有显著差异(P＜0.05)；
**示与野生型MHZ-20000相比，具有极显著差异(P＜0.01)。
表3.MHZ-20001-2和MHZ-20000在低溶氧、中溶氧、高溶氧下的产量(g/100g)
低溶氧产量 中溶氧产量 高溶氧产量
MHZ-20000 2.12±0.04 3.20±0.01 3.28±0.04
MHZ-20001-2 2.56<sup>**</sup>±0.05 3.40±0.04 3.52<sup>**</sup>±0.06
提高量 20％ 6.8％ 7.3％
注：*示与野生型MHZ-20000相比，具有显著差异(P＜0.05)；
**示与野生型MHZ-20000相比，具有极显著差异(P＜0.01)。
表4.MHZ-20001-2和MHZ-20000提取时所使用乙醇的量及产品白度对比
Figure BDA0001589173200000131
Figure BDA0001589173200000141
注：*示与野生型MHZ-20000相比，具有显著差异(P＜0.05)；
**示与野生型MHZ-20000相比，具有极显著差异(P＜0.01)。
由表2知MHZ-20001-1和MHZ-20000所合成黄原胶的产量有显著差异、发酵液黏度基本相同；而MHZ-20001-2所合成的黄原胶产量则有明显提升；在低溶氧条件下MHZ-20001-2菌株黄原胶产量明显高于野生型(表3)；使用相同体积的乙醇提取时，MHZ-20000的白度为36.77±2.14，MHZ-20001-2的白度为63.69±1.83，白度提高了73.2％；而提取相同的白度的黄原胶，MHZ-20001-2所用乙醇量为3倍发酵液体积，MHZ-20000使用7倍发酵液体积，乙醇使用量降低了133.3％，工程菌株可以节约乙醇的使用量，降低黄原胶生产成本(表4)。
综上所述，本发明所构建的白色黄原胶工程菌MHZ-20001-2能够实现白色黄原胶的生产，菌株具有广泛的工业应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 廊坊梅花生物技术开发有限公司
<120> 菌株、其构建方法及应用
<130> MP1719697
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
gctctagacg gtgacacctt gcacagagac 30
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
caaccgcgtt tcacgatcgg cagcttcgac ccggtattc 39
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
gaataccggg tcgaagctgc cgatcgtgaa acgcggttg 39
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
cgagctcacc tcatcgccca gatacacc 28
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
gctctagacg gtgacacctt gcacagagac 30
<210> 6
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
acccagcttt tgttcccttt aggcagcttc gacccggtat tc 42
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
gctcaagcgg ttgaataact ccgatcgtga aacgcggttg 40
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
cgagctcacc tcatcgccca gatacacc 28
<210> 9
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
gaataccggg tcgaagctgc ctaaagggaa caaaagctgg gt 42
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
caaccgcgtt tcacgatcgg agttattcaa ccgcttgagc 40
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
cggtgacacc ttgcacagag ac 22
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
gcagcttcga cccggtattc 20
<210> 13
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 13
gtcccgcgcc tgctgct 17
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 14
gcttgcattg acgctcatcc 20
<210> 15
<211> 2115
<212> DNA
<213> ΔPigA
<400> 15
cggtgacacc ttgcacagag acgctccatg accgcgccaa cgctccagcc caaccagacc 60
gtgcggcatc cgcgcctgca ggtcgactat gtcgcgcaga ccgatccctc cacgctgctg 120
caggatgcgc aggtgctggc ggtgttcggt ttcggcgatg ccgcgccgcg gctggacgac 180
ccacgctatt tgcgcgtgcc actgcagccg tacgcggccg atgtgctgga agtctggcgc 240
accgacgcac cggtgcgcag cggccgcgac ggcaacattg cctggtccag cgacggccgc 300
ctgcagttcg gcgtgatcga gatcgacgag caggaggtcg agatcgaaga agccgccgcc 360
aaggcgtatg cggagatcac cgcgttcgtc tccggcagcc agaccccgcg cctgttgcgc 420
atctggaatt acctggatgc gatcacgctg ggcagcggcg accgcgaacg ctatcggcag 480
ttctgcgtgg gccgtgcgcg cggcctgggc gccttcgatg ttgcgcagtt gcccgccgcc 540
actgccgtgg gccgctgcga tgccgagcgc atcatccaga tctactggct ggccgcggcg 600
