KR101054886B1 - 잔탄검 생합성 관련 돌연변이 유전자와 이를 포함하는잔탄검 생합성 균주 및 돌연변이 균주를 이용한 잔탄검의제조방법 - Google Patents

잔탄검 생합성 관련 돌연변이 유전자와 이를 포함하는잔탄검 생합성 균주 및 돌연변이 균주를 이용한 잔탄검의제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 잔탄검 (xanthan gum) 생합성 관련 돌연변이 유전자, 그의 염기서열, 상기 돌연변이 유전자를 포함하는 잔탄검 생합성 균주 및 그들의 제조방법 그리고 상기 돌연변이 균주를 이용한 잔탄검의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 본 발명은 벼의 흰잎마름병을 유발하는 잔토모나스 오리자이 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae) 균주로부터 유래한 돌연변이 wxoD 유전자 및 그의 염기서열, 상기 돌연변이 wxoD 유전자를 포함하여 잔탄검을 대량 생산할 수 있는 잔토모나스 속 돌연변이 균주, 그의 제조방법 및 이에 사용되는 프라이머 서열들 그리고 상기 돌연변이 균주를 이용한 잔탄검의 대량 생산방법에 관한 것이다.
본 발명의 돌연변이 잔토모나스 오리자이 균주는 야생형 균주보다 잔탄검의 생산을 2배 이상 증진시킬 수 있는 국내 고유의 균주로서, 잔탄검을 대량 생산하는 원천기술로서 낮은 생산 원가로 높은 수입대체 효과를 기대할 수 있어 산업적으로 널리 사용될 수 있다.
잔탄검 (xanthan gum) 생합성, 돌연변이 유전자 wxoD, 잔토모나스 오리자이 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae) 돌연변이 균주, 잔탄검의 생산방법,

Description

잔탄검 생합성 관련 돌연변이 유전자와 이를 포함하는 잔탄검 생합성 균주 및 돌연변이 균주를 이용한 잔탄검의 제조방법{Mutant wxoD gene, its nucleotide sequence, mutant strain increasing biosynthesis of xanthan gum, method for preparing the same and process for producing xanthan gum by using the same}
본 발명은 잔탄검 (xanthan gum) 생합성 관련 돌연변이 유전자, 그의 염기서열, 상기 돌연변이 유전자를 포함하는 잔탄검 생합성 균주 및 그들의 제조방법 그리고 상기 돌연변이 균주를 이용한 잔탐검의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 본 발명은 벼의 흰잎마름병을 유발하는 잔토모나스 오리자이 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae) 균주로부터 유래한 돌연변이 wxoD 유전자 및 그의 염기서열, 상기 돌연변이 wxoD 유전자를 포함하여 잔탄검을 대량 생산할 수 있는 잔토모나스 속 돌연변이 균주, 그의 제조방법 및 이에 사용되는 프라이머 서열들 그리고 상기 돌연변이 균주로 잔탄검을 대량으로 얻는 생산방법에 관한 것이다.
1940년대 미국의 바바라 맥클린톡 (Barbara McClintock)은 트랜스포존 (transposon)이 여러 종류의 유전자들의 돌연변이를 유발하는 것을 처음으로 밝혔다. 이후 분자생물학이 발전하면서 트랜스포존은 여러 생물체에 대해 인위적인 돌연변이를 유발시키는 과정에 이용되어 왔다. 구체적으로, 이러한 트랜스포존의 작용 기작에 착안하여 이미 돌연변이 유발 키트가 개발되어 상용화되었다. 실제로 미국 에피센터 사 (Epicentre)의 트랜스포존 키트 (EZ::TNTM <KAN-2> Tnp TransposomeTM Kit)는 본 발명자들도 잔토모나스 오리자이 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae) 균주의 돌연변이 유발에 사용하였다.
현재 산업적으로 많이 이용되고 있는 잔탄검 (xanthan gum)은 미국에서 1964년 세계에서 처음으로 상용화시킨 이래 현재까지 최대공급자로서 세계시장을 선도하고 있다. 잔탄검은 천연점증제의 일종으로서, 지금까지는 양배추의 엽소병 원인균인 잔토모나스 캄페스트리스 (Xanthomonas campestris) 균주를 사용하여 탄수화물을 순수 배양 및 발효하고 고분자 다당류검 물질을 이소프로필알콜을 첨가하여 정제· 건조 및 분쇄하여 생산되었다. 이와 같은 잔탄검은 포도당, 만노스 및 글루크론산의 나트륨, 칼륨 및 칼슘염 등의 혼합물로 구성되고, 소스, 드레싱, 시럽, 주스, 음료, 두유, 유제품, 요구르트, 푸딩, 휘핑크림, 아이스크림, 빙과류, 제과, 제빵, 베이커리 필링, 냉동식품, 레토르트식품 등을 포함한 식품, 시럽, 현탁액, 정제류 등을 포함하는 제약 제품 그리고 치약, 샴푸, 화장품 등을 포함하는 생활용품 등에 광범위하게 사용되고 있다.
이와 같이 산업적으로 유용한 잔탄검에 대하여 국내외적으로 많은 연구들이 이루어지고 산업적 개발도 진행되어 많은 특허출원도 이루어졌다. 구체적으로, 1992년 대만에서는 야생형 잔토모나스 캄페스트리스 균주에 xps 유전자를 클로닝하여 잔탄의 생산을 증가시킨 바 있었고, 또한 1991년에 아르헨티나에서 잔탄검의 생산 연구가 이루어졌으며, 2000년 스페인에서도 잔탄검의 생산, 회수 및 특성 연구가 진행되었다. 또한, 2003년 인도에서 다양한 기질 최적화를 이용한 잔탄검의 발효 과정을 연구하여 그 생산성을 향상시킨 것을 보고하였다.
이외에도, 미국에서 유기산을 이용하여 잔탄검을 발효 과정으로 생산하는 방법을 개발하여 특허출원한 바 있었다 (USP 4245046 참조). 또한, 잔탐검의 생산에 잔토모나스 캄페스트리스 균주를 사용하였고, 다양한 발효방법도 중국 등지에서 개발된 바 있었다 (USP 5279961; CP1539987 참조). 또한, 배지 조성을 조절하여 잔탐검을 생산하는 돌연변이 잔토모나스 캄페스트리스 균주를 개발하여 보고한 바도 있었다 (EP0481785 참조).
실제로 잔탄검을 세계에서 가장 많이 생산하는 회사는 미국의 CP 켈코사이고 그 다음이 데니스코 티앙구안 (Danisco Tianguan)사인데, 연간 2,000만톤 정도를 생산하고 있다. 이러한 잔탄검의 세계시장 규모는 2004년 현재 약 3,000억원 (€230백만)정도이고, 연 소비량은 4,000 내지 5,000 만 톤 정도이며 이 중 약 60% 정도가 의료 및 식품과 관련된 시장에서 그 소비가 이루어지고 있다. 또한 해마다 약 5%씩 소비시장도 증가하고 있는 실정이다.
이와 같이, 현재 국내외적으로 잔탄검 (xanthan gum) 생산 및 생산 증대를 위한 연구 개발의 대상은 잔토모나스 캄페스트리스 (Xanthomonas campestris) 균주 에 국한되어 있고 또한 잔탄검 생산의 효율을 높이기 위한 방법도 배양 조건 (배양 배지 및 온도 등) 및 발효 조건 등과 같은 생산 공정을 달리하는 방법에 국한되어 있었다. 한편 유전공학적 방법에 의해 잔탄검과 같은 유용 대사 물질의 생성을 증가시키기 위하여 벼흰잎마름 병원균 등을 돌연변이화 하려는 시도는 전무한 상태이다.