gatgccggca cgccgctgga aaatccacgc caggtcagcg cttacaacta cccgcgccag 660
tacggcccgc agccgccaag ttttgcccgc gcgatgctgc caccggccgg cggcgacatg 720
ccgctgctgc tctcgggcac cgctgcagtg gttggccacg cctccatgca caccgggcag 780
ctgctcgcgc agctggaaga aaccttcgcc aatttcgacg ccctgctcgg cgccgcgcgc 840
cagcacgcac ccggcctgcc ggcgcagttc ggcgccggca cccgcctgaa ggtctacgtg 900
cgcgaacgcg acgatctacc caaggtggct caggccctgg acgcacgctt cggcgacgcg 960
gtcccgcgcc tgctgctaca cgcggtgatc tgccgcgacg aactggcagt ggaaatcgac 1020
ggcgtgcacg gctgagtcat ggcgcgcact ggctgatgca cgtggtggcc tgcgcggcag 1080
cacgcgcaga cgcctcagct actgagcaac cccaacacca gatcgcgcgg gagcttgccg 1140
gtttcgttgc gtggcagggc ggcgagcttg cgcaggcggc gcggcaggaa taccgggtcg 1200
aagctgccga tcgtgaaacg cggttgatcg ccacaatttc cggcacgcgc gcttgtctca 1260
atcgcggccg cctcgcacga caacgcagtc cgccgtgtag ctctagtcca gcctgcttca 1320
atcacagcaa tcaccaccga tgacccgcgc acagacgcca tcacgcatga cctgtggccc 1380
agccccgtgc ggaaacgaac tgctaggctt gcccgctctt cttgcgtttc gatcctgtcc 1440
gatgcccaga ttgttgccgt tgtccctcct gttgctggcc gccactgcgc aggcgcagtc 1500
caccgcaccg ctcaccatcg aacaggtgat ggccgacccg gactggatcg ggccgtcggt 1560
cgagcaggcc tggtggcaat gggacggcaa gcaggtgcag taccagctca agcgcgaagg 1620
cagcccggtg cgcgatacct atcgccagcc tgcagcgggc ggcaccgccg ccgagcgtgt 1680
ggccgacacc gcgcgtgcgg ggctggatgc cgccaacccg agctacgacg ccggccggca 1740
acgcatgctg tttacgcgca acggtgacat cttcctgcgc gatctgcgct ccggggcgct 1800
gacccagctg acccgcagca acgaggtcga atcgcgcccg caatttgcca gcgatggcgg 1860
tgcgatctgg cgcgcgggca acaactggta ccactggcgt gccgatggcg gtaccgcgca 1920
ggtggcagtg gtgaaggccg agcgcgatcc caacgccgcg cccaaggccg atgtgctgcg 1980
cgagcagcaa ctggccaccc tggccacctt gcgccgcgac cgcgagcaac gcgaggcgct 2040
gcgcacccag gacgatgcct ggcgccgcgc cgacagcacc cgcgcaccgg caccggtgta 2100
tctgggcgat gaggt 2115
<210> 16
<211> 2652
<212> DNA
<213> ΔpigA-vgb
<400> 16
cggtgacacc ttgcacagag acgctccatg accgcgccaa cgctccagcc caaccagacc 60
gtgcggcatc cgcgcctgca ggtcgactat gtcgcgcaga ccgatccctc cacgctgctg 120
caggatgcgc aggtgctggc ggtgttcggt ttcggcgatg ccgcgccgcg gctggacgac 180
ccacgctatt tgcgcgtgcc actgcagccg tacgcggccg atgtgctgga agtctggcgc 240
accgacgcac cggtgcgcag cggccgcgac ggcaacattg cctggtccag cgacggccgc 300
ctgcagttcg gcgtgatcga gatcgacgag caggaggtcg agatcgaaga agccgccgcc 360
aaggcgtatg cggagatcac cgcgttcgtc tccggcagcc agaccccgcg cctgttgcgc 420
atctggaatt acctggatgc gatcacgctg ggcagcggcg accgcgaacg ctatcggcag 480
ttctgcgtgg gccgtgcgcg cggcctgggc gccttcgatg ttgcgcagtt gcccgccgcc 540
actgccgtgg gccgctgcga tgccgagcgc atcatccaga tctactggct ggccgcggcg 600
gatgccggca cgccgctgga aaatccacgc caggtcagcg cttacaacta cccgcgccag 660
tacggcccgc agccgccaag ttttgcccgc gcgatgctgc caccggccgg cggcgacatg 720
ccgctgctgc tctcgggcac cgctgcagtg gttggccacg cctccatgca caccgggcag 780
ctgctcgcgc agctggaaga aaccttcgcc aatttcgacg ccctgctcgg cgccgcgcgc 840
cagcacgcac ccggcctgcc ggcgcagttc ggcgccggca cccgcctgaa ggtctacgtg 900
cgcgaacgcg acgatctacc caaggtggct caggccctgg acgcacgctt cggcgacgcg 960
gtcccgcgcc tgctgctaca cgcggtgatc tgccgcgacg aactggcagt ggaaatcgac 1020