이에 본 발명자들은 보다 효과적으로 잔탄검을 대량 생산하는 방법을 개발하기 위하여 노력을 계속한 결과, 세계 최초로 국내 고유의 잔토모나스 오리자이 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae) 균주 KACC 10331를 트랜스포존 키트를 이용하여 형질전환시키는 과정으로 잔탄검 생합성과 관련된 wxoD 유전자를 돌연변이화 하고 상기 유전자에 특이적인 프라이머 서열들을 이용하여 그 염기서열을 분석한 다음 상기 돌연변이 균주가 잔탄검의 생합성을 2배 이상 증가시킨 점을 확인함으로써, 본 발명을 성공적으로 완성하였다.
본 발명은 돌연변이 wxoD 유전자, 그의 염기서열 및 그의 제조방법, 잔탄검을 대량 생산할 수 있는 잔토모나스 속 (Xanthomonas sp.) 돌연변이 균주, 그의 제조방법 및 이에 사용되는 프라이머 서열 그리고 상기 돌연변이 균주로 잔탄검을 대량으로 얻는 생산방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 잔탄검 생합성 (xanthan gum biosynthesis)과 관련된 잔토모나스 오리자이 (Xanthomonas oryzae) 균주로부터 유래한 돌연변이 wxoD 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 트랜스포존 (transposon)을 삽입하여 돌연변이화를 유도하는 과정으로, 돌연변이 유전자 wxoD 를 얻는 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 돌연변이 wxoD 유전자를 포함하여 잔탄검을 대량 생산할 수 있는 잔토모나스 속 (Xanthomonas sp .) 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 잔토모나스 속 균주에 트랜스포존을 첨가하여 형질전환시키고; (2) 특정 프라이머를 이용하여 돌연변이 wxoD 유전자를 검색하고; 및 (3) 이로부터 얻은 돌연변이 균주에서 잔탄검의 생합성량을 측정하여 선별하는; 과정으로 이루어진 제 6항의 잔토모나스 속 (Xanthomonas sp.) 균주의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 잔토모나스 속 균주를 배양 및 발효하여 잔탄검을 대량으로 얻는 생산방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 잔탄검 생합성 (xanthan gum biosynthesis)과 관련된 잔토모나스 속 (Xanthomonas sp.) 균주로부터 유래한 돌연변이 wxoD 유전자를 제공한다.
상기 잔토모나스 속 균주는 잔토모나스 오리자이 (Xanthomonas oryzae) 균주인 것이 바람직하고, 국내 고유의 잔토모나스 오리자이 pv 오리자이 KACC 10331 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae KACC 10331)인 것은 더욱 바람직하다.
상기 돌연변이 유전자 wxoD는 트랜스포존 (transposon)을 삽입하여 돌연변이시킨 것을 포함하고, 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 돌연변이 유전자 wxoD를 포함한다.
또한, 본 발명은 트랜스포존을 삽입하여 돌연변이화를 유도하는 과정으로 이루어진 돌연변이 유전자 wxoD 를 얻는 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 돌연변이 wxoD 유전자를 포함하여 잔탄검을 대량 생산할 수 있는 잔토모나스 속 (Xanthomonas sp .) 균주를 제공한다.
상기 잔토모나스 속 균주는 돌연변이 wxoD 유전자를 포함하는 잔토모나스 오리자이 균주인 것이 바람직하고, 국내 고유의 잔토모나스 오리자이 pv 오리자이 KACC 10331 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae KACC 10331) 균주 (수탁번호:KACC91351P)인 것은 더욱 바람직하다.
본 발명의 잔토모나스 오리자이 균주는 2008년 2월 5일자로 농업생명공학연구원에 기탁하였다.
또한, 본 발명은 (1) 잔토모나스 속 균주에 트랜스포존을 첨가하여 형질전환시키고; (2) 특정 프라이머를 이용하여 돌연변이 wxoD 유전자를 검색하고; 및 (3) 이로부터 얻은 돌연변이 균주에서 잔탄검의 생합성량을 측정하여 선별하는; 과정으로 이루어진 잔탄검 생합성이 증진된 잔토모나스 속 (Xanthomonas sp .) 균주의 제조방법을 제공한다.
상기 (1) 과정에서 상기 잔토모나스 속 균주는 잔토모나스 오리자이 pv 오리 자이 KACC 10331 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae KACC 10331) 균주를 사용하는 것이 바람직하고, 상기 트랜스포존은 트랜스포존 키트를 사용한 전기충격법 (electroporation)으로 형질전환시키는 것이 바람직하다.
또한, 상기 (2) 과정에서 상기 프라이머는 서열번호 2 내지 4의 염기서열을 포함하는 프라이머들 중에서 선택되는 것이 바람직하고, 이 과정에 모든 유전자 서열분석 방법들이 사용될 수 있고 중합효소 연쇄반응(PCR)을 사용하는 것도 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 잔토모나스 속 균주를 배양 및 발효하여 잔탄검을 대량으로 얻는 생산방법을 제공한다. 상기 잔토모나스 속 균주는 상기 돌연변이 wxoD 유전자를 포함하는 잔토모나스 오리자이 pv 오리자이 KACC 10331 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae KACC 10331) 균주를 사용하는 것이 바람직하다 (수탁번호:KACC91351P).
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 벼의 흰잎마름병을 유발하는 잔토모나스 오리자이 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae) 균주로부터 유래한 돌연변이 wxoD 유전자 및 그의 염기서열, 상기 돌연변이 wxoD 유전자를 발현하여 잔탄검을 대량 생산할 수 있는 잔토모나스 속 돌연변이 균주, 그의 제조방법 및 이에 사용되는 프라이머 서열들 그리고 상기 돌연변이 균주를 이용한 잔탄검의 대량 생산방법에 관한 것이다.
본 발명에서 개발한 돌연변이 균주는 국내 고유의 잔토모나스 오리자이(Xanthomonas oryzae pv. oryzae KACC10331) 균주로부터 유래한 것으로서, 시간적 및 경제적 한계를 뛰어넘어 보다 많은 2배 이상의 잔탄검을 생산할 수 있다. 또한, 본 발명의 균주는 새로운 기술 등과 같은 여러 복잡한 조작 등이 추가로 수행하지 않고 기존의 동일한 배양조건에서 기존의 생산 설비 및 기술을 지속적으로 발효 생산에 이용할 수 있는 장점이 있다. 이외에도, 국내 고유 균주에서 대량 생산이 가능한 원천기술을 확보하여 수입에 의존하고 있는 상황을 극복하고 수입 대체 효과 및 보다 낮은 생산원가를 실현하여 산업적으로 널리 이용될 수 있다.
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다. 하기의 실시예들에서 특별히 언급되지 아니한 분자생물학적 실험기법들은 샘브룩 (Sambrook) 등의 분자 클로닝 매뉴얼 {Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, second edition, 1989}을 참조하였다.
실시예 1. 잔토모나스 오리자이 ( Xanthomonas oryzae pv . oryzae ) 균주의 형질전환 I
본 발명에서 세포 형질전환에 사용되는 잔토모나스 오리자이 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae) 균주를 제작하기 위하여, 한국농업미생물자원센터 (KACC, 농촌진흥청, 미생물 유전과)로부터잔토모나스 오리자이 KACC 10331 균주를 분양받고 5ml의 영양배지 (Nutrient broth; 비프 추출물 3g/L, 펩톤 5g/L)에 접종한 다음 28℃ 진탕배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 3ml의 배양세포를 원심분리기를 이용하여 12,000 rpm으로 4℃에서 5분간 원심분리하고 배양세포를 수집하였다. 수집된 세포를 100 ul의 10% 글리세롤 용액으로 현탁하고 다시 상기의 조건으로 원심분리를 실시하였다. 상기의 세포 수집 및 현탁 과정을 총 3회 반복 실시하고 형질전환을 수행하기 전까지 얼음에 보존하였다.