ggcgtgcacg gctgagtcat ggcgcgcact ggctgatgca cgtggtggcc tgcgcggcag 1080
cacgcgcaga cgcctcagct actgagcaac cccaacacca gatcgcgcgg gagcttgccg 1140
gtttcgttgc gtggcagggc ggcgagcttg cgcaggcggc gcggcaggaa taccgggtcg 1200
aagctgccta aagggaacaa aagctgggta ccgagctgtt gacaattaat catcggctcg 1260
tataatgtgt ggaagttcac gtcactaagg agaataccat atgttagacc agcaaaccat 1320
taacatcatc aaagccactg ttcctgtatt gaaggagcat ggcgttacca ttaccacgac 1380
tttttataaa aacttgtttg ccaaacaccc tgaagtacgt cctttgtttg atatgggtcg 1440
ccaagaatct ttggagcagc ctaaggcttt ggcgatgacg gtattggcgg cagcgcaaaa 1500
cattgaaaat ttgccagcta ttttgcctgc ggtcaaaaaa attgcagtca aacattgtca 1560
agcaggcgtg gcagcagcgc attatccgat tgtcggtcaa gaattgttgg gtgcgattaa 1620
agaagtattg ggcgatgccg caaccgatga cattttggac gcgtggggca aggcttatgg 1680
cgtgattgca gatgtgttta ttcaagtgga agcagatttg tacgctcaag cggttgaata 1740
actccgatcg tgaaacgcgg ttgatcgcca caatttccgg cacgcgcgct tgtctcaatc 1800
gcggccgcct cgcacgacaa cgcagtccgc cgtgtagctc tagtccagcc tgcttcaatc 1860
acagcaatca ccaccgatga cccgcgcaca gacgccatca cgcatgacct gtggcccagc 1920
cccgtgcgga aacgaactgc taggcttgcc cgctcttctt gcgtttcgat cctgtccgat 1980
gcccagattg ttgccgttgt ccctcctgtt gctggccgcc actgcgcagg cgcagtccac 2040
cgcaccgctc accatcgaac aggtgatggc cgacccggac tggatcgggc cgtcggtcga 2100
gcaggcctgg tggcaatggg acggcaagca ggtgcagtac cagctcaagc gcgaaggcag 2160
cccggtgcgc gatacctatc gccagcctgc agcgggcggc accgccgccg agcgtgtggc 2220
cgacaccgcg cgtgcggggc tggatgccgc caacccgagc tacgacgccg gccggcaacg 2280
catgctgttt acgcgcaacg gtgacatctt cctgcgcgat ctgcgctccg gggcgctgac 2340
ccagctgacc cgcagcaacg aggtcgaatc gcgcccgcaa tttgccagcg atggcggtgc 2400
gatctggcgc gcgggcaaca actggtacca ctggcgtgcc gatggcggta ccgcgcaggt 2460
ggcagtggtg aaggccgagc gcgatcccaa cgccgcgccc aaggccgatg tgctgcgcga 2520
gcagcaactg gccaccctgg ccaccttgcg ccgcgaccgc gagcaacgcg aggcgctgcg 2580
cacccaggac gatgcctggc gccgcgccga cagcacccgc gcaccggcac cggtgtatct 2640
gggcgatgag gt 2652

Claims (7)

1.野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris），其特征在于，在野油菜黄单胞菌中敲除pigA基因、添加vgb基因，并含有核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示的核苷酸分子。
2.野油菜黄单胞菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：扩增获得pigA上下游同源臂基因，从pBBR-vgb质粒上扩增获得vgb基因，通过overlap PCR将pigA基因的上下游同源臂及vgb基因连接，获得重组片段；所述重组片段为pigA上游同源臂-vgb基因-pigA下游同源臂；向pLO3质粒的多克隆位点处插入重组片段，构建获得pigA基因敲除及添加vgb基因的重组质粒pLO3-vgb；
所述vgb基因和所述pigA基因如权利要求1所示；
步骤2：将所述重组质粒pLO3-vgb转化至E. coliS17菌株，获得正确的转化子，得到重组菌株E. coliS17/pLO3-vgb；
步骤3：将所述重组菌株E. coliS17/pLO3-vgb接合转移至野生型野油菜黄单胞菌，Cmr、tetr双抗平板筛选单交换菌株，蔗糖致死筛选获得双交换重组子—pigA基因敲除及添加vgb基因的△pigA/vgb菌株。
3.根据权利要求2所述的构建方法获得的野油菜黄单胞菌。
4.根据权利要求1或3所述的野油菜黄单胞菌，其特征在于，其拉丁名为Xanthomonas campestris，保藏编号为CGMCC No.14771。
5.根据权利要求1、3或4所述的野油菜黄单胞菌在生产白色黄原胶中的应用。
6.一种生产白色黄原胶的方法，其特征在于，将如权利要求1、3或4所述的野油菜黄单胞菌接种于培养基中发酵培养，收集发酵液。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：挑取如权利要求1、3或4所述的野油菜黄单胞菌单菌落接种到种子培养基，于200rpm、30℃培养20h，获得一级种子培养液；
步骤2：将所述一级种子培养液以1%体积百分比的接种量接种到种子培养基中，于200rpm、30℃培养20h，获得二级种子培养液；
步骤3：将所述二级种子培养液以以10%体积百分比的接种量接种到种子培养基中，于230rpm、28℃培养72h，收集发酵液。
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