실시예 2. 잔토모나스 오리자이 균주의 형질전환 II
본 발명에서는 상기 실시예 1에 따라 준비된 잔토모나스 오리자이 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae) 균주를 전기충격법으로 형질전환시키기 위하여, 상기 세포 50 ul를 취하여 1.5ml 에펜도르프 튜브 (eppendorf tube)에 옮기고 에피센터사 (Epicentre, WI, USA)에서 구입한 트랜스포존 키트를 사용하여 (EZ::TNTM <KAN-2> Tnp Transposome) 트랜스포존 1 ul과 혼합하였다. 혼합된 세포/트랜스포존 (cell/transposon) 용액을 전기충격용 0.2 cm 큐벳 (BioRad사, CA, USA)에 옮기고 전기충격기 (Gene Pulser Xcell; BioRad사, CA, USA)를 이용하여 2.5kV, 200Ω, 25uFa의 조건 하에서 형질전환을 유도하였다. 형질전환된 세포를 신속히 1 ml의 SOC 배지(2.0 % 트립톤, 0.5 % 이스트 추출물, 0.05 % NaCl, and 20 mM 포도당)와 혼합하여 28℃ 진탕배양기에서 4시간 동안 배양하였다. 배양 후 카나마이신 (kanamycin) 항생제가 10 ug/ml의 농도로 함유된 영양배지 (Nutrient agar 배지; 비프 추출물 3g/L, 펩톤 5g/L, 아가 15g/L)에 도말하여 28℃ 항온기에 3 내지 4일 동안 배양하고 자라난 균총을 멸균된 이쑤시게를 이용하여 150 ul의 영양 배지 (비프 추출물 3g/L, 펩톤 5g/L)가 들어있는 96-웰 플레이트에 접종하여 28℃ 항온기에서 다시 24시간 동안 배양하였다.
실시예 3. 잔토모나스 오리자이 균주로부터 유래한 wxoD 유전자의 돌연변이 분석
본 발명에서는 상기 wxoD 유전자 내에 트랜스포존의 삽입 여부를 확인하기 위해 야생형 (wild-type)의 잔토모나스 오리자이 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae)와 돌연변이 wxoD 유전자를 포함하는 잔토모나스 오리자이 균주로부터 게놈 DNA (genomic DNA)를 각각 추출하고 각각의 게놈 DNA 50 ng씩을 PCR 분석에 사용하였다.
우선 wxoD 유전자 부위를 중합효소 연쇄반응 (PCR)으로 증폭시키기 위하여, 서열번호 2의 wxoDF 프라이머 (5‘-GTGCTGGTGAGCCATCATTT-3’)와 서열번호 3의 wxoDR 프라이머 (5‘-TTACTCACCGGCCATAATCC-3’)를 각각 10 pmol 첨가하여 반응을 실시하였다. 상기 PCR을 위한 반응액은 10x Taq 폴리머라제 완충용액 (polymerase buffer), 250 μM MgCl2, 100 μM dNTP, 1 unit Taq 폴리머라제를 총 50㎕가 되도록 혼합하였다. PCR 반응은 94℃에서 2분 동안 반응시키고, 다음으로 94℃에서 30초, 60℃에서 30초 및 72℃에서 1분 동안 총 30 사이클로 증폭시킨 후, 72℃에서 5분 동안 연장 단계를 수행하였다. 그 결과 예상대로 1,053bp 위치에서 유전자가 증폭되었다 (도 1 참조).
또한 돌연변이 wxoD 유전자를 포함하는 잔토모나스 오리자이 균주(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)의 게놈 DNA를 50ng 사용하고 서열번호 4의 KANF 프라이머 (5‘-CTCGATGAGTTTTTCTAATCAGAAT-3’) 10pmol을 첨가하여 TAIL (Thermal asymmetric Interlaced) PCR 을 수행하였다. 상기 PCR을 위한 반응액은 10x Taq 폴리머라제 완충용액, 250μM MgCl2, 100μM dNTP, 1unit Taq 폴리머라제를 총 50㎕가 되도록 혼합하였다. PCR 반응은 94℃에서 5분 동안 반응시키고, 다음으로 94℃에서 30초, 60℃에서 30초 및 72℃에서 1분 동안 총 30 사이클, 94℃에서 30초, 30℃에서 30초 및 72℃에서 1분 동안 총 10 사이클로, 94℃에서 15초, 60℃에서 15초 및 72℃에서 30초 동안 총 25 사이클로 증폭시킨 후, 72℃에서 5분 동안 연장 단계를 수행하였다. 이 후 5ul의 증폭산물과 10pmol의 KANF-1 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하고 ABI 3100 유전분석기 (Genetic Analyzer; PE Applied Biosystems)로 염기서열분석을 실시하여 트랜스포존의 삽입 위치를 확인하였다 (도 2 참조).
실시예 4. 잔탄검의 정량 분석
본 발명에서는 야생형 잔토모나스 오리자이 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae) 균주 및 돌연변이 wxoD 유전자를 포함하는 잔토모나스 오리자이 균주를 각각 PSA 배지 (펩톤 10g/L, 슈크로스 10g/L, 모노소듐 글루타메이트 1g/L, 아가 20g/L)에 도말하여 28℃ 항온기에 3 내지 4일 동안 배양한 후 (도 3 참조) 각 균주의 농도가 0.35 OD550가 되도록 조정하여 5ml의 XOL 액체배지 K2HPO4 0.7g/L, KH2PO4 .2g/L, (NH4)2PO4/L, FeSO4 0.01g/L, MnCl2 0.001g/L, MgCl2 0.1g/L, 트립톤 1.25g/L, 효모 추출물 1.25g/L, 포도당 4g/L)에 접종하고 28℃ 진탕배양기에서 72시간 동안 본 배양하였다. 배양된 각 균주를 0.5ml 씩 취하고 원심분리기를 이용하여 12,000rpm으로 4℃하에서 5분간 원심분리하여 배양세포를 제외한 배양여액을 0.3ml 씩을 취하였다. 각각의 0.3ml의 배양여액에 1.65ml의 멸균증류수와 0.05ml의 80% 페놀을 첨가하여 교반기를 이용하여 혼합하고 신속히 5ml의 진한 황산을 첨가하였다. 혼합액을 실온에서 20분간 정치하고 OD490 하에서 흡광도를 측정하여 야생형 및 돌연변이 균주들의 잔탄검 (xanthan gum) 생합성량을 조사하였다 (표 1 참조). 상기의 실험은 동일한 조건으로 총 3회씩 반복 실시하였다. 측정된 각 균주의 잔탄검 (xanthan gum) 생합성량은 도 4에 나타내었다.
균주 흡광도(OD490nm)
1회 2회 3회 평균값
X. o. KACC 10331 (WT) 1.243 1.205 1.193 1.214
X. o. KACC 10331 (wxoD mutant) 2.565 2.554 2.461 2.527

[서열목록]
[서열번호 1]
5'-ATGGCTCAGTCTGAGTTGGCTCACCGCAGTAATAATTTTGATTTTATTCGCATTGTTGCCGCTACCAGCGTGCTGGTGAGCCATCATTTTGCTTTGGCCAAGCTGCCAGAACCACTGGTACTTCAATTCCAGACCTTGGGTGGTTATGGGGTCTTTATTTTCTTTTCGATTAGTGGTTTTTTAGTTGCGCAGAGTTGGCAGCGTGATCCTAGTCTTGTCCGTTTCACTTATCGGCGATTGCTTCGTATCTGGCCGGGTATGCTTTGCGTCCTTATTTTGTGTGCATTTTTACTCGGGCCAGCTGTTACGACGCTTTCTCTTAAGGAATACTTCTTAAATGAGTTAACTTGGACTTATTTCAAAACCATGCTGTTTCAAGTGCAGCCATTTTTGCAAGGTGTGTTTCCAGATAGTGCGGTTCCTTATATTCCCAACGGGGTGCTTTGGACTATTCCAATAGAGGTGCATTGCTATGGCTACCTCGCCATTCTAGGAGTAATTGGTGTATTGCGCTGGCGCTGGGTGCTTCTAGCTGCCACGGCAGCCTTAGCTGTTTATTACTATGGCTATCATGACGCTGAAAATGTATTCCGGGCTGGTGGTGGAAGAGTACATGAAATAGAATTCGCCACTTTCTTCTTCTCTGGTGTTCTCTTGCACTACTTTCGCGAGATATGGTCGAGTTGGAATCGAATTATTCCAAGTTTTTTGGTGGTTATGACAGCATTTTTGCTGCTTTTTCAAAACGACCATCAGTTGATCGCGGTCTTCTTGTTTACGCCTTTCTTCTTTGTAGTCTTGGGGAACTTGTCTTTTCCAATTATGAGAAGATTCGGCCGCTTCGGTGACATGTCCTACGGTATTTACATTTATGCTTTCCCAGTGCAGCAAACTCTATTTTGGCTTTGGGGTGAAAGTATTTCGTTTAATACAAGCCTCGCGCTAGCACTCACGATTACTGGGCTATTGGCCTGGATTTCTTGGCATCTTATCGAGCAGCCTGCCTTGCGGCTAAAGCCACGTACTCCAAAAAGGATTATGGCCGGTGAGTAA-3'
[서열번호 2]
5'-GTGCTGGTGAGCCATCATTT-3'
[서열번호 3]
5'-TTACTCACCGGCCATAATCC-3'
[서열번호 4]
5'-CTCGATGAGTTTTTCTAATCAGAAT-3'
도 1은 야생형 잔토모나스 오리자이 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae) KACC10331 균주 및 돌연변이 wxoD 유전자를 발현하는 잔토모나스 오리자이 균주에서 각각 잔탄검 생합성 관련 wxoD 유전자를 PCR로 증폭하여 확인한 사진을 나타낸 것이다. M: 마커.
도 2는 본 발명의 돌연변이 wxoD 유전자 내 트랜스포존 (transposon)의 삽입 위치를 모식적으로 나타낸 것이다. ATG: 유전자 전사개시 코돈; TAA: 유전자 전사종결 코돈.
도 3은 야생형 잔토모나스 오리자이 KACC10331 균주 및 돌연변이 wxoD 유전자를 발현하는 잔토모나스 오리자이 KACC10331 균주를 각각 배양한 사진을 나타낸 것이다.
도 4는 야생형 잔토모나스 오리자이 KACC10331 균주 및 돌연변이 wxoD 유전자를 발현하는 잔토모나스 오리자이 KACC10331 균주에서 각각 잔탄검 (xanthan gum)의 생합성량을 조사하여 나타낸 것이다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Mutant wxoD gene, its nucleotide sequence, mutant strain increasing biosynthesis of xanthan gum, method for preparing the same and process for producing xanthan gum by using the same <130> 2008-69318 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1053 <212> DNA <213> Xanthomonas oryzae <400> 1 atggctcagt ctgagttggc tcaccgcagt aataattttg attttattcg cattgttgcc 60 gctaccagcg tgctggtgag ccatcatttt gctttggcca agctgccaga accactggta 120 cttcaattcc agaccttggg tggttatggg gtctttattt tcttttcgat tagtggtttt 180 ttagttgcgc agagttggca gcgtgatcct agtcttgtcc gtttcactta tcggcgattg 240 cttcgtatct ggccgggtat gctttgcgtc cttattttgt gtgcattttt actcgggcca 300 gctgttacga cgctttctct taaggaatac ttcttaaatg agttaacttg gacttatttc 360 aaaaccatgc tgtttcaagt gcagccattt ttgcaaggtg tgtttccaga tagtgcggtt 420 ccttatattc ccaacggggt gctttggact attccaatag aggtgcattg ctatggctac 480 ctcgccattc taggagtaat tggtgtattg cgctggcgct gggtgcttct agctgccacg 540 gcagccttag ctgtttatta ctatggctat catgacgctg aaaatgtatt ccgggctggt 600 ggtggaagag tacatgaaat agaattcgcc actttcttct tctctggtgt tctcttgcac 660 tactttcgcg agatatggtc gagttggaat cgaattattc caagtttttt ggtggttatg 720 acagcatttt tgctgctttt tcaaaacgac catcagttga tcgcggtctt cttgtttacg 780 cctttcttct ttgtagtctt ggggaacttg tcttttccaa ttatgagaag attcggccgc 840 ttcggtgaca tgtcctacgg tatttacatt tatgctttcc cagtgcagca aactctattt 900 tggctttggg gtgaaagtat ttcgtttaat acaagcctcg cgctagcact cacgattact 960 gggctattgg cctggatttc ttggcatctt atcgagcagc ctgccttgcg gctaaagcca 1020 cgtactccaa aaaggattat ggccggtgag taa 1053 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Xanthomonas oryzae <400> 2 gtgctggtga gccatcattt 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Xanthomonas oryzae <400> 3 ttactcaccg gccataatcc 20 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Xanthomonas oryzae <400> 4 ctcgatgagt ttttctaatc agaat 25

Claims (12)

  1. 잔탄검 생합성 (xanthan gum biosynthesis)과 관련된 잔토모나스 오리자이 (Xanthomonas oryzae) 균주로부터 유래한 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 돌연변이 wxoD 유전자.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 잔토모나스 오리자이 균주는 국내 고유의 잔토모나스 오리자이 pv 오리자이 KACC 10331 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae KACC 10331) 균주인 것을 특징으로 하는 돌연변이 wxoD 유전자.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 돌연변이 유전자 wxoD는 트랜스포존 (transposon)이 삽입되어 돌연변이 된 것을 특징으로 하는 돌연변이 wxoD 유전자.
  4. 삭제
  5. 트랜스포존 (transposon)을 삽입하여 돌연변이화를 유도하는 과정으로, 제 1항의 돌연변이 유전자 wxoD 를 제조하는 방법.
  6. 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 돌연변이 wxoD 유전자를 포함하여 잔탄검을 대량 생산할 수 있는 잔토모나스 속 (Xanthomonas sp.) 균주 (수탁번호: KACC91351P).
  7. (1) 잔토모나스 속 균주에 트랜스포존을 첨가하여 형질전환시키고; (2) 특정 프라이머를 이용하여 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 돌연변이 wxoD 유전자를 검색하고; 및 (3) 이로부터 얻은 돌연변이 균주에서 잔탄검의 생합성량을 측정하여 선별하는; 과정으로 이루어진 제 6항의 잔토모나스 속 (Xanthomonas sp.) 균주의 제조방법.』
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 (1) 과정에서 상기 잔토모나스 속 균주는 잔토모나스 오리자이 pv 오리자이 KACC 10331 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae KACC 10331) 균주인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  9. 제 7항 또는 제 8항에 있어서,
    상기 (1) 과정에서 트랜스포존 키트를 사용한 전기충격법 (electroporation)으로 형질전환시키는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  10. 제 7항에 있어서,
    상기 (2) 과정에서 상기 프라이머는 서열번호 2 내지 4의 염기서열을 포함하는 프라이머들 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  11. 제 6항의 잔토모나스 속 균주를 배양 및 발효하여 잔탄검을 대량으로 얻는 생산방법.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 잔토모나스 속 균주는 제 1항의 돌연변이 wxoD 유전자를 포함하는 잔토모나스 오리자이 pv 오리자이 KACC 10331 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae KACC 10331) 균주 (수탁번호: KACC91351P)인 것을 특징으로 하는 생산방법.
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